Schnelle Bestimmung der Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie

Summary

Wir beschreiben einen einmolekularen Ansatz für Antigen-Antikörper-Affinitätsmessungen mit Massenphotometrie (MP). Das MP-basierte Protokoll ist schnell, genau, verwendet eine sehr geringe Menge an Material und erfordert keine Proteinmodifikation.

Abstract

Messungen der Spezifität und Affinität von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen sind für medizinische und forschungsmedizinische Anwendungen von entscheidender Bedeutung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Implementierung einer neuen Einzelmolekültechnik, der Massenphotometrie (MP), zu diesem Zweck. MP ist eine etiketten- und immobilisierungsfreie Technik, die molekulare Massen und Populationen von Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen auf einer Einmolekülebene erkennt und quantifiziert. MP analysiert die Antigen-Antikörper-Probe innerhalb von Minuten, um die Bindungsaffinität präzise zu bestimmen und gleichzeitig Informationen über die Stoichiometrie und den oligomeren Zustand der Proteine bereitzustellen. Dies ist eine einfache und einfache Technik, die nur Picomol-Mengen an Protein und keine teuren Verbrauchsmaterialien erfordert. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um die Protein-Protein-Bindung für Proteine mit einer Molekularmasse von mehr als 50 kDa zu untersuchen. Bei multivalenten Proteinwechselwirkungen können die Affinitäten mehrerer Bindungsstellen in einer einzigen Messung ermittelt werden. Die einmolekulare Messart und die fehlende Etikettierung setzen jedoch einige experimentelle Einschränkungen mit sich. Diese Methode liefert die besten Ergebnisse, wenn sie auf Messungen von submikromolaren Wechselwirkungsaffinitäten, Antigenen mit einer Molekularmasse von 20 kDa oder größer und relativ reinen Proteinproben angewendet wird. Wir beschreiben auch das Verfahren zur Durchführung der erforderlichen Anpassungs- und Berechnungsschritte mit einer Basisdatenanalysesoftware.

Introduction

Antikörper sind zu allgegenwärtigen Werkzeugen der Molekularbiologie geworden und werden sowohl in medizinischen als auch in Forschungsanwendungen ausgiebig eingesetzt. In der Medizin sind sie in der Diagnostik von entscheidender Bedeutung, aber auch ihre therapeutischen Anwendungen werden erweitert und neue Antikörper-basierte Therapien werden ständig entwickelt^1,2,3,4. Die wissenschaftlichen Anwendungen von Antikörpern umfassen viele unverzichtbare Labortechniken wie Immunfluoreszenz⁵, Immunpräzipitation⁶, Durchflusszytometrie⁷, ELISA und Western Blotting. Für jede dieser Anwendungen ist es von entscheidender Bedeutung, genaue Messungen der Bindungseigenschaften des Antikörpers, einschließlich Bindungsaffinität und Spezifität, zu erhalten.

Seit der Einführung des ersten kommerziellen Oberflächen-Plasmonresonanz-Instruments (SPR) im Jahr 1990 sind optische Biosensoren zum “Goldstandard” der Antikörpercharakterisierung geworden, aber auch andere Techniken, einschließlich ELISA, werden routinemäßig zur Messung von Antikörperaffinitäten^8,9verwendet. Diese Methoden erfordern in der Regel eine Immobilisierung oder Kennzeichnung der analysierten Moleküle, was die Interaktion von Interesse potenziell beeinflussen kann. Sie sind auch relativ langsam und beinhalten mehrere Assay-Schritte, bevor die Ergebnisse für die Datenanalyse gesammelt werden können. Eine kürzlich entwickelte Einzelmolekülmethode, die Massenphotometrie (MP), erkennt Moleküle direkt in Lösung, wenn sie auf der Oberfläche des Mikroskopdeckels^{landen 10,11}. Die lichtstreuende optische Detektion, die MP verwendet, erfordert keine Proteinkennzeichnung oder -modifikation. Einzelne Proteinmoleküle werden vom interferometrischen Streumikroskop als dunkle Flecken im Bild aufgezeichnet (Abbildung 1D), und mehrere tausend Moleküle können während der einminütigen Datenerfassung¹²nachgewiesen werden. Das von jedem einzelnen Teilchen erzeugte Signal wird quantifiziert, und sein Kontrastwert (relative Dunkelheit) wird berechnet. Die interferometrischen Kontrastwerte sind proportional zu den Molekularmassen der Proteine, was die Identifizierung gebundener und freier Arten in der Antigen-Antikörper-Mischung ermöglicht. Gleichzeitig misst MP durch zählende molekulare Landeereignisse direkt die Artenpopulationen. Dies gibt MP-basierten Methoden eine einzigartige Fähigkeit, Affinitäten mehrerer Bindungssites unabhängig zu quantifizieren.

Die Bindung der Antigenmoleküle (Ag) an die beiden Bindungsstellen des intakten Antikörpers (Ab) kann wie folgt beschrieben werden:

mit den Gleichgewichtsassoziationskonstanten K_a1 und K_a2 definiert als:

wobei c_i und f_i die Konzentration und den Anteil der Komponente idarstellen. Die Gesamtantigenkonzentration (c_Ag)_tot kann wie:

Da die Gesamtkonzentrationen des Antikörpers (c_Ab)_tot und antigen (c_Ag)_tot bekannt sind, kann diese Gleichung verwendet werden, um die experimentellen Bauteilfraktionen, die aus den MP-Messungen gewonnen wurden, direkt anzupassen und die Gleichgewichtsassoziationskonstanten K_a1 und K_a2 zu berechnen (siehe Ergänzende Informationen).

Die MP-Daten können auch verwendet werden, um die Kooperative zwischen den beiden Antikörperbindungsstellen¹¹zu schätzen. Bei zwei Antikörperparatopen mit identischen mikroskopischen Bindungskonstanten sind die statistischen Faktoren, die den Prozess der Population des Ab– Ag und Ab Ag_2-Komplexe diktieren, dass die scheinbaren makroskopischen Gleichgewichtskonstanten K_a1 und K_a2 nicht numerisch gleich sind und K_a1 = 4K_a2. Daher weisen die experimentellen Werte von K_a1 < 4K_a2 auf eine positive Kooperatoaktivität zwischen den beiden Antikörperbindungsstellen hin. Ebenso weist K_a1 > 4K_a2 auf negative Kooperatonität hin.

MP-Messungen der Antigen-Antikörper-Bindungsaffinität sind schnell und erfordern eine geringe Menge an Material. Die MP-Massenverteilungen, die für Gleichgewichtskonstantenberechnungen verwendet werden, liefern zusätzliche Informationen über die Probeneigenschaften und ermöglichen die Bewertung der Probenreinheit, Oligomerisierung und Aggregation in einem einzigen Experiment. Die gleiche Methode kann verwendet werden, um eine proteinreiche Protein-Protein-Bindung mit hoher Affinität zu messen, und MP ist besonders nützlich für Studien mit multivalenten Proteinwechselwirkungen. Multiproteinkomplexe haben in der Regel große molekulare Massen, optimal für die MP-Erkennung, und Einzelmoleküldaten können verwendet werden, um stoichiometrie zu messen und Affinitäten mehrerer Bindungsstellen gleichzeitig zu berechnen. Diese Informationen sind in der Regel schwierig, mit massenbasierten Methoden zu erhalten.

Ohne Modifikationen eignet sich das aktuelle Protokoll für Messungen von relativ hochaffinen submikromolaren Wechselwirkungen mit Antigenen einer Molekülmasse von 20 kDa oder größer. Für optimale Ergebnisse sollten Proteinvorräte von hoher Reinheit sein, aber es gibt keine spezifischen Pufferanforderungen. Durch die Verwendung von MP kann die Antigen-Antikörper-Bindung in weniger als fünf Minuten beurteilt werden. Die datenerfassung und -analyse, die für genaue K_{d-Berechnungen} erforderlich sind, kann innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden.

Protocol

1. Bereiten Sie die Strömungskammern vor Reinigen Sie die Glasabdeckungen Mit Waschflaschen mit destilliertem Wasser, Ethanol und Isopropanol die 24 mm x 50 mm Abdeckungen in folgender Reihenfolge abspülen: Wasser, Ethanol, Wasser, Isopropanol, Wasser. Trocknen Sie die Abdeckungen mit einem Strom von sauberem Stickstoff. Es ist wichtig, die Abdeckungen von oben nach unten zu spülen, die untere Ecke mit Soft-Tipp-Zange zu halten. Trocknen Sie den Deckelinrutsch in die gleiche Richtung, um eine Kontami…

Representative Results

Wir haben zuvor die Wechselwirkung von humanen α-Thrombin (HT) und Maus monoklonalen anti-humanen Thrombin-Antikörper (AHT) mit dem MP-basierten Assay11untersucht. Da die Molekularmasse des HT (37 kDa) unter der 40 kDa-Nachweisgrenze liegt, kann die maximale Probenkonzentration die Konzentrationsbeschränkung von 50 nM MP überschreiten, ohne die Auflösung von Massenverteilungen negativ zu beeinflussen. Das Experiment war als Titrationsserie mit dem AHT-Antikörper mit einer festen Konzentratio…

Discussion

Das hier beschriebene Mass Photometry-basierte Protokoll bietet eine schnelle und genaue Methode zur Messung von Antigen-Antikörper-Bindungsaffinitäten. Die MP-Analyse verwendet eine sehr geringe Menge an Material, und zusätzliche Informationen – einschließlich Stoichiometrie, Oligomerisierung und Reinheit – können anhand derselben Daten ausgewertet werden (Abbildung 5). Ohne Modifikationen ist diese Methode auf die Messungen von Dissoziationskonstanten im Bereich von ca. 5 nM bis 5…

Materials

AcquireMP	Refeyn		MP data collection software
Anti-human thrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Cotton-tipped applicators	Thorlabs	CTA10	cotton optical swabs for lens cleaning
Coverslips 24×24 mm	Globe Scientific	1405-10
Coverslips 24×50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP data processing software
Forceps	Electron Microscopy Sciences	78080-CF	soft-tipped forceps for coverslips handling
Human α-thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersion oil	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		spreadsheet
OneMP	Refeyn		Mass Photometry instrument
Origin	OriginLab		scientific graphing software
PBS	Corning	46-013-CM	10x stock
Syringe filter	Millipore	SLGSR33SS	buffer and sample filtering