Summary
هنا هو بروتوكول لتصنيع جهاز التصوير spheroid. هذا الجهاز يتيح دينامية أو تصوير الفلورية طولية من الخلايا السرطانية spheroids. كما يقدم البروتوكول إجراء بسيط لمعالجة الصور لتحليل غزو الخلايا السرطانية.
Abstract
غزو الخلايا السرطانية من الورم الأساسي إلى الأنسجة السليمة المجاورة هي خطوة مبكرة في الانبثاث. وتشكل الخلايا السرطانية الغازية تحديا سريريا كبيرا لأنه لا توجد طريقة فعالة للقضاء عليها بمجرد نشرها. قد يؤدي فهم أفضل للآليات التي تنظم غزو الخلايا السرطانية إلى تطوير علاجات قوية جديدة. بسبب التشابه الفسيولوجي للأورام، spheroids جزءا لا يتجزأ من الكولاجين لقد استخدمت على نطاق واسع من قبل الباحثين لدراسة الآليات التي تحكم غزو الخلايا السرطانية في مصفوفة خارج الخلية (ECM). ومع ذلك، يقتصر هذا الفحص بواسطة (1) عدم التحكم في تضمين spheroids في ECM; (2) ارتفاع تكلفة الكولاجين الأول والزجاج الأطباق القاع، (3) لا يمكن الاعتماد عليها وضع العلامات immunofluorescent، وذلك بسبب اختراق غير فعال من الأجسام المضادة والأصباغ الفلورية و (4) معالجة الصور تستغرق وقتا طويلا، وتحديد كم البيانات. ولمعالجة هذه التحديات، قمنا بتحسين بروتوكول الزفير ثلاثي الأبعاد (3D) إلى الخلايا السرطانية المسماة بالفلورسنت والمضمروسة في الكولاجين الأول، إما باستخدام مقاطع فيديو الفاصل الزمني أو التصوير الطولي، وتحليل غزو الخلايا السرطانية. أولا، نحن وصف تصنيع جهاز التصوير spheroid (SID) لتضمين spheroids موثوق بها وفي الحد الأدنى من حجم الكولاجين الأول، والحد من تكلفة المقايسة. بعد ذلك، نقوم بتحديد الخطوات لوضع علامة الفلوريسين القوية على الـ spheroids الحية والثابتة. وأخيرا، نحن نقدم ماكرو فيجي سهلة الاستخدام لمعالجة الصور والبيانات. تماما، توفر هذه المنهجية البسيطة منصة موثوقة وبأسعار معقولة لرصد غزو الخلايا السرطانية في الكولاجين I. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتتناسب مع احتياجات المستخدمين.
Introduction
أثناء تطور السرطان، يمكن للخلايا السرطانية الحصول على نمط ظاهري ظاهري فيضوي، مما يمكنها من الهروب من كتلة الورم وغزو الأنسجة المحيطة1. في نهاية المطاف، يمكن لهذه الخلايا السرطانية الغازية الوصول والنمو داخل الأجهزة الثانوية، وهي عملية تسمى الانبثاث السرطان1. الانبثاث يسبب أكثر من 90٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان2. أحد أسباب ذلك هو أنه في حين أن الأورام الموضعية يمكن إدارتها سريريًا ، لا توجد طرق فعالة للقضاء على الخلايا السرطانية الغازية بمجرد حدوث الانتشار النقيلي. ولذلك، فإن ظهور الخلايا السرطانية الغازية والانتقال من مرض محلي إلى مرض غازي يشكل تحديًا سريريًا كبيرًا. تحديد كيفية بدء الخلايا السرطانية والحفاظ على سلوك الغازية قد يؤدي إلى تطوير علاجات قوية جديدة.
نموذج 3D كروي هو منصة مثالية للتحقيق في السلوك الضهر للخلايا السرطانية تحت السيطرة، ولكن الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية3. في الواقع ، في هذا الفحص ، يتم تضمين التواء الخلايا السرطانية داخل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، على سبيل المثال الكولاجين الأول ، الذي يحاكي ورمًا مبسطًا. ثم، يتم استخدام التصوير لتصور غزو الخلايا السرطانية من الزفير في مصفوفة الكولاجين. ومع ذلك، تحد العديد من التحديات هذا الإجراء.
التحدي الأول يحدث في خطوة التضمين، حيث يمكن أن تنتشر مصفوفة الكولاجين السائل عبر سطح الطبق، مما تسبب في spheroid للمس الجزء السفلي من الطبق. وبالتالي، انتشرت الخلايا من الزفير على السطح ثنائي الأبعاد (2D)، وكسر 3 الأبعاد (3D) المورفولوجيا. زيادة حجم الكولاجين هو حل فعال، ولكن مكلفة. لمنع الخلايا من الانتشار على السطح ثنائي الأبعاد، مع الحفاظ على الحد الأدنى من حجم الكولاجين، قمنا بتطوير جهاز تصوير سفلي (SID) من خلال ربط بوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS) بسمك 1 مم، ثلاثية الفتحات (PDMS) على طبق زجاجي أسفل.
التحدي الثاني للمقايسة الزفية هو وضع العلامات على الخلايا السرطانية في الزفويد ، والتي يحدها الاختراق الضعيف للأجسام المضادة والأصباغ الفلورية ، وهو تأثير يزيد مع حجم الزفير. في حين أن الحل المثالي للخلايا وضع العلامات هو إنشاء خطوط الخلايا التي تعبر بشكل ثابت عن البروتين الفلوري (البروتينات) ، فإن هذا الخيار يقتصر في الغالب على خطوط الخلايا الخالدة ويقتصر على توافر الكيميرا البروتين الفلوري. هنا، ونحن وصف بروتوكول الأمثل لتلطيخ المناعة من الزفيرة، فضلا عن الاستخدام الفعال لصبغة السيتوبلازمية لتسمية الخلايا مباشرة قبل تضمين الزفيرويد.
التحدي الثالث للمقايسة الكروية هو عدم وجود وحدات ماكرو فيجي بسيطة للتحديد الكمي شبه الآلي لغزو الخلايا بمرور الوقت. لمعالجة هذا التحدي، نحن وصف منهجية بسيطة لتحليل منطقة spheroid على مر الزمن. نحن نوضح مزايا هذا البروتوكول باستخدام خطوط الخلايا 4T1 و 67NR كأمثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصنيع جهاز تصوير Spheroid (SID) لتحسين تضمين spheroid (المدة 1 يوم)
- إنشاء المسافة باستخدام طابعة 3D(الشكل 1A، B و ملف تكميلي 1).
- تزن بها نسبة 10:1 (wt/wt) من البوليمر قاعدة: crosslinker في كوب من البلاستيك [على سبيل المثال، 20 غرام من البوليمر قاعدة إيثيل بنزين و 2 غرام من الاتجات السيليكون crosslinker لخلق polydimethylsiloxane (PDMS)].
- خلط شامل حل PDMS في كوب من البلاستيك باستخدام ماصة المتاح.
- وضع كوب من البلاستيك في غرفة فراغ لإزالة فقاعات الهواء من الخليط. الافراج بسرعة عن ضغط الفراغ لإزالة كمية صغيرة من الهواء المحاصرين على سطح الخليط وتبديد فقاعات الهواء المتبقية.
- احتضان 3D فراغ المطبوعة في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لزيادة مرونته.
- تنظيف اثنين من لوحات الزجاج التي سيتم استخدامها لبناء قالب PDMS بدقة عن طريق مسح لهم مع isopropanol 100٪. إذا كانت لوحات الزجاج المستخدمة سابقا إلى يلقي PDMS، تأكد من إزالة أي ما تبقى من PDMS القديمة عن طريق كشط بلطف لوحات الزجاج مع شفرة الحلاقة ومسحها مع isopropanol 100٪.
- بناء القالب عن طريق وضع 3D تدفق المسافة المطبوعة في بين لوحات الزجاج نظيفة اثنين.
- ختم القالب باستخدام مقاطع الموثق كبيرة على الحواف الخارجية لوحات الزجاج. ضع مقطعين من الـ Binder على الحافة السفلية وواحد في الزاوية العليا.
- فحص الجزء العلوي من القالب للتأكد من أن المسافة هو دافق مع لوحات الزجاج. وهذا يضمن أن لا تكون هناك تشوهات وأن ورقة زوجية من PDMS سيتم إنشاء.
ملاحظة: إذا لم يكن من سمك ورقة الناتجة من سمك، لقطات تحتاج إلى تعديل قليلاً. - قطع غيض من ماصة المتاح (~ 2 سم من طرف) وإضافة خليط PDMS بمعدل بطيء وثابت إلى الزاوية اليسرى العليا من القالب. صب الخليط ببطء لمنع إنشاء جيوب الهواء الكبيرة.
- وضع القالب في غرفة فراغ لإزالة فقاعات الهواء التي تشكلت خلال صب.
- علاج PDMS عن طريق احتضان القالب في 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- استرداد القالب من الحاضنة والسماح لها لتبرد للمس.
- إزالة مقاطع الموثق ولوحات الزجاج من المسافة التي تحتوي على PDMS الشفاء.
- استخدام شفرة حلاقة لقطع من خلال الختم الذي تم إنشاؤه على جميع الجوانب الأربعة للقالب بين الفاصل وطبقة الزجاج. مع قطع جميع الأطراف الأربعة إلى، تبدأ في سحب بعيدا القالب للكشف عن ورقة PDMS في الفضاء.
- بعناية قشر ورقة PDMS جديدة قبالة من الفضاء باستخدام ملاقط.
- على حصيرة القطع، لكمة من أقراص PDMS قطرها 17.5 ملم من الورقة، ثم لكمة ثلاثة موزعة بالتساوي 5.5 ملم ثقوب قطرها 5.5 ملم، وذلك باستخدام اللكمات خزعة حجم مختلف. هنا يشار إلى هذه الأقراص 3-ثقب PDMS باسم "إدراج"(الشكل 1C).
ملاحظة: قد تؤدي التخفيضات غير المتحدة التي تم إجراؤها في نظام إدارة المباني ، أو ربط خلل عن طريق علاج البلازما ، إلى تسربات في المستقبل. - تنظيف كل إدراج عن طريق إزالة بلطف أي جزيئات الغبار باستخدام الشريط.
- عصا إدراج على قطعة من الشريط على الوجهين والتفاف الشريط حول غطاء طبق بيتري 10 سم.
- ضع غطاء طبق بيتري في آلة البلازما، جنبا إلى جنب مع الأطباق المفتوحة القاع الزجاجي 35 ملم.
- قم بتفعيل سطح السطوح والزجاج عن طريق معالجة البلازما لمدة 1 دقيقة عند 300 mTorr. يمكن استخدام عصا البلازما المحمولة باليد.
- باستخدام ملاقط، نعلق بسرعة على الجانب الإيجابي، أي الجانب المعالج، من إدراج واحد (الشكل 1D) إلى الجزء الزجاجي من طبق القاع الزجاجي (الشكل 1E). كرر لجميع الأطباق.
- استخدام مؤشر الاصبع والإبهام لتطبيق ضغط حتى أثناء تدوير طبق القاع الزجاج. وهذا يضمن استقرار تأمين إدراج إلى طبق القاع الزجاج.
- احتضان SIDs(الشكل 1F) في 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتقوية التصاق بين الزجاج و PDMS.
- إجراء جولة ثانية من العلاج البلازما على SIDs، وذلك باستخدام نفس الإعدادات كما هو الحال في الخطوة 1.21 أو مع عصا اليد. وهذا سيجعل سطح PDMS الحرة التمسك بولي-L-ليسين في حل الطلاء (انظر 1.26).
- إعداد حلول جديدة التالية.
- حل الطلاء: 1x PBS تحتوي على 0.01٪ (فول/ فول) بولي-L-ليسين [على سبيل المثال، إضافة 10 ميكرولتر من 0.1٪ (vol/vol) بولي-L-ليسين إلى 90 ميكرولتر من 1X PBS].
- حل الربط المتداخل: الماء المقطر الذي يحتوي على 1x (vol/vol) glutaraldehyde [على سبيل المثال، إضافة 10 ميكرولتر من 10x غلتارالدهيد إلى 90 ميكرولتر من الماء المقطر].
- حل التخزين: 1x PBS تحتوي على 10x (vol/vol) بينسيلين-ستريبتومايسين [على سبيل المثال، أضف 1 مل من 100x بينسيلين-ستريبتوميسين إلى 9 مل من 1x PBS].
- إضافة 35 ميكرولتر من محلول الطلاء لكل حفرة واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- استلهم البولي-إل ليسين وشطف كامل SID 3 مرات مع الماء المقطر.
- إضافة 35 ميكرولتر من حل crosslinking لكل حفرة احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- استلهم محلول الربط المتبادل وشطف SID بأكمله 3 مرات بالماء المقطر.
- إضافة 70٪ الإيثانول في كل SID ووضع تحت الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء لمدة 30 دقيقة.
- تحت غطاء محرك السيارة، الإيثانول الطامح وشطف SID 3 مرات مع الماء المقطر.
- أضف 2.5 مل من حلول التخزين لكل SID.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين SIDs في 4 درجة مئوية لمدة أسبوع. ولوحظ أن قوة الربط بين نظام إدارة المباني والزجاج تقل بمرور الوقت. بعد أسبوع، يوصى المستخدمين لاختبار SIDs لاحتمال التسرب قبل الاستخدام. للقيام بذلك، التعرق حل التخزين وإضافة 35 ميكرولتر من 1X PBS في كل حفرة. بعد الاستخدام، يمكن تقشير إدراج PDMS قبالة الأطباق القاع الزجاجي. لتحقيق أفضل تنظيف للأطباق القاع الزجاجي، ينبغي استخدام عدة يغسل مع ايزوبروبانول وحمض الهيدروكلوريك لإزالة بقايا PDMS.
2. تكوين Spheroid وتضمينها في الكولاجين (المدة 4 أيام)
ملاحظة: بالنسبة للتصوير الحي للزائرات، الطولية أو في مقاطع الفيديو الفاصلة زمنيًا، استخدم خط خلية يعبر عن بروتين فلورسنت سيتوبلازمي و/أو نووي. إذا كان هذا الخط خلية متوفرة اتبع الخطوات الموضحة في هذا القسم. بدلا من ذلك ، في القسم 3 ، يقترح بروتوكول لتسمية الخلايا السرطانية في spheroids باستخدام صبغة السيتوبلازمية.
- شكل spheroids من 4T1 و / أو 67NR الخلايا باستخدام تقنية إسقاط شنقا، كما هو موضح سابقا4،5،6،7، مع 3000 الخلايا / 40 ميكرولتر قطرات و 3 أيام حضانة الوقت. إضافة atelocollagen البقرية I حل الماضي والحفاظ على جميع الحلول على الجليد، في كل وقت.
- تحديد spheroids شكلت بشكل صحيح باستخدام المجهر حقل مشرق.
- ملء أنبوب مخروطي 15 مل مع 8 مل من ما قبل الدافئة المتوسطة كاملة.
- جمع الزائر مع ماصة P1000 ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الرطب تلميح ماصة عن طريق pipetting بعض المتوسطة كاملة داخل وخارج لمنع spheroids من التمسك الجدران الداخلية من تلميح ماص والحد من فقدان spheroid.
- السماح لـ spheroids بالغرق في قاع الأنبوب وغسل الـ spheroids بعناية عن طريق تبادل الوسيط. كرر مرتين.
- إعداد 5 ملغم / مل الكولاجين أنا حل وفقا لتوصيات الشركة المصنعة (إجراء الجل البديل، انظر حساب مثالي أدناه). استبدال الماء المقطر مع متوسطة كاملة. عند حساب حجم المتوسط الذي سيتم استخدامه، تأخذ بعين الاعتبار أن ستضاف الزفوئيات في 20 ميكرولتر من المتوسط الكامل [على سبيل المثال، لإحدى الدول الجزرية الصغيرة، 3 × 30 + (3 × 30) × 20 ٪ = 108 ميكرولتر من 5 ملغم / مل الكولاجين الأول هناك حاجة (إعداد 20 ٪ اضافية لحساب فقدان الأنابيب عند التعامل مع السوائل اللزجة) ؛ 22 ميكرولتر من المتوسط الكامل + 10.8 ميكرولتر من 10x PBS + 1.2 ميكرولتر من 1 M NaOH + 54 ميكرولتر من 10 ملغ / مل الكولاجين I الأسهم].
- جمع جميع spheroids في 20 ميكرولتر من المتوسط، وذلك باستخدام ماصة P200، وإضافتها إلى الحل الكولاجين الأول المعدة في الخطوة 2.6.
- خلط ببطء الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا لتجنب عدم التجانس في تركيز الكولاجين الأول، والحد من تشكيل فقاعة. الحفاظ على الحل على الجليد.
- إزالة حل التخزين من SID (ق) وغسل 3 مرات مع 3 مل من 1X PBS. بعد الغسيل النهائي، وترك SID (ق) الجافة حتى لا تمييع الكولاجين I الحل.
- بدء مؤقت والاستغناء 30 μL من الحل الكولاجين الأول التي تحتوي على واحد spheroid في واحدة من الثقوب الثلاثة من SID. ضمان بصريا أن يتم احتواء كروي واحد في 30 ميكرولتر.
- كرر الخطوة 2.10 مرتين أكثر لملء كافة ثقوب 3 SID.
- استخدم 10 ميكرولتر ماصة تلميح لإعادة مركز spheroid إذا كان موجوداً على مقربة من حدود PDMS. إذا اثنين أو ثلاثة spheroids ينتهي الاستغناء في واحدة من الثقوب، يمكن استخدام نفس تلميح ماص لفصل spheroids من بعضها البعض. أوقف المؤقت
ملاحظة: في كثير من الأحيان عكس من SID رأسا على عقب ورأسا على عقب، طوال فترة الكولاجين أنا البلمرة والصلابة، ويضمن أن يتم وضعها في شكل سفوي في المركز الرأسي لطبقة ECM، ويمنع غزو الخلايا في 2D. يجب تكبير تردد الانقلب (التقليب). كما يتم التحكم في تردد التقليب بواسطة "وقت الاستغناء" الزنجي مقاساً في 2.10-2.12، ينبغي تقليل وقت الاستغناء. في مختبرنا، وقت الاستغناء هو 2 دقيقة في المتوسط. - لتوسيط عمودياً في الطبقة الزنجية في طبقة الكولاجين، قم بقلب SID رأساً على عقب واحتضانه عند 37 درجة مئوية من أجل وقت الاستغناء.
- الوجهسايد سيد صعودا واحتضان في 37 درجة مئوية لصرف الوقت.
ملاحظة: يجب أن يكون طول الوقت الذي يقضيه spheroids في الاتجاه رأساً على عقب يساوي الوقت الذي تم إنفاقه في الاتجاه upside-up. - كرر الخطوات 2.13 و 2.14 لمدة 30 دقيقة، حتى الكولاجين أنا البلمرة.
- إضافة 2.5 مل من متوسطة كاملة / SID وإذا لزم الأمر، والحصول على صورة من spheroids لنقطة زمنية أولية.
- كرر الخطوات 2.10-2.16 إذا تم استخدام العديد من SIDs.
3. الفلوريسنس وضع العلامات من spheroids
- التصوير الحي (المدة 6-7 أيام)
ملاحظة: إذا كان يتوفر خط خلية يعبر عن بروتين سيتوبلازم و/أو فلورية نووية، اتبع الخطوات الموضحة في القسم 2. بدلا من ذلك، للوسم السيتوبلازمي، ويقترح البروتوكول التالي.- اتبع الخطوات 2.1-2.5 من البروتوكول الموضحة في القسم 2.
- تخفيف صبغة السيتوبلازمية إلى 25 ميكرومتر في 200 ميكرولتر من وسيط خال من المصل.
ملاحظة: في حين يتم استخدام صبغة السيتوبلازمية الحمراء في هذه التجربة، أي لون متاح آخر يجب أن تكون مناسبة. تم تصنيف الخلايا السرطانية داخل الزفويد باستخدام الأصباغ النووية المخففة إلى 20 ميكرومتر في 200 ميكرولتر من وسيط خال من المصل (انظر جدول المواد). - بعد الغسيل النهائي، وريسوسبيند spheroids في حل صبغة سيتوبلازمي أو النووية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، محمية من الضوء.
ملاحظة: باستخدام هذا الأسلوب، لن يكون وضع العلامات للخلايا في مركز spheroid فعالاً. لتحقيق وضع العلامات من جميع الخلايا، يمكن تمديد الحضانة بين عشية وضحاها، عن طريق وضع الطبق على الروك. يتم وصف البدائل في المناقشة. - غسل spheroids 3 مرات في المتوسط الكامل.
- انتقل إلى الخطوات 2.6-2.17 من البروتوكول الموضح في القسم 2.
- صورة spheroids عن طريق التصوير الفاصل الزمني كل 10 دقيقة لمدة 24-72 ساعة(الشكل 2)، أو عن طريق التصوير الطولي، يوميا، لمدة تصل إلى 7 أيام (الشكل 3). استخدام مجهر مجهر بالليزر، 10x هدف الهواء (0.4 الفتحة الرقمية و3.1 مم مسافة العمل)، 1024 × 1024 بكسل، وقت التعرض 8 ميكروغرام/ بكسل، الثقب 90 ميكرومتر، 6 × 15 ميكرومتر ز خطوات و 3 حقول من عرض كل تحتوي على واحد من الشعاع.
ملاحظة: بالنسبة للتصوير بالفاصل الزمني، استخدم الحد الأدنى من طاقة الليزر وزود المجهر بغرفة بيئية مع درجة الحرارة والرطوبة والتحكم في الغاز. ثقافة spheroids جزءا لا يتجزأ في 37 درجة مئوية ل> 8 ح أو بين عشية وضحاها قبل التصوير لتقليل الوقت على المجهر.
- صبغ الفلور المناعية من الزفيرويدات (المدة 2 أيام)
ملاحظة: يتم تكييف الإجراء الموضح هنا وتحسينه من البروتوكولاتالمنشورة سابقاً 8و9. يمكن استخدام هذا الأسلوب بعد البروتوكول الموضحة في المقاطع 2 و 3.1.- إعداد حلول جديدة التالية.
- حل التثبيت: 1x PBS تحتوي على 4٪ PFA (vol/vol) [على سبيل المثال، إضافة 5 مل من 16٪ (vol/vol) PFA إلى 15 مل من 1X PBS].
- حل التثبيت و Permeabilizing: 1x PBS تحتوي على 4٪ PFA (vol/vol) و 0.5٪ Triton X-100 (vol/vol) [على سبيل المثال، إضافة 50 ميكرولتر من تريتون X-100 إلى 10 مل من حل التثبيت].
- حل حظر: 1x PBS تحتوي على 1٪ FBS (vol/vol) و 1٪ BSA (wt/vol) [على سبيل المثال، حل 100 ملغ من BSA في 10 مل من 1X PBS، ثم إضافة 100 ميكرولتر من FBS].
- محلول الغسيل: 1x PBS يحتوي على 0.05٪ Tween 20 (vol/vol) [على سبيل المثال، إضافة 25 ميكرولتر من توين 20 إلى 50 مل من 1X PBS].
- إزالة المتوسطة الثقافة من SID (ق) وغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X دافئة.
- أضف 2 مل من حل التثبيت و Permeabilizing لكل SID واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إزالة حل التثبيت و Permeabilizing وإضافة 2 مل من حل تحديد لكل SID واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- غسل 3 مرات مع محلول الغسيل.
- إضافة 2 مل من حل حظر في SID واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة مع اهتزاز معتدل.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن احتضان العينات عند 4 درجة مئوية خلال عطلة نهاية الأسبوع. يرجى ملاحظة أن فترة حظر أطول قد تتداخل مع إجراء وضع العلامات المناعية. - تمييع الأجسام المضادة الأولية في حل الحجب.
- إضافة 150 μL من حل حجب مع الأجسام المضادة الأولية / جيدا في لوحة 48-جيدا.
- باستخدام ملاقط غرامة، وفصل بعناية المكونات من الكولاجين أنا تحتوي على spheroid ونقلها إلى بئر. كرر إذا تم تسمية عدة spheroids. امسح أي سائل قد يبقى على الملاقط عند العمل مع أجسام مضادة مختلفة، لمنع التلوث.
- احتضان ليلة وضحاها في 4 درجة مئوية مع اهتزاز معتدل.
- أضف 300 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى الآبار الفارغة والكاملة.
- نقل بعناية المكونات من الكولاجين الأول التي تحتوي على spheroid في "غسل" جيدا.
- اغسل 3 مرات مع محلول الغسيل لمدة 2 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة ومع اهتزاز خفيف.
ملاحظة: نقل المقابس من الكولاجين الأول التي تحتوي على spheroid، بدلا من التعرق الحلول، يمكن أن تساعد في الحد من فقدان العينة وتلف العينة. - تمييع الأجسام المضادة الثانوية، 4'، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) و / أو phalloidin في منع الحل.
- إضافة 150 μL من حل حظر مع الأجسام المضادة الثانوية، DAPI و / أو phalloidin في البئر.
- باستخدام الملاقط، قم بنقل قابس الكولاجين الذي يحتوي على الـ spheroids بعناية إلى البئر. كرر إذا تم تسمية عدة spheroids.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع اهتزاز معتدل.
- كرر الخطوات 3.2.11 و 3.2.12.
- اغسل 3 مرات مع محلول الغسيل لمدة 30 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز خفيف.
- باستخدام شفرة حلاقة، وقطع إدراج PDMS 3 حفرة في ثلاثة أجزاء بحيث يحتوي كل جزء على ثقب.
- ضع قطعتين من نظام إدارة المباني على شريحة مجهر.
- إضافة قطرة من حل تصاعد باستخدام تلميح P200 مع نهاية قطع. منع تشكيل فقاعة.
- نقل بعناية الكولاجين أنا المكونات في كل حفرة.
ملاحظة: إذا تم وضع الـ spheroid في أعلى قابس الكولاجين، عكس قابس الكولاجين بحيث ينتهي الزفير إلى أقرب إلى غطاء الزجاج. - ضع غطاء على القمة وختم باستخدام الشريط.
- السماح للعينة الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة، محمية من الضوء.
- تخزين العينات في 4 درجة مئوية، محمية من الضوء حتى التصوير.
- إعداد حلول جديدة التالية.
4. معالجة الصور لتحليل غزو السرطان مع مرور الوقت
ملاحظة: التنسيق المطلوب لهذا الماكرو هو صورة قناة واحدة x,y,t حفظ كملف .tiff.
- إذا تم الحصول على شرائح z متعددة(أي x، y، z، t صورة)، افتح الصورة في فيجي وحدد صورة | | المكدسات Z المشروع. من المستحسن استخدام خيار الحد الأقصى للكثافة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام شريحة z واحدة لتشغيل الماكرو. حفظ الصورة كملف .tiff.
- إنشاء مجلد "معالجة" منفصل على سطح المكتب.
- حدد | الملف حفظ باسم | تسلسل الصورة. استخدم تنسيق TIFF، وقم بتحديث رقم الأرقام وفقًا لعدد الإطارات، وحدد المربع لاستخدام تسمية الشريحة باسم الملف وحدد موافق. حدد المجلد "معالجة" التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.
- افتح صورة واحدة من المجلد "معالجة". يجب أن تكون صورة x،y، المقابلة لنقطة زمنية واحدة.
- حدد | الصورة ضبط | عتبة السيارات. في القائمة المنسدلة حدد الأسلوب حاول الكل وحدد المربع للكائنات البيضاء على خلفية سوداء.
- تظهر صورة مونتاج تظهر النتيجة لكل أسلوب العتبة التلقائي.
- تحديد أفضل طريقة العتبة الآلي، على سبيل المثال RenyIEntropy.
- لتأكيد الاختيار لأسلوب العتبة التلقائية، افتح أي صورة أخرى من المجلد "معالجة" واختبار أسلوب العتبة المختار باستخدام الصورة | ضبط | عتبة السيارات.
- أغلق جميع الصور.
- تحميل ماكرو SpheroidAreaTime(ملف تكميلي 2).
- افتح ماكرو فيجي بواسطة السحب والإفلات.
- في السطر 58، قم بتحديث أسلوب العتبة التلقائية حسب الحاجة.
- في السطر 62، قم بتحديث نطاق الحجم وفقا لأبعاد الخلية.
- حدد تشغيل.
- حدد المجلد "معالجة" واكتب في "المعالجة" كمجلد الأصل، ثم حدد موافق.
- مرة واحدة في تشغيل هو أكثر، حفظ الجدول "ملخص". يشير العمود الأول إلى اسم الصورة؛ ثم يشير إلى اسم الصورة. يشير العمود الثالث إلى منطقة spheroid؛ تحدد الأعمدة السادس والسابع والثامن معلمات القطع الناقص التي تم تركيبها على الـ spheroid.
- يحتوي المجلد "معالجة" الآن على صورة معالجة لكل نقطة وقت، مع الملحق _SpheroidArea.
ملاحظة: إذا كان مركز spheroid خافتاً، تعبئة بالأبيض باستخدام أدوات التحديد، لكافة نقاط الوقت، ثم انتقل إلى الخطوة 3. وبالمثل، يمكن ملء المساحة المحيطة بالزفوئي باللون الأسود "لتنظيف" الصورة. إذا كانت الصورة نظيفة، قم بالتعليق على الخط 61 لتسريع الركض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونظراً لتفاعلها البيولوجي، فإن نظام إدارة المباني يستخدم على نطاق واسع في التكبير المجهري لرُبُس الآبار والطوابع والقوالب، مما أحدث ثورة في الأجهزة الصغيرة والفولفلورية. في الطريقة المذكورة هنا، يتم استخدامه لإنشاء SIDs، والآبار للتخصيص التي تحسن التضمين spheroid وإجراءات التصوير. ويوضح الشكل 1 المكونات الرئيسية المستخدمة في تصنيع الدول الجزرية الصغيرة النامية. ليلقي قالب PDMS، هو 1-mm سميكة 3D مطبوعة (الشكل 1A،B) ، وضعت بين اثنين من لوحات الزجاج ، مختومة مع مقاطع كبيرة. صب والخبز PDMS في الفضاء بين لوحات يشكل ورقة سميكة 1 مم من PDMS. مخطط SID (الشكل 1C) يشير إلى أبعاد الجهاز الأمثل ، ولكن يحدث اختلاف طفيف في مسافات الثقب ، بسبب اللكم اليدوي للثقوب باستخدام اللكمات الخزعة (الشكل 1D). الشكل 1D، F تشير إلى تخفيضات دائرية نظيفة مع ثقوب متباعدة بالتساوي داخل إدراج PDMS.
استخدام SIDs يسهل التضمين كفاءة، وبالتالي تسجيل غزو الخلايا السرطانية داخل الكولاجين أنا باستخدام الفاصل الزمني(الشكل 2, فيديو 1) أو طولية(الشكل 3)التصوير. على الرغم من استخدام نفس الترددات انعكاس لجميع SIDs خلال الكولاجين أنا البلمرة، سوف وظائف كروية داخل المكونات الكولاجين تختلف قليلا. لذلك، من المهم استخدام هدف مع مسافة عمل طويلة (> 1 مم). خلاف ذلك، قد يكون من الصعب التركيز والتصوير لs تنفّس وضعها على مقربة من الجزء العلوي من الكولاجين قابس. في المقابل، سوف يضع spheroids قريبة من الجزء السفلي من الكولاجين المكونات، والخلايا التي تتحرك إلى سطح الزجاج والهجرة على الزجاج، بدلا من غزو المصفوفة الكولاجين الأول. أشرطة الفيديو من هذه spheroids تحتاج إلى التخلص منها. يتم التحكم في سمك المكونات الكولاجين، هنا ما يقرب من 800 ميكرومتر، من قبل وحدة التخزين الاستغناء في كل ثقب من SID وتعديلها لمسافات الغزو spheroids المعرض في هذا البروتوكول. يمكن خفض سمك الكولاجين المكونات عن طريق الاستغناء عن انخفاض حجم الكولاجين الأول في كل ثقب من SID، عند استخدام spheroids أصغر أو أقل الغازية.
من أجل التحليل السليم للغزو باستخدام ماكرو فيجي، من الضروري أن يتم وضع العلامات الصحيحة للخلايا السرطانية على مدار جلسة التصوير. كما هو موضح في الخطوة 4.17.، تسمح خطوة معالجة الصورة بتصحيح الصورة إذا كان وضع العلامات دون المستوى الأمثل. بينما نوضح التصوير الطولي على مدار 6 أيام (الشكل 3) ، والذي يتطلب التعبير المستقر عن البروتين الفلوري النووي و/أو السيتوبلازم ، يمكن إجراء تصوير طولي مماثل على مدار وقت أقصر باستخدام التسميات مع الأصباغ.
بعد التصوير الحي، نقدم بعض النتائج من إجراء التميّز بالمناعة للكادهيرين الظهاري (E-cadherin)، والكورتاكين وF-actin (الشكل 4). في هذه الأمثلة، استخدمنا خطوط الخلايا 4T1 و 67NR. ويبين الشكل 5 التوضيح خطوة بخطوة لإجراء معالجة الصور باستخدام ماكرو فيجي لقياس مساحة الزفير مع مرور الوقت.
الشكل 1: تلفيق الدول الجزرية الصغيرة النامية. (A) عرض أعلى تمثيل التخطيطي للفواصل. (B) 3D فراغ المطبوعة. (C) عرض أعلى تمثيل التخطيطي ل SID. A 3-ثقب إدراج PDMS (D) ومنضم إلى طبق أسفل الزجاج (E), خلق SID النهائي (F). الأبعاد هي في ملليمترات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصوير الحي للـ"ثيرويدس". ممثل 20 ساعة و 40 ساعة من نقاط زمنية من الفيديو 1، الإسقاط الأقصى من 4T1 spheroid. تم تسمية خلايا 4T1 باستخدام صبغة سيتوبلازميك. شريط مقياس، 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التصوير الطولي للزوارق. ميكروجراف تمثيلية (الإسقاط الأقصى) من 4T1/67NR مختلطة spheroid صورة يوميا. 4T1 و 67NR الخلايا تعبر بشكل ثابت mScarlet السيتوبلازمي والبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP), على التوالي. شريط مقياس، 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصوير الفلوروس المناعي للزفويدات. تم تصنيف الغرافيك المجهرية التمثيلية (الإسقاط الأقصى) لـ 4T1 spheroid ثابت بعد يومين من تضمينه في الكولاجين I. E-cadherin (سماوي، A)، والكورتاكين (الأصفر، B) وF-actin (أرجواني، أ و ب). شريط مقياس، 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل معالجة الصور. خطوة بخطوة التوضيح من إجراءات معالجة الصور باستخدام ماكرو فيجي (A) لقياس مساحة spheroid على مر الزمن (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: تم تسمية فيديو تمثيلي لـ 4T1 spheroid تم تصويره كل 10 دقائق لمدة 46 ساعة و10 دقائق من 4T1 باستخدام صبغة سيتوبلازميك. شريط مقياس، 100 μm. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
ملف إضافي 1: نموذج ثلاثي الأبعاد للفواصل (ملف STL). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
ملف إضافي 2: ماكرو SpheroidAreaTime. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تصميم المساحة المطبوعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء أوراق سميكة من 1 مم من PDMS يمكن استخدامها بعد ذلك لإنشاء أشكال مختلفة من PDMS بسهولة ، كما هو مطلوب من التطبيقات التجريبية. نظرا لبساطة تلفيقه وحرية تغيير التصميم، تم اختيار هذا الأسلوب من الصب PDMS للتصميم الأولي لل SID. إذا كان هناك حاجة إلى حجم كبير من SIDs ، يمكن جعل الإنتاج أكثر كفاءة عن طريق إنشاء قالب مطبوع ثلاثي الأبعاد ، والذي يحتوي بالفعل على أقراص PDMS مع ثلاثة ثقوب متباعدة بالتساوي ، وتقليل العملية إلى خطوة واحدة. وهذا من شأنه أن يلغي الحاجة إلى لكمة من كل قرص، جنبا إلى جنب مع الثقوب الثلاثة اللاحقة، وتقليل الوقت الإجمالي للتحضير.
في حين تم تطوير لكمة 3 حفرة للاستخدام مع 35 ملم الأطباق القاع الزجاجي، والأحجام الأخرى المتاحة التي تسمح لمزيد من الثقوب، وبالتالي، المزيد من spheroids أن تكون صورة في موازاة ذلك. وبالإضافة إلى ذلك، فإن زجاج الغطاء المخصص الحجم متاح تجارياً أيضاً، والذي يمكن أن يسمح، بالاشتراك مع أصحاب الطباعة المطبوعة ثلاثية الأبعاد، بالتشهيرات ذات الإنتاجية العالية. مع مثل هذا النهج ، والحد من عامل هو سرعة الحصول على البيانات ، على سبيل المثال ، في التصوير confocal الفاصل الزمني متعددة الألوان ، واكتساب كومة 3D من spheroid واحد يتطلب ما يقرب من 2.5 دقيقة. لذلك، يتطلب الحصول على 3D مكدسات لـ 3 spheroids في SID 8 دقائق تقريباً. ونتيجة لذلك، للحفاظ على ترددنا المفضل للتصوير عند 10 دقائق لكل كومة، لا يمكننا زيادة عدد الثقوب في SIDs.
لتسجيل وقياس غزو الخلايا السرطانية الحية في نموذج 3D spheroid، يمكن استخدام التصوير في المجال الساطع5. ومع ذلك، يفضل المجهر الفلوري، لأنه يوفر زيادة التباين، وسهولة ودقة في معالجة الصور. إذا كان توليد خط الخلية التعبير عن سيتوبلازميك و / أو البروتين الفلورسنت النووية غير ممكن, نقترح استخدام الأصباغ السيتوبلازمية. كما أن الوقت الاحتفاظ الأصباغ السيتوبلازمية داخل الخلايا هو ثلاثة أيام في ظروف التصوير لدينا، وينبغي أن تكون الخلايا وصفت بعد فترة 3 أيام في إسقاط شنقا، ومباشرة قبل التضمين. قد تسمية الخلايا بعد تضمين تسمية الكولاجين على وجه التحديد، والحد من وضع العلامات الخلية. التصوير لأكثر من 3 أيام بعد التضمين يتطلب استخدام مختلف spheroid بذر بروتوكول10 أو خطوط الخلايا بشكل ثابت التعبير عن البروتين (الفلورسنت).
نحن شكلت بنجاح وصورة spheroids التي تحتوي على أي مكان من 60 إلى 5000 الخلايا / قطرة. اللولبيات الصغيرة مثالية لتسجيل الغزو على مدى عدة أيام ، حيث يمكن أن تتناسب منطقة الغزو بأكملها بسهولة مع حقل واحد من عرض أهداف التكبير الأعلى (20x -30x). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة أن تكون وصفت في جميع أنحاء مع صبغات السيتوبلازمية أو النووية. وأخيراً، بسبب التشتت المُقلَل، يمكن تصور كل خلية في الـ spheroid وتقسيمها. ومع ذلك، فإن الـ spheroids الصغيرة بالكاد تكون مرئية بعيون عارية وقد تتطلب وضع علامات إضافية عليها علامات الأنسجة. في المقابل، أكبر spheroids هي أسهل للتعامل معها، ولكن أكثر عرضة للغرق إلى الجزء السفلي من الطبق، وذلك بسبب وزنها. وعلاوة على ذلك، لا يتم تسمية الخلايا في مركز الزفيرويد دائما عند استخدام الأصباغ، أو مرئية باستخدام المجهر confocal، الذي لديه عمق الاختراق من ما يقرب من 100 ميكرومتر. لتصور جميع الخلايا السرطانية في جميع أنحاء spheroids كبيرة باستخدام التصوير الفاصل الزمني، يمكن استخدام المجهر متعدد الصور، وتقديم ميزة إضافية من ألياف الكولاجين التصور من قبل الجيل التوافقي الثاني (SHG) دون الحاجة إلى وضع العلامات. أيضا، يمكن أن يتم التصوير مع ضوء ورقة المجهرية8،11،12، وتوفير تقليل الوقت الحصول على صورة وبالتالي السماح للمقايسات spheroid عالية الإنتاجية ، ولكن أيضا تتطلب المزيد من تخزين البيانات ومعالجة الصور المتقدمة. إذا لم تكن هناك حاجة إلى مقاطع فيديو الفاصل الزمني ، يمكن دمج إجراء وضع العلامات الخاص بنا للـ 3D spheroids الثابتة مع المقاصة البصرية8،10. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يزيل اخافة الـ spheroids المضمّنة مشكلات في اختراق الصبغة أو الأجسام المضادة أثناء وضع العلامات، وكذلك اختراق الضوء أثناء التصوير. في أيدينا، ومع ذلك، كان انحصر نجاح عملية التكرير بالمراحل المبكرة من الغزو والخلايا غير الغازية، وذلك بسبب التحديات التقنية في الحفاظ على خيوط الغازية الطويلة والهشة.
بروتوكولنا متوافق أيضا مع استخدام الأصباغ النووية، لتسمية الخلايا السرطانية داخل الـ(ستيرويدات)، مما يتيح تتبع خلية واحدة لبيانات الفاصل الزمني. يمكن استخدام البرنامج المساعد في فيجي TrackMate13 لأتمتة تتبع الخلايا واستخراج معلمات الحركة من الخلايا الفردية ، مثل السرعة والسرعة الفورية والمثابرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر أعضاء معبد الهندسة الحيوية لمناقشات قيمة. نشكر ديفيد أمبروز في قلب التدفق الخلوي (كلية لويس كاتز للطب) لمساعدته في فرز الخلايا وتوني بوهم من مركز الأفكار (كلية الهندسة، جامعة تمبل) للمساعدة في الطباعة ثلاثية الأبعاد. كما نشكر موارد التمويل الخاصة بنا: منحة الباحث الباحث في جمعية السرطان الأمريكية 134415-RSG-20-034-01-CSM، قهر السرطان الآن / جائزة المحقق الشاب، المعاهد الوطنية للصحة، R00 CA172360 وR01 CA230777، كل إلى BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
