Summary
このプロトコルは、ゼブラフィッシュの高血糖を最大8週間非侵襲的に誘導する。このプロトコルを用いて、高血糖の副作用に関する詳細な研究が行われる。
Abstract
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、慢性高血糖症の影響を調査するための優れたモデルであり、II型糖尿病(T2DM)の特徴である。この交互浸漬プロトコルは、最大8週間の高血糖を誘導する非侵襲的で段階的な方法である。成虫のゼブラフィッシュは、それぞれ24時間砂糖(ブドウ糖)と水に交互に曝されます。ゼブラフィッシュは、2週間1%のグルコース溶液で治療を開始し、その後2週間、そして最後に残りの4週間の3%溶液を2%溶液とする。水処理(ストレス)およびマンニトール処理(浸透)コントロールと比較して、グルコース処理ゼブラフィッシュは血糖値が有意に高い。グルコース処理されたゼブラフィッシュは、コントロールの3倍の血糖値を示し、4週間と8週間後の高血糖が達成できることを示唆している。持続的な高血糖は、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の増加と、陰性および生理学的応答の減少における核因子カッパB(NF-kB)レベルの増加と関連しており、このプロトコルが疾患合併症をモデル化するために使用できることを示唆する認知障害であった。
Introduction
ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、病気と認知の両方を研究するために広く使用される動物モデルになりつつあります1.初期の発達段階を通じた遺伝子操作と胚性の透明性の容易さは、既知の遺伝的基礎を持つヒト疾患を研究する最有力候補となる。例えば、ゼブラフィッシュは、ホルト・オラム症候群、心筋症、糸球嚢胞性腎疾患、筋ジストロフィー、および糖尿病(DM)の研究に使用されてきた。また、ゼブラフィッシュモデルは、種の小型、メンテナンスの容易さ、および高い胎児性2、3のために理想的です。
ゼブラフィッシュ膵臓は、哺乳類膵臓4と解剖学的および機能的に類似している。したがって、サイズ、高い胎児性、および類似の内分泌構造のユニークな特性は、ゼブラフィッシュをDM関連合併症を研究するための適切な候補にする。ゼブラフィッシュでは、DMに特徴的な長期高血糖を誘導するために用いられる2つの実験方法があります:グルコースの流入(モデリングタイプ2)とインスリン分泌の停止(モデリングタイプ1)5、6。実験的に、インスリン分泌を止めるために、膵臓β細胞は、ストレプトゾトシン(STZ)またはアロキサン注射のいずれかを使用して化学的に破壊することができる。STZは齧歯類およびゼブラフィッシュで正常に使用され、網膜症7、8、9、認知障害10、および四肢再生11に関連する合併症を生じさせる。しかし、ゼブラフィッシュでは、β細胞が治療後に再生し、糖尿病状態12を維持するためにSTZの「ブースター注射」が必要となる。あるいは、ゼブラフィッシュの膵臓を6から取り除くことができる。これらは、複数の注射、および広範な回復時間のために、両方の非常に侵襲的な手順です。
逆に、高血糖は、外因性グルコースへの暴露を通じて非侵襲的に誘発され得る。このプロトコルでは、魚は24時間5、13、または2週間14、15、16のために継続的に高濃度グルコース溶液に沈められます。外因性グルコースは、経口摂取によって、および/またはエラを横切って、血糖値の上昇をもたらす経皮的に取り上げられる。この非侵襲的な技術はインスリンレベルを直接操作しないので、タイプ2 DMを誘導するとは主張できない。しかし、これは、タイプ2 DMの主な症状の一つである高血糖によって誘発される合併症を調べるために使用することができる。
最近、ゼブラフィッシュ変異体pdx1-/-は、ヒトにおける2型DMの遺伝的原因に関連する遺伝子である膵臓および十二指腸ホメオボックス1遺伝子を操作することによって開発された。この変異体を用いて、研究者は膵臓発達破壊、高血糖、および高血糖誘発糖尿病網膜症17,18を複製することができた。
本論文では、交互浸漬プロトコルを用いた非侵襲性高血糖誘導法について述べている。このプロトコルは、その後の合併症が観察された最大8週間の高血糖状態を維持する。簡単に言えば、成虫のゼブラフィッシュは24時間砂糖溶液に入れられ、次いで24時間水溶液に入れられます。外部グルコース溶液への連続浸漬とは対照的に、砂糖と水の間の交互の日は、糖尿病における血糖値の上昇と下降を模倣する。交互のグルコースプロトコルは、高血糖を高血糖が高い外部グルコース条件を補うことができないほど長い期間誘発することをさらに可能にする。原理の証明として、このプロトコルを用いて誘発される高血糖が、レチナリカル化学と生理学を変えるデータを提供する。
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Protocol
すべての手続きは、アメリカン大学の制度的動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. ソリューションタンクの準備
- 実験群(グルコース、マンミトール、水)ごとに2両の6つのタンクを得る。2つのタンクの「住宅タンク」の1つにラベルを付け(それは魚を収容します)、他の「溶液タンク」にラベルを付けます(それはソリューションを保持します)。
注:マンニトール処理群は浸透制御であり、水処理グループは取り扱い/応力制御です。タンク、航空会社/航空石、ふた、および洗浄用品は、各治療グループごとに別々に保つことが重要です - 使用する魚の総数が20未満の場合は、2 Lタンクを使用してください。使用魚の総数が20を超える場合は、4 Lタンクを使用してください。
注: サンプリング タイム ポイントごとに処理グループあたり 5 ~ 10 の N を使用します。 - 水温を維持するために、水浴中のタンクを28〜29°Cに保ちます。
- 1日目に、魚をそれぞれの治療溶液(グルコース、マンニトール、水)に24時間配置します(「水から治療へ」)。2日目に、魚を処理液から24時間水に移します(「水への治療」)。3日目に、魚を水から処理液に移します(「水から治療へ」)。この交互の露出は、実験の残りの部分(図1)のために続きます。 水処理されたコントロール魚を水から水に毎日移します。
- 魚が毎日同じ2時間のウィンドウ内で、実験の間、餌を与えられ、転送されることを確認します。
2. 魚の準備
- 大人のゼブラフィッシュ(4ヶ月 - 1年)5を使用してください。
- ラボに到着すると毎日魚の地面テトラミンフレークを養います。
- すべてのタンクのpHと温度を記録し、魚の一般的な状態を記録します。
3. 魚の転写
- 各処理群の魚を、標準的な魚網を使用して、住宅タンクから対応する溶液タンクに移します。
- 魚を含むタンクを水浴に戻し、エアストーンとタンク蓋を交換します。このタンクは現在「住宅タンク」であり、以前に魚を保持していたタンクは現在「ソリューションタンク」です。
- 古い溶液を捨てて、タンクの蓋、航空会社、航空石、ネットとともに、グルコースとマンリトールの蓄積を防ぎます。
メモ:石鹸で洗い物をしないでください。水と専用のスクラブブラシ/スポンジを各処理条件に使用して、タンクを適切に洗浄します。 - 新しく洗浄した「溶液タンク」をペーパータオルで乾かします。このタンクを使用して翌日のソリューションを準備します。他の項目は乾燥し、適切な処置群によって分離されていることを確認してください。
注:魚が毎日から、そして毎日に転送されているソリューションのログと、翌日に用意されているソリューションを記録しておきます。例えば:魚はブドウ糖からH2Oに移され、新しい1%グルコース溶液は明日のために調製される。
4. 転写後ソリューションの準備
- 砂糖溶液の準備
- 各溶液タンクにシステムウォーターの2 L(または4L)を充填します(システム水は、塩溶液の正しい比率で処理され、ストックおよび処理タンクと同じ温度にある水として定義されます)。
- 上部ローディングスケールを使用してグルコースとマンニートールの正しい量を測定し(下記のステップ5を参照)、各化学物質のボートを別々に計量します。
- 計量したグルコースまたはマンニートールアリコートを、システム水のみを含む適切な洗浄溶液タンクに追加します。
- 糖が完全に溶解するまで、別々のガラス攪拌棒でグルコースとマンニトール溶液をかき混ぜます。
- 水浴に溶液タンクを返し、対応する蓋で覆います。
- 水溶液の準備
- 実験用タンク(2 L または 4 L)をシステムウォーターで満たします。
- これらの「溶液タンク」を水浴に戻し、対応する蓋で覆います。
5. パーセンテージの変更
- 治療の最初の2週間の間に1%溶液で魚を維持する:4 Lタンク内のグルコースまたはマンニトールの40グラム。
- 治療の週3と4の間に2%溶液で魚を維持する:4 Lタンク内のグルコースまたはマンニトールの80グラム。
- 治療の最後の4週間の3%溶液で魚を維持する:4 Lタンク内のグルコースまたはマンニトールの120グラム。
6. 血糖値の測定と組織の収集
- 0.02%トリケーヌ溶液で魚2を一度に麻酔します。
- カミソリの刃を使用してエラの真後ろの魚を切断します。
- 血糖値を測定します。
注:血糖計(フリースタイルLiteなど)を使用して血糖値を測定し、検査ストリップを露出した心臓(心臓血液サンプル)に直接置きます。 - 魚から望ましい組織(脳、筋肉など)を解剖する。
- 収集した組織をドライアイスでフラッシュ冷凍し、-80°C冷凍庫に保管し、4%パラホルムアルデヒドで固定するか、または直ちに使用するために緩衝液に入れます。
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Representative Results
このプロトコル(図1)を用いて、血糖値は4週間および8週間の治療の後に有意に上昇し(図2A)、高血糖血症は水処理群およびマンリトール処理群の両方からの対照平均の3倍と定義される。水処理コントロールは、毎日水の出入りが行われ、ストレス/ハンドリングコントロールを提供します。マンニトールは、ブドウ糖のような6炭素糖であるが細胞によって取り込まれていないため、インビトログルコース研究19,20で浸透制御として機能する。これらの研究と一致するために、ゼブラフィッシュ21の他の研究は、観察された効果がグルコース暴露またはグルコース特異的効果に起因する高い浸透圧によるものであるかどうかを判断するために、グルコースと同じ濃度でマンニトールを投与した。
血糖値は、ギルの動きが遅くなるまで0.02%トリケーヌを使用して魚を麻酔し、首を切ることによって測定されます。血糖値は、血糖値計(図2B)で測定され、穿刺された心臓(すなわち心臓血液)上に直接グルコメータ試験片を配置することから決定される。
4週間の高血糖後に採取したレチナル組織は、グリア性線維性酸性タンパク質(GFAP)レベルの増加を示す(図3A)。GFAP発現は、網膜のミュラーグリア細胞において観察され、これは糖尿病性網膜症22,23において変化する。増加したGFAP含有量および/または免疫反応性パターンは、STZ誘導糖尿病ラット24、25、26、27、28、pdx1-/-変異魚17、および糖尿病ヒト29からのレチナでも観察される。 このGFAPの増加は、核因子カッパB(NF-kB)レベルの増加に関連しており(図3B)30は、代替浸漬プロトコルを用いてゼブラフィッシュに誘導される高血糖が炎症反応および反応性神経症を引き起こす可能性を示唆している。4週間の治療後のERG記録は、マンニトール処理対照と比較してグルコース処理レチナにおける応答の減少を同定した(図4A)。高血糖魚ではa波(光受容体)とb波(バイポーラ細胞)成分の両方の振幅が減少する(図4B)。これらの変化したERG応答は、特に高血糖的侮辱に敏感に見える赤および/または緑色コーン30、21の特定の変化に相関している。ERG応答の変化は、糖尿病31、32、33、34、35および糖尿病ヒトの動物モデルにおいても観察される。グルコース処理されたゼブラフィッシュはまた、認知能力の低下を示す(Rowe et al.,2020を参照して、この問題では)、長期の高血糖が高齢の糖尿病患者でも報告される認知機能障害にもつながりることを示唆している。
図1:代替浸漬プロトコルの概略図。これは、転送プロセスの視覚的な表現です。魚は2週間、2%溶液で2%の溶液で維持され、残りの4週間は3%溶液である。毎日、魚は砂糖または水溶液のいずれかに移されます。対照処理は、24時間ごとに、またはマンニトール(浸透制御)に出入りする魚類(0%グルコース-ハンドリングコントロール)を、マンニトール濃度とグルコースに使用されるものと平行して移動します(我々は、血糖値を測定し、実験を行い、4週間および8週間の治療後に組織を採取した(箱入り)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血糖レベルは、治療の4と8週間後に上昇しています。(A) グルコース処理魚は、水およびマンニトール処理対照魚と比較して血糖値の3倍以上の量を有し、有意な増加(p = 4週間で0.029;p<8週間で0.001)。これは、4週間および8週間後にグルコースで処理されたゼブラフィッシュが高血糖であったことを意味する。データはn=5マンニトール処理魚、n =8グルコース処理魚、およびn = 3水制御魚から4週間で収集した。n=5マンニトール処理魚、n=10グルコース処理魚、およびn=7水処理魚を8週間で。(B) 我々は血糖値を測定するために使用するゼブラフィッシュとフリースタイルLite血糖計の視覚的表現.血糖値は、魚が0.02%トリカイン溶液で麻酔され、切断された後、心臓血液サンプルから測定される。値は SE ±平均値であり、アスタリスクは* = p < 0.05 という大きな違いを表します。= p < 0.001 です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:GFAPレベルは、グルコース処理ゼブラフィッシュにおいて増加している。グルコース処理ゼブラフィッシュは、ウェスタンブロットのデンシソメトリー分析から決定されたように、(A)グリア線維性酸性タンパク質(GFAP;1:1000)および(B)Rel-A(NfK-B;1:1000)のレベルを増加した。β-アクチン(1:1000)は、負荷制御として機能しました。Rel-Aレベルの増加は有意であった(p < 0.003、アスタリスク)。W=水処理対照、G=グルコース処理、M=マンニートール処理。W2、G2、M2 は、W、G、M の複製です。これは、反応性グリオシスを引き起こす高血糖ゼブラフィッシュのレチナに対する侮辱があることを示唆している。(図7、Tanvirら、201830から修正され、CC-BYライセンスの条項に基づき、最初に公開された)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:グルコース処理魚においてERG応答が低下する。(A)代表的なERGは、グルコース処理(赤)、マンニトール処理(緑色)、および水処理(黒)ゼブラフィッシュレチナから、赤い適応背景に570nmの刺激で呼び起こされる。グルタミン酸受容体遮断薬CNQX(50μM)を浴液中に存在し、感光体およびオンバイポーラ細胞応答を単離した。単位: y 軸 = μV、x 軸 = 時間。方形波パルスは、光パルスの持続時間を反映します。(B) 応答振幅の変化を定量化する。光パルス時にトラフからピークまでの平均測定を行い、光のパルスの開始時に下向きのピーク偏向(b2振幅、左)として測定される光受容体a波(a1振幅、右)の平均応答振幅。両方の値は、グルコース対マンニトール処理組織で有意に減少した(p<0.001はa1;p<0.0001はb2;n=14目の治療につき)。値は水処理制御に正規化した。これは、他の糖尿病動物モデル(げっ歯類など)や糖尿病のヒトと一致しています。(図4から撮影したTanvirら 201830、CC-BYライセンスの条項に基づき、もともと公開)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
糖尿病は全国的な問題です。研究によると、2030年までに推定4億人が何らかの糖尿病を患うだろう。げっ歯類モデルでは、遺伝子操作を用いて2型DMを研究する。ラットでは、ザッカー糖尿病性ラット(ZDF)、及び大塚ロングエバンス徳島脂肪ラット(OLETF)が、2型DM10の効果に関するより多くの情報を提供している。また、高血糖を誘発するためにげっ歯類にも高脂肪食が使用されている。これは、本論文で提案された非侵襲的な手順を反映している。非侵襲的なプロトコルを使用して、最大8週間の高血糖を誘発することができ、それ以外の健康なゼブラフィッシュで長期にわたる高血糖をシミュレートすることができます。
血糖値を測定した後、その後の分析のために組織(レティナおよび脳)を採取することができる。電気レティノグラム(ERG)記録などの生理学的差異は、眼球21,30から直接測定することができる。行動応答(すなわち、検眼応答または認知の違い(Rowe et al., 2020)は、血糖値測定の前に評価することができる。タンパク質レベルのウェスタンブロット決定のために、組織は、RIPAバッファーまたはフラッシュ凍結に入れられ、-80°Cで保存されます。 サイズ/タンパク質含有量の違いにより、いくつかのレティナを分析前にプールする必要があります。免疫細胞化学の場合、組織は4%パラホルムアルデヒド溶液に24時間固定され、凍結切片(20μm)前に30%スクロース溶液で平衡化されます。
結果を最適化するには、マンリトールとグルコースの両方を慎重に計量し、溶液が完全に混合されていることを確認してください。また、砂糖と水が毎日、同じ時間帯に交互に行われていることを確認するために、転送日のアクティブなスケジュールを維持することも非常に重要です。さらに、溶液の濃度が少なすぎるか、または多すぎるように慎重に水を測定してください。最後に、極端な溶液に魚を移す魚が魚に衝撃を与え、死亡率を引き起こす可能性がありますので、pHと溶液の温度を注意深く監視します。徐々に暴露されると、グルコース暴露や高濃度のグルコースがゼブラフィッシュに有毒な影響を及ぼすという証拠はない。プロトコルが正しく従えば、ゼブラフィッシュの余分な死は期待できません。
これは高血糖を誘導する実証済みの方法ですが、このプロトコルの制限は、魚が犠牲になるまで高血糖であることを確認できないことです。もう一つの制限は、膵臓またはインスリンレベルを評価しないため、2型糖尿病を誘発すると主張することはできず、高血糖を誘発することだけである。しかし、これはまた、この手順を競合する方法よりも優れているものです:それは非侵襲的です。我々は、げっ歯類モデルおよび糖尿病患者において報告されるこのプロトコルによって誘発される長期高血糖の合併症を観察した。将来的には、この手順を使用して、網膜症などのDMの症状を緩和するのに役立つ治療技術を見ることができる可能性があります。
要約すると、この非侵襲的な交互浸漬プロトコルは、最大8週間の高血糖を誘導する有効な方法である。この方法は、慢性高血糖の合併症を検査し、治療治療のその後の決定を可能にする強力なツールです。また、モデル生物間で生物医学の研究結果を比較する機会も提供します。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
このプロトコルの開発については、VPC、CJR、および MCP を認識したいと考えています。EMMは、この研究を行うために、アメリカン大学芸術科学大学大学院学生支援から資金援助を受けました。この作品はまた、アメリカン大学教員メロン賞とアメリカン大学芸術科学大学を通じて資金を提供することによってサポートされました (両方の VPCへ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
References
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