Summary
שיטה מדויקת הניתנת לשחזור לכימות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים מתוארת כאן. שיטה זו משתמשת ב- HPLC-MS/MS.
Abstract
נוקלאוזידים/נוקלאוטידים הם אבני בניין של חומצות גרעין, חלקים של cosubstrates וקואנזימים, מולקולות איתות תאים, נשאי אנרגיה, אשר מעורבים בפעילויות תאים רבות. כאן, אנו מתארים שיטה מהירה ואמינה להסמכה מוחלטת של תכולת נוקליאוסיד/נוקלאוטידים בצמחים. בקצרה, 100 מ"ג של חומר צמחי הומוגני הוצא עם 1 מ"ל של חיץ מיצוי (מתנול, אצטוניטריל, ומים ביחס של 2:2:1). מאוחר יותר, המדגם התרכז חמש פעמים במייבש הקפאה ולאחר מכן הוזרק לתוך HPLC-MS / MS. נוקלאוטידים הופרדו על עמוד פחמן גרפי נקבובי (PGC) ונוקליאוסידים הופרדו בעמודה C18. המעברים ההמוניים של כל גרעין ונוקלאוטידים היו במעקב על ידי ספקטרומטריית מסה. התוכן של הנוקלאוזידים והנוקלאוטידים התכמת כנגד הסטנדרטים החיצוניים שלהם (ESTDs). לפיכך, בשיטה זו יכולים החוקרים לכמת בקלות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים שונים.
Introduction
נוקלאוזידים/נוקלאוטידים הם מרכיבים מטבוליים מרכזיים בכל האורגניזמים החיים, שהם סימנים מקדימים לחומצות גרעין וקואנזימים רבים, כגון ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD), וחשובים בסינתזה של מקרומולקולטים כגון פוספוליפידים, גליקוליפידים ופוליסכרידים. מבחינה מבנית, נוקליאוסיד מכיל גרעין, אשר יכול להיות אדנין, גואנין, uracil, ציטוצין, או תימינה, ו moiety סוכר, אשר יכול להיות ריבוז או deoxyribose1,2. נוקלאוטידים יש עד שלוש קבוצות פוספט מחייב את המיקום 5 פחמן של moiety הסוכר של נוקלאוזידים3. חילוף החומרים של נוקלאוטידים בצמחים חיוני לנביטת זרעים וצמיחת עלים4,5,6. כדי להבין טוב יותר את תפקידם הפיזיולוגי בהתפתחות הצמח, יש לקבוע את השיטות לכימות מוחלט של נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שונים ב- vivo.
אחת הגישות הנפוצות ביותר למדידת נוקלאוזידים /נוקלאוטידים מעסיקה כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) בשילוב עם גלאי אולטרה סגול גלוי (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. בשנת 2013, באמצעות HPLC, Dahncke ו- Witte כימתו מספר סוגים של גרעינים ב- Arabidopsis thaliana7. הם זיהו תכולת גואנוסין משופרת במוטנט החדרת T-DNA מיקוד בגן deaminase guanosine בהשוואה לצמח מסוג בר. נוקלאוזיד פירמידין נוסף, ציטידין, זוהה גם הוא כמותית בצמחים המשתמשים בשיטה זו, מה שהביא לזיהוי של גן דימינאז ציטידין בתום לב 4. בהתבסס על גלאי UV, שיטה זו, עם זאת, לא יכול להבחין בקלות את הגרעינים אשר יש ספקטרום דומה וזמני שמירה, למשל, גואנוסין או קסנטוסין. מגבלת הגילוי של שיטת HPLC היא גבוהה יחסית, ולכן, הוא משמש לעתים קרובות למדידת תוכן גבוה של נוקלאוזידים ב vivo, כגון ציטידין, uridine, ו guanosine.
בנוסף, כרומטוגרפיה גז בשילוב ספקטרומטריית מסה (GC-MS) יכול לשמש גם במדידת נוקליאוסיד. מרוויח מזה, האק et. AL. זוהה בהצלחה uridine וחומצת שתן, שהוא מטבוליט במורד הזרם של מסלול קטבולי נוקליאוסיד, בזרעים של A. thaliana12. עם זאת, GC משמש בדרך כלל כדי להפריד תרכובות נדיפות אבל לא מתאים לחומרים labile תרמית. לכן, כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) היא כנראה טכניקה אנליטית מתאימה ומדויקת יותר לזיהוי, הפרדה וכימות של הנוקלאוזידים / נוקלאוטידים13,14. מספר מחקרים קודמים דיווחו כי עמודת HILIC יכולה לשמש עבור נוקלאוזידים ונוקלאוטידיםהפרדת 15,16 ו איסוטופי שכותרתו סטנדרטים פנימיים הועסקו עבור כימות מורכב17. עם זאת, שני הרכיבים יקרים יחסית, במיוחד הסטנדרטים המסחריים עם תווית איזוטופ. כאן, אנו מדווחים על גישה רלוונטית מבחינה כלכלית LC-MS / MS למדידת נוקלאוזידים / נוקלאוטידים. שיטה זו כבר שימשה בהצלחה לכימות של נוקלאוזידים / נוקלאוטידים מגוונים, כולל ATP, N6- מתיל-AMP, AMP, GMP, uridine, ציטידין, פסאודורידין1,5,6,18, בצמחים ו Drosophila. יתר על כן, השיטה שאנו מדווחים כאן ניתן להשתמש אורגניזמים אחרים גם כן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 גידול צמחים ואיסוף חומרים
- ודא כי זרעי Arabidopsis מעוקרים ב 70% אתנול במשך 10 דקות וזרעו על צלחות אגר, אשר הוכנו עם חצי כוח Murashige וחומרים מזינים Skoog.
- דגירה הצלחות המכילות זרעי Arabidopsis תחת כהה ב 4 °C (60 °F) עבור 48 שעות, ולאחר מכן להעביר אותם לתוך תא צמיחה מבוקר תחת 16 שעות אור של 55 μmol m-2 s-1 ב 22 °C (60 °F) ו 8 שעות כהה ב 20 °C (60 °F).
- קציר 100 מ"ג של שתילים 2 שבועות (משקל טרי) להקפיא חנקן נוזלי עבור מיצוי מטבוליטים.
התראה: החוקרים צריכים ללבוש כראוי כפפות, משקפי מגן, וחלוק מעבדה כדי למנוע זיהום רקמת אדם במהלך איסוף החומרים.
2 נוקלאוזידים/מיצוי נוקלאוטידים
- קרקע 100 מ"ג של רקמות צמחיות קפואות עם 7-8 חרוזי פלדה בטחנת מיקסר טרום קר במשך 5 דקות בתדר של 60 הרץ.
- הכן את פתרון החילוץ, המכיל מתנול, אצטוניטריל ומים ביחס של 2:2:1.
- Resuspend החומרים הומוגניים (כולל רוב מטבוליטים אבל לא חלבונים) עם 1 מ"ל של פתרון מיצוי.
- צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך ב 12,000 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- להעביר 0.5 מ"ל של ההשעיה לצינור חדש 1.5 מ"ל להקפיא את החנקן הנוזלי.
- לאדות את המדגם הקפוא במייבש להקפיא resuspend ב 0.1 מ"ל של 5% אצטוניטריל ו 95% מים.
- צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך (0.1 מ"ל) ב 40,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. טען את ה- supernatant בבקבוקון למדידת LC-MS/MS.
מדידת LC-MS/MS
- הכן חיץ אמוניום אצטט 10 מ"מ על ידי המסת 1.1 גרם של אמוניום אצטט ב 2 L של מים כפולים deionized (שלב נייד A). כוונן את ה- pH ל- 9.5 על-ידי 10% אמוניום וחומצת אצטט.
- הכן 2 L של מתנול 100% אולטרה-דק (שלב נייד B1) למדידת נוקלאוזידים. כמו כן, הכן 2 L של אצטוניטריל אולטרה-סגול 100% (שלב נייד B2) למדידת נוקלאוטידים.
- הזרק 0.02 מ"ל של מיצוי מטבוליטים שטופלו מראש של כל דגימה משלב 2.7 למערכת HPLC עם משאבות בינאריות (LC) בשילוב עם ספקטרומטר מסה מרובע משולש (MS).
התראה: מערכת HPLC משתמשת בעמודת C18 (50 x 4.6 מ"מ, גודל חלקיקים 5 מיקרומטר; עבודה ב-25 °C (25 °C) אגירה עם שלב נייד A ו- B1 (איור 1A) להפרדת נוקלאוזידים ולהשתמש בעמודת פחמן גרפיטי נקבובי (PGC) (50 x 4.6 מ"מ, גודל חלקיקים 5 מיקרומטר; עבודה ב 25 °C (70 °F) עם שלב נייד A ו- B2 (איור 1B) עבור הפרדה גרעינית. כל דגימה הוזרקה שלוש פעמים עבור השכפול הטכני. - תכנן את השיטה כפי שמוצג בטבלה 1 עבור העמודה C18 ואת השיטה כפי שמוצג בטבלה 2 עבור העמודה PGC. הגדר קצב זרימה של 0.65 מ"ל מינימום-1.
הערה: המעברים ההמוניים (טבלה 3) היו במעקב על ידי ספקטרומטר מסה. תנאי ניתוח ספקטרום המסה של שמונה נוקלאוזידים וחמישה נוקלאוטידים המכילים נוקלאוטידים קנוניים ונודים רשומים בטבלה 3. - רשום את אזורי השיא של כל מתחם יעד (איור 1).
4 דורות של עקומות הכיול הסטנדרטיות
- בריכה שש עקירות מדגם יחד, אשר יוצרו בעקבות התיאור בסעיף 2, ומערבולת אותו. לאחר מכן, aliquot אותו לשש עקירות (אותו נפח) שוב כדי לקבל כל רקע.
- הוסף שישה ריכוזים שונים של כל תקן אלה שש עקירות, בהתאמה, ולהזריק להם אחד אחד הבא שלב 3.3.
- רשום את אזורי השיא של כל תקן בריכוזים שונים באמצעות המעברים ההמוניים כמתואר בשלבים 3.4 ו- 3.5.
- התווה את אזור השיא כנגד הריכוז הנומינלי של כל תקן כדי ליצור עקומה של שש נקודות.
הערה: אזורי השיא של נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שנרשמו בשלב 3.5 צריכים ליפול בטווח של עקומות כיול סטנדרטיות. - חישוב המשוואה של קו ישר עבור כל תרכובת סטנדרטית: Y = aX + b
5 כימות מטבוליטים
- חשב את תכולת המטבוליטים באמצעות אזור השיא שנרשם בשלב 3.5 והמשוואה משלב 4.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מראים את הזיהוי וכימות של N1- מתילאדנוזין, נוקליאוסיד שונה ידוע, בסוג פראי Arabidopsis בן שבועיים (Col-0) שתילים כדוגמה. פרופיל ספקטרומטריית מסה מציין כי יוני המוצר הנוצרים מתקן N1-methyladenosine הם 150 m/z ו- 133 m/z (איור 2A),ואותו פרופיל נצפה גם בחילוץ Col-0 (איור 2B). בשל שפע גבוה של יון המוצר של 150 m/z, המעבר ההמוני של 282.1 עד 150 (m/z) נבחר לכימות N1-methyladenosine. בנוסף, זמן השמירה (RT) של שיא היעד (איור 3B) הוא 7.05 דקות, זהה ל- RT של תקן N1-methyladenosine (איור 3A). בהתחשב בנתונים שהוזכרו לעיל, אנו מראים כי שתילים מסוג פראי מכילים בריכת vivo N1- מתילאדנוזין.
סדרת ריכוז של תקני N1-methyladenosine (0, 1, 2.5, 5, 10 ו- 50 ng / mL) נוספה לשש עקירות מדגם המיוצרות לאחר שלבים 4.1 ו- 4.2, בהתאמה (איור 4A). 0.02 מ"ל של כל דגימות סטנדרטיות הוזרקו לתוך LC-MS / MS, ואת אזורי השיא המוגברים של N1-methyladenosine זוממים נגד הריכוזים הנומינליים של N1-methyadenosine סטנדרטים. המשוואה של הקו הישר היא Y = 0.0004X - 0.163 (איור 4B).
שלושה שכפולים של שתילים Col-0 חולצו וטופלו מראש כמתואר לעיל. אזור השיא של N1- methyladenosine בשלושת הדגימות הללו נרשמו 8,659, 12,147, ו 12,711. בהתחשב חמש פעמים העשרה במהלך החילוץ (ראה שלבים 2.5 ו 2.6) ושימוש במשוואה Y = 0.0004X - 0.163, N1-ריכוז מתילאדנוזין חושבו בשלוש שורות סוג פראי להיות 0.66, 0.94, ו 0.98 ng / mL, בהתאמה. לפיכך, 100 מ ג של כל שתילים מסוג פראי שימשו לחילוץ לשימוש חוזר ב 1 מאגר מיצוי מ"ל. לכן, 8.6 ± 1.7 ng של N1-מתילאדנוזין היה כמת ב 1 גרם של שתילים בר ערבידופסיס בן שבועיים.
| זמן | קצב זרימה (מינימום mL-1) | שלב א' בנייד (%) | שלב ב' נייד (מתנול %) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
טבלה 1: השיטה עבור העמודה C18. ייצוג סכמטי של שינויי ממס עבור שיווי המשקל של עמודת C18. שלב נייד A = 10 מ"מ אמוניום אצטט, pH 9.5. נייד שלב B = 100% מתנול.
| זמן | קצב זרימה (מינימום mL-1) | שלב א' בנייד (%) | שלב B נייד (אצטוניטריל %) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
טבלה 2: השיטה עבור העמודה PGC. ייצוג סכמטי של שינויים ממס עבור שיווי המשקל של עמודת PGC. שלב נייד A = 10mM אמוניום אצטט, pH 9.5. שלב נייד B = 100% אצטוניטריל.
| נוקלאוזידים/נוקלאוטידים | מעבר מסה (m/z) | קוטביות | מקוטע | אנרגיית התנגשות (eV) | מתח מאיץ תאים | זמן שמירה (מינימום) | חלון שמירה (מינימום) | מצב ניטור | |
| יון מבשר | יון מוצר | ||||||||
| אדנוזין | 268.1 | 136 | חיובי | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | MRM |
| N1- מתאלדנוזין | 282.12 | 150 | חיובי | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | MRM |
| גואנוסין (לא כולל) | 284.1 | 135 | חיובי | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | MRM |
| O6- מתילגואנוסין | 298.12 | 166 | חיובי | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | MRM |
| אינוסינוס | 269.1 | 136.9 | חיובי | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | MRM |
| אורדין (שם שלי) | 245.21 | 133 | חיובי | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | MRM |
| פסאודורידין (שם בדוי) | 245.21 | 125 | חיובי | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | MRM |
| ציטידין (סימפטידין) | 244.2 | 112 | חיובי | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | MRM |
| המגבר | 348.07 | 136 | חיובי | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | MRM |
| GMP (GMP) | 364.07 | 152 | חיובי | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | MRM |
| אימפרה (IMP | 348.9 | 137 | חיובי | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | MRM |
| UMP (100 ק | 325.01 | 212.9 | חיובי | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | MRM |
| CMP (100 ק | 324 | 112 | חיובי | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | MRM |
טבלה 3: תנאי ניתוח MS של נוקלאוזידים ונוקלאוטידים שזוהו על ידי ספקטרומטר מסה. יון מבשר ויון המוצר של שמונה נוקלאוזידים ושישה נוקלאוטידים מפורטים כאן והוא יכול להיות במעקב על ידי טרשת נפוצה לזיהוי וכימות מורכבים.
איור 1: הפסגות הכרומטוגרפיות של שמונה נוקלאוזידים וחמישה נוקלאוטידים. פרופילי ההפרדה של שמונה גרעינים בעמודה C18 (A), וחמישה נוקלאוטידים על ידי עמודת PGC (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהוי של N1-methyladenosine על ידי מעבר המוני. MS/ MS ספקטרום של יון מבשר m/z 282.1 ויוני מוצר m/z 150 ו m/z 133 זוהה מ תקן N1-מתילאדנוזין (A) ו Col-0 דגימות (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הפסגה הכרומטוגרפית של N1-מתאלדנוזין. מעבר המוני של 282.1 ל 150 היה במעקב לכימות N1-methyladenosine. זמני השמירה של פסגות N1-methyladenosine במדידה הסטנדרטית והמדגם היו דומים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דור העקומה הסטנדרטית N1-methyladenosine. (A) שישה ריכוזים שונים של N1-מתילאדנוזין נוספו לשש מטריצות מיצוי מדגם, בהתאמה. והגידול שנוצר באזורי השיא נרשמו. (B) עקומת הכיול של N1-מתילדנוזין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אורגניזמים מכילים נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שונים, כולל נוקלאוטידים קנוניים וחורגים. עם זאת, נקודות הקצה של המקור והמטבוליות שלהם, במיוחד נוקלאוזידים ששונו, עדיין מעורפלים. יתר על כן, ההבנה הנוכחית של הפונקציה ואת הומאוסטזיס של חילוף החומרים נוקלאוזידים / נוקלאוטידים להישאר לחקור ולהרחיב. כדי לחקור אותם, יש צורך בשיטה מדויקת וזהבה לזיהוי וכימות מטבוליטים אלה. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש בספקטרום המסה לגילוי נוקלאוזידים/נוקלאוטידים. אם ניקח N1-מתילדנוזין כדוגמה, שיטה זו יכולה לזהות נמוך כמו 0.02 ng רגיל, ואת הדיוק של עקומת הכיול הוא גבוה למדי (R2 = 0.999; איור 4B). בהשוואה לשיטת HPLC, פרוטוקול מבוסס MS מספק מגבלת זיהוי ודיוק טובים בהרבה. חשוב מכך, שיטה זו יכולה להתבצע בקלות על ידי חוקרים במעבדה ביולוגית שיש לה LC-MS / MS. יתר על כן, זה יכול לשמש גם לזיהוי של מבנים אחרים מטבוליטים ידועים בצמחים.
לכימות המוחלט של תכולת הנוקלאוזידים/נוקלאוטידים, נדרשים כימיקלים סטנדרטיים מסחריים. הם מייצרים את הקימורים הסטנדרטיים הישרים, המאפשרים לחשב את מטבוליטים היעד בדגימות דרך אזורי שיא שנרשמו על ידי ספקטרומטריית מסה. חשוב כי טווח אזורי השיא בעקומות כיול סטנדרטיות צריך לכסות את אזור השיא של קריאת מטבוליט היעד בטרשת נפוצה. יתר על כן, יש להוסיף סדרת ריכוז של תקנים לתוך עקירות המדגם אך לא מומס במים לייצור עקומת כיול. הסיבה לכך היא כי זה ימנע את אפקט המטריצה, וזה משמעותי מאוד עבור דיוק כימות.
השיטה המתוארת כאן מספקת כלי רב עוצמה לכימות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים. היישום שלה יכול להרחיב את כל הצמחים ואפילו אורגניזמים אחרים. כל ההליך של טיפול מקדים של דגימות צריך להישאר קר ומהיר כדי למנוע השפלה מטבוליטים, אם כי מאגר החילוץ מכיל 80% כימיקלים אורגניים, אשר יכול לזרז את רוב החלבונים (אנזימים). עם זאת, שיטה זו אינה מתאימה לזיהוי יעד לא ידוע. הזיהוי והכימות של כימיקל המטרה בשיטה זו תלוי במידה רבה בתקנים הכימיים המסחריים. מגבלה נוספת של שיטה זו היא שהמדידה של נוקלאוזידים ונוקלאוטידים צריכה להיעשות בנפרד על ידי שימוש בעמודת C18 ובעמודת PGC, בהתאמה. הסיבה לכך היא שהביצועים של עמודת C18, אם כי, יציבים יותר וניתן לשחזור מעמודת PGC, האחרונים יכולים להבחין במיוחד בין נוקלאוטידים לטובים בהרבה (איור 1B).
לסיכום, השיטה המוצגת מאפשרת כימות vivo של נוקלאוזידים /נוקלאוטידים בצמחים. מצמיחת שתילים להשגת התוצאות הסופיות, הניסויים יכולים להסתיים בתוך 3 שבועות. דגימות מלאות טרום טיפולים וניתוחים LC-MS/ MS לקחת בערך 2 ימים עבור קבוצה של 10 עד 20 דגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה כספית על ידי קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (KJQN202060), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31900907), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20190528), המרכז הבינלאומי להנדסה גנטית וביוטכנולוגיה (CRP /CHN20-04_EC) ל- M.C., וקרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (LGZD202004) עד X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -P., Herde, M.
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
