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Indução de Microstreaming por Oscilações de Bolhas Não Esféricas em um Sistema de Levitação Acústica

Published: May 9, 2021 doi: 10.3791/62044
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Univ Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Centre Léon Bérard, INSERM, UMR 1032, LabTAU, France, 2Univ Lyon, Ecole Centrale de Lyon, INSA de Lyon, CNRS, LMFA UMR 5509, France

Summary

Uma técnica rápida e confiável é proposta para controlar as oscilações de forma de uma única bolha acústica aprisionada que é baseada na técnica de coalescência entre duas bolhas. As oscilações em forma de bolhas controladas por simetria em estado estacionário permitem a análise do fluxo de fluido gerado nas proximidades da interface de bolhas.

Abstract

Quando localizadas próximas a barreiras biológicas, microbolhas oscilantes podem aumentar a permeabilidade da membrana celular, permitindo a internalização de fármacos e genes. Observações experimentais sugerem que a permeabilização temporária dessas barreiras pode ser devida ao estresse de cisalhamento que é exercido sobre os tecidos celulares por cavitação microstreaming. Microstreaming de cavitação é a geração de fluxos de vórtice que surgem em torno de microbolhas de ultrassom oscilantes. Para produzir tais fluxos de líquidos, as oscilações de bolhas devem desviar-se de oscilações puramente esféricas e incluir uma instabilidade translacional ou modos de forma. Estudos experimentais de escoamentos induzidos por bolhas e tensões de cisalhamento em superfícies próximas são frequentemente restritos em seu escopo devido à dificuldade de capturar deformações de forma de microbolhas de forma estável e controlável. Descrevemos o projeto de uma câmara de levitação acústica para o estudo de oscilações não esféricas controladas por simetria. Esse controle é realizado utilizando-se a técnica de coalescência entre duas bolhas que se aproximam em um campo de ultrassom suficientemente intenso. O controle de oscilações não esféricas abre caminho para um microfluxo de cavitação controlado de uma microbolha livre de superfície oscilante. Câmeras de alta taxa de quadros permitem investigar quase simultaneamente a dinâmica de bolhas não esféricas na escala de tempo acústica e o fluxo de líquido em uma escala de tempo mais baixa. Mostra-se que uma grande variedade de padrões de fluidos pode ser obtida e que eles estão correlacionados com o conteúdo modal da interface de bolhas. Demonstramos que mesmo os modos de forma de alta ordem podem criar padrões de fluidos de grande distância se a dinâmica da interface contiver vários modos, destacando o potencial de oscilações não esféricas para liberação de fármacos direcionados e localizados.

Introduction

Na medicina, um medicamento administrado deve penetrar em muitos obstáculos no sistema vivo antes de atingir os alvos desejados. No entanto, a maioria das drogas são rapidamente limpas longe da corrente sanguínea. A eficiência do direcionamento é baixa e eles não podem atravessar facilmente as membranas celulares, levando à entrega ineficaz de drogas. Atualmente, o uso de microbolhas em combinação com o ultrassom tem sido proposto como um método inovador para a liberação não invasiva, precisa e direcionada de fármacos e genes para tecidos e célulaspatológicas1. Nesta abordagem, as microbolhas podem desempenhar um papel como transportadores onde as drogas livres são co-injetadas com uma suspensão de bolha de gás ou carregadas em sua superfície. As microbolhas também podem atuar como um vetor local para redirecionar a energia do ultrassom, a fim de interagir com as células. Basicamente, sob exposição ao ultrassom, as bolhas se comprimem e se expandem de forma estável, um regime chamado cavitação estável que gera fluxos de líquido e, portanto, estresse de cisalhamento em objetos próximos. As microbolhas também podem oscilar de forma não linear e expandir-se até o colapso, em regime de cavitação inercial, produzindo ondas de choque que se propagam radialmente a partir do local do colapso2. Tem sido demonstrado que a cavitação, estável ou inercial, aumenta a permeabilização das membranas celulares e, assim, aumenta a internalização de fármacos na célula3.

Em aplicações terapêuticas, entender o mecanismo da interação célula-bolha é muito importante, mas existem várias barreiras, tanto do lado científico quanto técnico, que impedem que nosso conhecimento avance. Primeiro, capturar a dinâmica das células em resposta a estímulos mecânicos induzidos por bolhas é muitodifícil4. Na escala de tempo acústica, as oscilações de microbolhas de primeira ordem podem levar à ativação de canais de membrana, facilitando a passagem molecular através de interfaces biológicas. Isso ocorre por meio da oscilação direta da membrana celular, também chamada de "massagem celular"5. A ativação do canal após estresse mecânico direto foi evidenciada usando técnicas de patch-clamp que mediram as propriedades eletrofisiológicas das membranas celulares durante e após a exposição ao ultrassom6. A medição da dinâmica celular induzida por bolhas (ou seja, o campo completo de deformação da membrana celular) na escala de tempo acústica também forneceria informações sobre o limiar de expansão da área da membrana Δ A/A necessário para induzir poros na membrana celular7. A segunda barreira é controlar o regime de bolhas em colapso para evitar a lise celular induzida por microbolhas. Colapsos de bolhas e microjatos induzidos têm sido identificados como mecanismo pelo qual ocorre perfuração da membrana 8,9. Uma vez permeabilizada, a membrana celular se repara através do auto-selamento das bicamadas lipídicas com cálcio e fusão das vesículas intracelulares9. A ocorrência de colapsos de bolhas também pode causar danos letais à célula e induzir efeitos colaterais desnecessários nas vizinhas. Em aplicações sensíveis, como a abertura da barreira hematoencefálica mediada por ultrassom, é geralmente aceito que colapsos de bolhas inerciais devem ser evitados10.

Portanto, grandes esforços são atualmente dedicados ao projeto de sequências de emissão de ultrassom, juntamente com o monitoramento e controle passivo da cavitação, a fim de garantir oscilações estáveis dasmicrobolhas11. Nesse regime estável, foi levantada a hipótese de que bolhas oscilantes estáveis desempenham um forte papel no desencadeamento da permeabilização da membrana, promovendo tensões de cisalhamento espacialmente direcionadas na membrana celular7. A tensão de cisalhamento resulta dos fluxos de líquidos criados nas proximidades das bolhas oscilantes. Esses fluxos líquidos são chamados de cavitation microstreaming, e, como mencionado acima, são um dos vários mecanismos possíveis responsáveis pelo aumento da captação de moléculas extracelulares. Quando se trata de suspensão de bolhas ou células, como ensaios de transfecção biológica in vitro12, a permeabilização por microstreaming pode ser muito mais eficiente do que a permeabilização por colapso de bolhas. Isso pode ser demonstrado por uma simples consideração geométrica. Em suspensões celulares, a sonoporação será eficiente se a maioria das células em suspensão for submetida a efeitos mecânicos suficientemente grandes (levando à permeabilização da membrana). Sabe-se que os colapsos de bolhas são direcionados na direção da quebra de simetria isotrópica, como o eixo parede-bolhas13 ou a linhagem bolha-bolha e célula-bolha unindo seu centro de massa14. O microjato produzido é, portanto, um fenômeno espacialmente localizado ao longo de um número finito de linhas que unem os centros celulares e de bolhas. Dependendo da concentração celular e de bolhas, bem como da distância célula-bolha, esse efeito pode não ser o mais eficiente para permeabilizar todo o número de células em suspensão. Em contraste, o microfluxo de cavitação é um fenômeno que ocorre em uma escala de tempo lenta, com uma grande expansão espacial em comparação com o raio da bolha. Além disso, o fluxo de líquido é distribuído por toda a bolha, podendo, portanto, impactar um número maior de células, em um intervalo muito longo. Portanto, entender o microfluxo de cavitação gerado em torno de uma bolha oscilante é um pré-requisito para controlar e quantificar a tensão de cisalhamento induzida por bolhas que é aplicada às células.

Para tanto, uma etapa preliminar consiste em controlar as oscilações esféricas e não esféricas de uma bolha impulsionada por ultrassom, uma vez que os fluxos líquidos gerados são induzidos pelo movimento da interface da bolha15,16. Em particular, as oscilações de forma das microbolhas devem ser acionadas e mantidas estáveis. Além disso, a orientação das oscilações da forma da bolha deve ser controlada para analisar adequadamente a correlação entre a dinâmica da interface da bolha e o padrão de microstreaming induzido. Ao resumir a literatura existente, é óbvio que resultados experimentais detalhados de microfluxo induzido por cavitação estão disponíveis apenas para bolhas presas a uma superfície. Microbolhas acopladas à parede são comumente usadas para avaliar a dinâmica precisa da interface e interações celulares na escala micrométrica sob um sistema de microscopia ultrarrápida. Essa configuração é terapeuticamente relevante quando se considera microbolhas vibratórias localizadas na membrana celular17,18,19. O estudo da bolha acoplada ao substrato pode, no entanto, tornar a análise da dinâmica das bolhas mais complicada, em parte devido à natureza complexa da dinâmica das linhas de contato20 e ao desencadeamento de modos de forma assimétricos21. Em aplicações médicas e biológicas, bolhas que não estão presas a uma parede são comumente encontradas em geometrias confinadas, como pequenos vasos. Isso afeta significativamente a dinâmica das bolhas e as instabilidades de forma. Particularmente, a presença de uma parede próxima desloca o limiar de pressão para o acionamento do modo de forma para valores de pressão mais baixos, dependendo do número do modo de forma e do tamanho da bolha22. A parede também afeta o microfluxo induzido por bolhas com possivelmente maior intensidade para o fluxo produzido23.

Entre todos os cenários possíveis que as microbolhas podem experimentar (livres ou presas, próximas a uma parede, colapsando ou oscilando de forma estável), propomos investigar a dinâmica não esférica de uma única bolha longe de qualquer fronteira. O arranjo experimental é baseado em um sistema de levitação acústica24 no qual uma onda de ultrassom estacionária é usada para aprisionar a bolha. Esse cenário é consistente com aplicações médicas em que uma coleção de bolhas e células suspensas coexistem em uma câmara de sonotransfecção, por exemplo. Na medida em que bolhas e células não estão muito próximas, supõe-se que a presença de uma célula não afeta a dinâmica da interface de bolhas. Quando as células seguem as trajetórias em loop do microfluxo induzido por cavitação, elas estão ciclicamente se aproximando e repelindo do local da bolha e podemos supor que a presença celular não impacta nem o padrão de fluxo nem sua velocidade média. Além disso, a dinâmica não esférica e o microfluxo induzido a partir de bolhas únicas longe da fronteira são bem conhecidos do ponto de vista teórico. Para ligar o fluxo de líquido induzido por bolhas à dinâmica do contorno de bolhas, é necessário caracterizar com precisão a dinâmica da interface de bolhas. Para tanto, é preferível adaptar a escala espaço-temporal em estudos experimentais em relação àquelas utilizadas na terapêutica para que a aquisição com câmeras comuns de alta velocidade (abaixo de 1 milhão de frames/segundo) seja possível utilizando grandes bolhas excitadas em frequências mais baixas. Ao considerar bolhas não revestidas, a autofrequência ω n de um dado modo n está relacionada ao tamanho da bolha como Equation 125. Essa relação rádio-autofreqüência é ligeiramente modificada quando se consideram bolhas descascadas26, mas a ordem de grandeza da autofreqüência ωn permanece a mesma. Assim, investigar bolhas com raios de equilíbrio ~50μm em um campo de ultrassom de 30 kHz é semelhante ao estudo de bolhas revestidas de raios ~3μm em um campo de 1,7 MHz, como proposto por Dollet et al.27. Números de modo de forma semelhantes e, portanto, padrões de microstreaming são, portanto, esperados.

Para desencadear oscilações não esféricas da interface de bolhas, é necessário exceder um determinado limiar de pressão que é dependente do raio, como mostrado na Figura 1. As técnicas experimentais existentes baseiam-se no aumento da pressão acústica para desencadear modos de superfície (ilustrado pelo caminho (1) na Figura 1), seja pelo aumento passo a passo da pressão28 ou pela excitação de amplitude modulada responsável pelo início periódico e extinção dos modos de superfície29. As principais desvantagens dessas técnicas são (i) uma orientação aleatória do eixo de simetria das oscilações da superfície que não pode ser controlada para estar no plano da imagem, (ii) uma curta vida útil das oscilações da forma da bolha que dificulta a análise dos fluxos de líquido induzidos em escalas de tempo maiores, e (iii) o desencadeamento frequente de modos de forma instáveis. Propomos uma técnica alternativa para cruzar o limiar de pressão a uma pressão acústica constante no mapa de raio/pressão, como ilustrado pelo caminho (2) na Figura 1. Para isso, é necessário aumentar o tamanho da bolha de forma que ela fique na zona de instabilidade. Tal aumento é realizado por uma técnica de coalescência de bolhas. A coalescência de duas microbolhas, inicialmente oscilantes esfericamente, é explorada para criar uma única bolha deformada. Se a pressão acústica e o tamanho da bolha coalescida estiverem na zona de instabilidade, os modos de superfície serão acionados. Também evidenciamos que a técnica de coalescência induz oscilações de forma estáveis em regime de estado estacionário, bem como um eixo de simetria controlado definido pelo movimento retilíneo das duas bolhas que se aproximam. Como uma oscilação de forma estável é garantida ao longo de minutos, a análise do fluxo de fluido induzido por bolhas é possível semeando o meio líquido com micropartículas fluorescentes, iluminadas por uma fina folha de laser. O registro do movimento das micropartículas sólidas nas proximidades da interface de bolhas permite identificar o padrão do fluxo de fluido induzido30. O princípio geral do desencadeamento de oscilações em forma de bolha, levando a um fluxo de fluido estável no tempo, é ilustrado na Figura 2.

No protocolo a seguir, descrevemos os passos necessários para criar oscilações estáveis em forma de bolhas através da técnica de coalescência e descrevemos as medidas de fluxo de fluido. Isso inclui o projeto do sistema de levitação acústica, a calibração acústica, a nucleação de bolhas e a técnica de coalescência, a medição da dinâmica da interface de bolhas e do fluxo de fluido circundante e o processamento de imagens.

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Protocol

1. Projeto da câmara de levitação acústica

  1. Projetar um tanque cúbico opticamente transparente (semelhante ao PMMA) (8 cm de borda e 2,8 mm de espessura por face) com o módulo de geometria de um software de simulação multifísica (Tabela de Materiais).
  2. Inserir uma superfície cilíndrica (Ø = 35 mm) centrada no fundo do tanque, para modelar o transdutor ultrassônico.
  3. Ajuste as condições de contorno para pressão zero em cada parede com um deslocamento normal de amplitude de 1 μm na superfície do transdutor.
  4. Usando um módulo no domínio da frequência, simule a Função de Resposta de Frequência (FRF) do tanque na faixa de frequência [10 - 40] kHz, nos três locais arbitrários loc1 = (0,01375, 0,01375, 0,04125), loc2 = (0, 0, 0,0088) e loc3 = (0,021725, 0,023375, 0,00935).
  5. Adaptar o tamanho do tanque de forma que um dos modos acústicos da cavidade corresponda à frequência nominal do transdutor (aqui 31,2 kHz). O FRF contém, portanto, um pico de ressonância próximo a essa frequência, conforme ilustrado na Figura 3.
  6. Plote o campo de pressão dentro do tanque, como mostrado na Figura 4. O modo de ressonância escolhido deve conter pelo menos um antinó de pressão no interior do recipiente, no qual a bolha acústica será aprisionada.
  7. Ao projetar o tanque, projete uma face superior móvel com um sulco de guia em cada borda para fechar firmemente as faces do tanque. Faça um pequeno furo na face superior para encher o tanque com o meio líquido.
  8. Coloque a caixa d'água em cima de uma estrutura caseira que contenha o transdutor de ultrassom (tipo Langevin, frequência nominal de 31,2 kHz). Use gel ecográfico para acoplar o transdutor à parede inferior do tanque.
  9. Coloque o tanque e o sistema de quadro sobre uma mesa de deslocamento de três direções com parafusos micrométricos.
  10. Encha o tanque com água microfiltrada, desmineralizada e (não desgaseificada, volume ~500mL, saturação de oxigênio de aproximadamente 8 mg· L-1).
    NOTA: O uso de água não desgaseificada em vez de desgaseificado torna possível a manutenção de bolhas estáveis durante os experimentos. O uso de água desgaseificada acelerará o encolhimento de bolhas devido à difusão de gás, mesmo que ligeiramente contrabalançado pela difusão retificada (mediada por ultrassom).

2. Geração de bolhas e calibração acústica

  1. Preparar o arranjo experimental usado para nucleação de bolhas induzida por laser, excitação acústica e gravação em alta velocidade (Figura 5a,b,c). O arranjo experimental consiste em (A) o sistema de levitação acústica, (B) a fonte de alimentação do laser e (C) a cabeça do laser, (D) uma lente côncava esférica, (E) uma lente plano-côncava e uma lente asférica, (F) a câmera de alta velocidade, (G) o diodo emissor contínuo de luz. Posteriormente, para as medidas dos fluxos líquidos (Figura 5d) (H) será adicionada uma fonte de laser de onda contínua, (I) uma lente cilíndrica plano-côncava seguida de uma lente cilíndrica plano-côncava inserida atrás da primeira lente e orientada no eixo ortogonal.
  2. Conecte o transdutor de ultrassom a um gerador de funções. Defina o sinal de excitação como: forma de onda senoidal, onda contínua, frequência 31,2 kHz. A amplitude é o único parâmetro variável.
  3. Coloque a lente (D) a uma distância de aproximadamente 6 cm à frente da cabeça do laser (C).
  4. Coloque a lente (E) a uma distância de aproximadamente 12 cm à frente da lente (D).
  5. Coloque o tanque de água (A) de tal forma que um ponto de foco do laser esteja localizado dentro do tanque de água, levando à geração de faísca para cada pulso de laser (5 -10 mJ). A faísca do laser deve estar localizada aproximadamente 3 cm abaixo do antinó de pressão alvo.
    NOTA: Sem ultrassom (US), a bolha nucleada por laser subirá para a face superior devido à flutuabilidade.
  6. Ligue o transdutor de ultrassom. Aumente a tensão aplicada até que a bolha não sobe mais verticalmente, mas seja desviada em direção ao antinó de pressão e, para uma pressão alta suficiente, presa.
  7. Ajuste a iluminação retroiluminada (diodo emissor de luz contínua) e a câmera de alta velocidade para observar a bolha presa.
    NOTA: Ao nuclear uma nova bolha com uma faísca de laser, é fácil capturar a trajetória da bolha se aproximando de seu local de aprisionamento.
  8. Mova a localização da faísca laser dentro do tanque de água de modo que a trajetória da bolha permaneça dentro do plano focal da câmera.
  9. Aprisione uma bolha e capture suas oscilações radiais com os seguintes parâmetros: tamanho do quadro 128 x 128 pixels, taxa de aquisição 180 kHz. Um exemplo de oscilações radiais de grande amplitude ao longo de dois períodos acústicos é apresentado na Figura 6. O tamanho típico das bolhas de gás varia de 30 a 80 μm.
  10. Registre as oscilações radiais da bolha durante 3 a 30 milissegundos para capturar centenas a milhares de oscilações de bolhas. Repita esta gravação para aumentar as tensões aplicadas do transdutor. As tensões aplicadas típicas estão na faixa de 0 - 8 V.
    NOTA: Ao modificar a tensão aplicada, o local de equilíbrio da bolha aprisionada move-se ligeiramente verticalmente. Para acompanhar as oscilações sem mover a iluminação retroiluminada e a câmera, coloque o sistema (transdutor e caixa d'água) em uma mesa móvel de três direções com precisão micrométrica.
  11. Ligue o transdutor de ultrassom e capture uma imagem do fundo para pós-análise.
  12. Pós-processar a série de vídeos seguindo este procedimento:
    1. Execute o arquivo executável VoltagePressure.exe. A interface mostrada na Figura 7 deve abrir.
      Observação : o script está disponível como um documento suplementar.
    2. Especificar os parâmetros físicos e experimentais na coluna da esquerda (Figura 7A).
    3. Especifique os valores de tensão aplicada para a série de gravações na tabela inferior direita (Figura 7B).
    4. No painel Análise do raio de bolhas , clique em Parâmetros de carregamento (Figura 7C) e selecione a pasta que contém todos os arquivos da sua série de vídeos e, em seguida, a imagem de fundo (obrigatória).
    5. A escolha é permitida entre analisar todos os vídeos de uma só vez, clicando em Automático, ou um a um, clicando em Passo a passo.
    6. Para cada arquivo de vídeo, a evolução do raio da bolha é plotada ao longo de um período acústico, e um ajuste numérico é sobreposto. A curva vermelha corresponde a uma modelagem linearizada de Rayleigh-Plesset. O raio da bolha de equilíbrio é exibido (Figura 7D).
    7. De acordo com o ajuste numérico, a pressão aplicada para esta tensão é exibida no painel do gráfico Pressão (Tensão) (Figura 7E). O valor da pressão aplicada também é exibido na tabela inferior direita (Figura 7B). As pressões aplicadas típicas correspondentes à dinâmica de tensão de 0 - 8 V são de 0 - 25 kPa.
    8. Depois que todos os vídeos forem processados, clique no botão Regressão linear para realizar um ajuste linear da curva de pressão/tensão. Os dados (valores de tensão e pressão) são salvos em um arquivo .txt localizado no diretório atual. A inclinação do encaixe é fornecida.

3. Técnica de coalescência

  1. Ligue o transdutor de ultrassom. Ajuste a tensão aplicada suficientemente alta para que a pressão acústica correspondente possa levar ao desencadeamento da instabilidade superficial, de acordo com o diagrama numérico pressão/raio das zonas de instabilidade, como mostra a Figura 8.
  2. Nuclear uma bolha, que então migrará para seu local de captura. Se a bolha presa exibir apenas oscilações esféricas, passe para a próxima etapa. Se aparecerem oscilações não esféricas:
    1. Desligue a alimentação do ultrassom para deixar a bolha subir até a superfície superior.
    2. Modifique a energia do laser (ajustando finamente em alguns mJ) ou reduza a tensão do transdutor.
    3. Ligue a alimentação do ultrassom.
    4. Nuclear uma nova bolha.
    5. Repita este procedimento até que o tamanho da bolha leve a oscilações puramente esféricas.
  3. Quando uma bolha presa exibe apenas oscilações esféricas, gere uma nova faísca de laser. Quando a nova bolha atinge o local de aprisionamento, ocorre coalescência.
  4. Se a bolha coalescida exibir apenas oscilações esféricas, gere uma nova bolha. Coalescências múltiplas podem ser necessárias para atingir o raio da bolha no qual ocorrem deformações não esféricas. Um exemplo de coalescência de bolhas levando a oscilações não esféricas é mostrado na Figura 9.
  5. Uma vez que a bolha coalescida exibe oscilações não esféricas, registre as oscilações da bolha por uma duração de aproximadamente 3 a 30 milissegundos.
  6. Identifique o número de modo das oscilações da forma consultando a Figura 10.

4. Medições de fluxo de fluido

  1. No caso de medições de microfluxo de cavitação, partículas traçadoras fluorescentes devem ser adicionadas à água antes da nucleação de bolhas. Neste estudo, são utilizadas partículas de 0,71 μm (Tabela de Materiais). Eles são suficientemente pequenos para serem acusticamente transparentes (não influenciados pela força de radiação acústica) e para acompanhar com precisão o fluxo, bem como suficientemente grandes para espalhar a luz laser. Utilizar três gotas para o volume da caixa d'água, correspondendo a aproximadamente 2,104 partículas/mm3.
  2. Antes de fazer as medições, defina os seguintes parâmetros para capturar a dinâmica da bolha (escala de tempo rápida) e o fluxo de fluido (escala de tempo baixa):
    1. Crie um particionamento do disco de gravação da câmera.
    2. Alternativamente, defina os parâmetros de gravação como:
      1. Taxa de quadros 180 kHz, tamanho do quadro 128 x 128 pixels e tempo de exposição 1 μs para uma gravação da dinâmica da interface de bolhas
      2. Taxa de quadros de 600 Hz, tamanho de quadro de 1024 x 768 pixels e tempo de exposição de 1 ms para uma gravação do movimento dos traçadores de corante.
  3. Use um laser contínuo.
  4. Crie uma folha de laser fina deixando sucessivamente o feixe de laser passar através de lente cilíndrica plano-côncava e lente cilíndrica plano-convexa orientada em um eixo ortogonal. Uma largura de feixe de cerca de 160 μm pode ser obtida.
  5. Configure a folha de laser para corresponder ao plano de imagem:
    1. Coloque o laser em um dispositivo móvel para que a folha de laser possa ser movida paralelamente ao plano de imagem.
    2. Ajuste a posição para que as partículas iluminadas sejam visíveis pela câmera.
    3. Nuclear e prender uma bolha.
    4. Ajuste ainda mais a posição da folha de laser, para que uma sombra se torne visível atrás da bolha. A bolha está agora dentro da folha de laser, como mostrado na Figura 11.
  6. Induza a coalescência de bolhas até que um modo de forma oscilante estável seja aparente.
  7. Faça várias gravações alternando entre dinâmica de bolhas e microstreaming.
    NOTA: Desligue o laser contínuo quando não for necessário. O aquecimento pode criar fluxos convectivos indesejados. Além disso, desligue o diodo emissor de luz ao realizar as medições de fluxo de fluxo.

5. Processamento de imagens para visualização dos padrões de microstreaming de cavitação

  1. Instale o software de visualização ImageJ para processamento e análise de imagens em Java. Instale também o plugin CINE File Reader para abrir os arquivos da câmera de alta velocidade.
  2. Clique em Arquivo | Importação | CineFile e selecione o vídeo *.cine contendo a captura do movimento das partículas.
  3. Selecione Usar pilha virtual na nova janela, o vídeo agora é carregado.
  4. Para observar o movimento das partículas sem exibir o padrão de streaming, clique em Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste | Auto. O fundo escuro agora é substituído por uma imagem otimizada automaticamente.
  5. Para exibir o padrão resultante, clique em Imagem | Pilhas | Projeto Z e escolha a opção Intensidade máxima para a projeção da imagem. Uma imagem de saída com pixels contendo o valor máximo sobre todas as imagens na pilha é exibida. Ajuste o contraste da imagem conforme descrito na etapa 5.4, se necessário.
    NOTA: Um padrão de streaming como os mostrados na Figura 12b e na Figura 12d é obtido.

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Representative Results

Uma sequência completa de coalescência de bolhas levando a oscilações não esféricas estáveis no tempo, controladas por simetria, é apresentada na Figura 9. A fase de aproximação de duas bolhas oscilantes esfericamente termina quando o fino filme líquido entre as duas bolhas é rompido. Vale notar que, no último estágio anterior à coalescência, as interfaces de bolhas se desviam da esfericidade. Ambas as bolhas se alongam em uma forma elipsoidal ao longo do caminho do movimento retilíneo de aproximação. Após o momento de coalescência, uma única bolha permanece e exibe oscilações não esféricas com uma forma complexa durante alguns períodos acústicos. Este corresponde ao regime transitório de oscilações, seguindo a excitação de qualquer sistema dinâmico. Após uma dúzia a cem períodos acústicos, as oscilações de forma se estabilizam em uma oscilação de estado estacionário, aqui mostrada para um modo 4, como pode ser deduzido da interpretação da Figura 10. Esse modo pode persistir por milhares de períodos acústicos, por vários milissegundos a alguns minutos. Isso permite as medições quase simultâneas de fluxos de líquidos induzidos por bolhas.

Uma vez que uma bolha é aprisionada e exibe oscilações de forma constantes, o movimento dos traçadores fluorescentes nas proximidades da bolha é capturado, como mostrado na Figura 11. Em primeiro lugar, a ausência de movimento de partículas para uma bolha exibindo oscilações puramente esféricas é consistente com vários modelos de microstreaming de cavitação31 que evidenciam que nenhuma vorticidade é induzida por oscilações radiais puras. Quando ocorrem oscilações de forma, o movimento do líquido é produzido nas proximidades da interface de bolhas, como mostrado na Figura 12. O registro alternativo da dinâmica da interface de bolhas na escala de tempo acústica (Figura 12a,c) e do movimento das partículas em uma escala de tempo mais baixa (Figura 12b,d) permite correlacionar o padrão de microstreaming a um dado número de modo de forma. A Figura 12a apresenta uma série instantânea da dinâmica das bolhas para uma bolha de raio médio R0=70,5 μm, acionada à pressão acústica Pa=12,8 kPa, que está oscilando predominantemente em um modo 3. O padrão de microstreaming associado, na Figura 12b, consiste em seis lóbulos. A conservação do eixo de simetria entre as oscilações do modo de forma e o padrão de microstreaming é claramente visível. A Figura 12c apresenta uma série instantânea da dinâmica da bolha para uma bolha de raio médio R0=55,7 μm, acionada à pressão acústica Pa=23,6 kPa, que está oscilando predominantemente em um modo 4. O padrão de microstreaming associado na Figura 12d consiste em oito pequenos lóbulos do tamanho do diâmetro da bolha. Mais uma vez, a conservação do eixo de simetria entre as oscilações do modo de forma e o padrão de microstreaming é claramente visível. Esses resultados parecem confirmar que quanto maior a ordem dos modos de forma, menor o padrão de microstreaming e mais confinados eles estão na vizinhança da bolha.

Essa suposição de um padrão de streaming mais estreito para modos de ordem mais alta não é tão óbvia e depende do conteúdo modal da dinâmica da interface de bolha. De fato, devemos lembrar que o fluxo de líquido induzido por bolhas resulta das interações entre dois modos de forma oscilando na mesma frequência, ou da auto-interação de um modo consigo mesmo31. Uma bolha oscilando predominantemente em um dado modo de forma, por exemplo, consideremos um modo 3, também pode excitar outras oscilações não esféricas através do acoplamento não linear entre modos29. Se a dinâmica da interface de bolha contiver modos suplementares, como o segundo e o quarto (por exemplo), então o fluxo de microfluxo pode ser significativamente modificado devido às múltiplas interações entre modos que gerariam padrões específicos. Isso é ilustrado na Figura 13 para duas bolhas oscilando predominantemente em um modo 3, que induzem dois padrões diferentes de microstreaming. Na Figura 13a,b,c, uma bolha de raio de equilíbrio R0 = 70,1 μm, acionada à pressão acústica Pa=12,4 kPa, oscilando no modo 3, apresenta um padrão tipo lóbulo. A análise da dinâmica da interface (Figura 13b) revela que os modos predominantes são o radial (oscilando na frequência de condução f 0), o translacional (modo com número 1, oscilando na metade da frequência de condução f 0), o terceiro (oscilando em f 0/2) e um quarto e sexto modos relativamente pequenos (ambos oscilando em f 0). Pode-se hipotetizar que a principal contribuição para o fluxo de microstreaming é a interação entre o modo radial e os modos 4 e 6, levando a um padrão do tipo lóbulo31. Na Figura 13d,e,f, uma bolha de raio de equilíbrio R0 = 68,6 μm, acionada à pressão acústica Pa = 13,3 kPa, oscilando no modo 3, apresenta padrão tipo transversal, com extensão de fluxo de grande distância. A análise da dinâmica da interface (Figura 13d) revela que os modos predominantes são o radial, o translacional (modo com número 1), o terceiro e o sexto. De acordo com a alta amplitude do modo 3, pode-se hipotetizar que a principal contribuição para o fluxo de microfluxo é a auto-interação do modo 3, levando a um padrão do tipo cruzado32.

Figure 1
Gráfico 1. Ilustração do método para disparar oscilações de forma. O mapa de pressão/raio contém uma zona de instabilidade por modo de um determinado grau. O limiar de pressão para atingir essa zona pode ser ultrapassado (1) aumentando a pressão acústica aplicada que impulsiona uma bolha de gás de raio fixo, até que os modos de forma apareçam, ou (2) aumentando o tamanho da bolha a uma pressão acústica aplicada constante. Esse aumento no volume da bolha ocorre lentamente quando ocorre a difusão retificada, enquanto a coalescência da bolha prende significativamente o processo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Gráfico 2. Ilustração da técnica de coalescência de bolhas. A fase de aproximação (A) consiste na nucleação a laser de duas bolhas que se encontram no mesmo local de aprisionamento dentro do recipiente. Quando se encontram, ocorre coalescência: a ruptura do fino filme líquido entre bolhas (B) leva à geração de uma única bolha, inicialmente deformada. Essa bolha deformada é conduzida pelo campo de ultrassom monocromático e exibe inicialmente oscilações transitórias (C), antes de entrar no regime de estado estacionário. No regime de estado estacionário (D), a bolha coalescida exibe oscilações de forma estáveis no tempo, controladas por simetria. Ao semear o meio com nanopartículas fluorescentes, o fluxo de fluido induzido por bolhas é capturado (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Gráfico 3. Função de Resposta de Frequência do campo de pressão dentro do sistema de levitação. A amplitude da pressão acústica é apresentada em função da frequência, para três locais dentro do tanque correspondentes às seguintes coordenadas (x,y,z): (1) azul, (2,05,2,05,6)cm, (2) vermelho, (0,0,1,28)cm e (3) preto, (3,23,3,48,1,36)cm, onde a origem do sistema de coordenadas é tomada no centro da face inferior do tanque cúbico. Perto de 31,5kHz, um modo de ressonância é claramente visível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Gráfico 4. Distribuição da pressão acústica dentro da câmara de levitação. (A) Representação tridimensional do campo de pressão dentro do tanque de água cúbico para o modo de ressonância selecionado. Este modo ocorre na frequência de 31,2 kHz correspondente à frequência da fonte de ultrassom. (B) Distribuição da pressão acústica no plano diagonal do tanque. (C) Distribuição da pressão acústica em plano horizontal (altura z=constante). A altitude foi escolhida de tal forma que corresponde à localização do antinó de pressão na parte superior do tanque. As amplitudes da barra de cor são obtidas impondo-se um deslocamento normal de 1 μm na superfície do transdutor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Gráfico 5. Fotografias e esquemas do arranjo experimental. É constituído por (A) o sistema de levitação acústica, (B-C) o amplificador laser pulsado e a cabeça do laser, (D-E) o conjunto de lentes de focalização, (F) a câmera de alta velocidade, (G) o diodo emissor de luz, (H) o laser de onda contínua e (I) o conjunto de lentes modeladoras. a) Um lado e b) uma vista superior da configuração experimental. (c) Ilustração dos materiais necessários para capturar as oscilações das bolhas. Observe que o laser contínuo (H) é desligado durante este processo. d) Ilustração dos materiais necessários para a captura dos fluxos de líquidos. Note que o laser pulsado (C) para nucleação de bolhas é desligado, enquanto o laser contínuo (H) para gerar uma folha de laser iluminando os traçadores de micropartículas está ligado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Gráfico 6. Série instantânea de uma bolha acionada por ultrassom exibindo oscilações esféricas de grande amplitude. O raio de equilíbrio da bolha é de ~60 μm, e a pressão acústica de condução é de ~15 kPa. O intervalo de tempo entre duas imagens sucessivas é de 5,6 μs. Toda a série corresponde a dois períodos acústicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Gráfico 7. Painel de interface do script executável PVR_Interface.exe. O script lança uma Interface Gráfica do Usuário que contém (A) um painel para ajuste dos parâmetros físicos, (B) uma tabela para ajuste da tensão elétrica aplicada aos transdutores, (C) a possibilidade de carregar todo o conjunto de vídeos gravados que são pós-processados e fornecem o raio de bolha de equilíbrio (D) e a pressão acústica aplicada (B), o gráfico da relação pressão/tensão (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Gráfico 8. Diagrama pressão/raio das zonas de instabilidade. Cada área colorida corresponde a uma zona de instabilidade para um determinado modo de forma: (área azul) Modo 2, (área verde) Modo 3 e (área vermelha) Modo 4. A área branca corresponde ao caso em que as microbolhas exibem apenas oscilações esféricas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Gráfico 9. Série instantânea de uma coalescência de bolhas levando a oscilações de forma. Após a fase de aproximação de duas bolhas, o filme fino entre elas é rompido e ocorre coalescência. Uma única bolha é agora conduzida pelo campo de ultrassom, primeiro em um regime de oscilação transitória. Após alguns períodos acústicos o regime de estado estacionário é estabelecido em um modo de forma axiossimétrica, aqui o modo 4. O intervalo de tempo entre duas fotografias sucessivas é de 30 μs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10. Os cinco primeiros modos de forma axiossimétrica, incluindo o modo radial. Vista lateral do contorno da interface de bolha mostrada em dois extremos da amplitude de oscilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Gráfico 11. Partículas traçadoras fluorescentes ao redor de microbolhas que oscilam esfericamente. Ambas as imagens correspondem a uma superposição de 100 instantâneos cobrindo 0,25s. a) Não se pode observar qualquer movimento das partículas traçadoras se não estiverem presentes oscilações de forma. b) Pode surgir um fluxo médio de parasitas visível em todo o campo de visão, por exemplo, devido ao aquecimento da folha de lase. Esse fluxo, no entanto, não está ligado ao movimento da bolha. Em ambas as imagens, a sombra induzida pela folha de laser atrás da bolha é claramente visível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Gráfico 12. Registro quase simultâneo da dinâmica da bolha e do microstreaming induzido. Coluna da esquerda: Série instantânea de uma bolha exibindo oscilações de modo de forma de ordem 3 (a) e o microstreaming induzido (b). Coluna da direita: Série instantânea de uma bolha exibindo oscilações de modo de forma de ordem 4 (c) e o microstreaming induzido (d). Para todas as figuras, a linha tracejada vermelha corresponde ao eixo de simetria das oscilações da forma da bolha e dos fluxos de líquido, determinado pelo movimento retilíneo das duas bolhas que se aproximam antes da coalescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 13
Gráfico 13. Exemplo de dois padrões de streaming induzidos por uma bolha oscilando predominantemente em um modo 3. a,d) Ilustração e snaphot da interface de bolha, (b,e) a decomposição de modo da interface de bolha e (c,f) o padrão de streaming associado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O procedimento apresentado consiste em utilizar coalescência de bolhas para desencadear oscilações em forma de bolhas em estado estacionário, controladas por simetria, permitindo o estudo do fluxo de fluido de longa duração induzido por essas oscilações. O principal desafio da técnica é o controle de oscilações não esféricas para uma bolha ser aprisionada, longe de quaisquer limites.

A maioria das técnicas existentes propostas na literatura enfocou bolhas acopladas aosubstrato7,16, pois a ausência de movimento do centro da bolha facilita a captação de sua interface na escala de tempo acústica (até centenas de kHz). Embora exceder o limiar de pressão necessário para acionar modos de forma seja uma tarefa fácil neste caso, o controle das oscilações de forma é complicado devido à quebra de simetria induzida pelo substrato. Uma bolha acoplada à parede está entrando em contato com o substrato com um ângulo de contato particular, levando ao desencadeamento de modos de superfície assimétricos21. Além da complexidade da interpretação dos modos tridimensionais assimétricos com apenas uma visão de câmera, surge a transição abrupta para um regime caótico de oscilação da superfície33. Portanto, o principal desafio consiste em capturar oscilações de forma de uma única bolha aprisionada longe de quaisquer limites, a fim de obter oscilações axiossimétricas não esféricas. Tais condições permitem a comparação entre experimentos e a grande variedade de estudos analíticos disponíveis na literatura. A principal dificuldade experimental está na estabilidade posicional da microbolha. Para superar esse problema, pinças ópticas têm sido usadas para controlar o aprisionamento de bolhas34, e campos de ultrassom modulados em amplitude são usados para aprisionar e conduzir oscilações de bolhas29. Em ambos os casos, uma única bolha é aprisionada e modos não esféricos são acionados. Além disso, no caso do campo de condução modulado em amplitude, os modos de forma só existem por um pequeno período de tempo, pois periodicamente começam e desaparecem. Além disso, a orientação das oscilações em forma de bolha não é controlada e leva a um viés na análise do movimento da interface.

A alternativa que propomos é o uso de um laser pulsado para nuclear uma única bolha, posteriormente aprisionada em um antinó de pressão de uma câmara de levitação de ressonância. Ao nuclear bolhas sucessivas ao longo do tempo, cada bolha nucleada se move em direção ao seu local de aprisionamento, que já está ocupado por outra bolha. A coalescência ocorre e induz uma interface de bolhas inicialmente deformada. Se a pressão motriz for suficientemente forte, as oscilações de forma são sustentadas. A nucleação a laser tem sido preferida a outras técnicas de nucleação, como a eletrólise, por exemplo, pois permite a geração rápida e confiável de bolhas. Como ilustrado na Figura 9, o eixo de simetria das oscilações de forma é dado pelo eixo de aproximação de bolhas antes da coalescência. No entanto, esse resultado importante requer um tempo relativamente longo para a configuração do arranjo experimental, pois é necessário que as bolhas permaneçam dentro do plano focal da câmera durante a fase de aproximação da coalescência (a fim de orientar o eixo de simetria nesse plano). Para isso, pequenas mudanças no local de nucleação da bolha são feitas a fim de otimizar o caminho ao longo do qual as bolhas se movem e se encontram. A mudança para o local de nucleação de bolhas requer uma modificação fina da localização do tanque em relação ao caminho do laser, e é realizada com um estágio de três direções com precisão micrométrica. Além disso, o ajuste fino da energia do laser é realizado para otimizar o tamanho da bolha nucleada. Bolhas muito grandes gerarão imediatamente modos de forma com alto número de modo e se aproximarão da ressonância volumétrica de bolhas. Isso leva a uma alta instabilidade posicional do centro da bolha. Bolhas muito pequenas exigirão um grande número de processos de coalescência antes de atingir o tamanho apropriado para acionar modos de forma.

A principal vantagem da técnica proposta é o estabelecimento de um regime de estado estacionário para oscilações de forma controladas por simetria. Como o movimento da interface é sustentado por um tempo relativamente longo (de segundos a minutos), a captura do fluxo de fluido induzido por bolhas é possível alternando a configuração experimental para o rastreamento de nanopartículas fluorescentes semeadas no meio líquido. Vale ressaltar que não existem estudos experimentais de microstreaming induzido por uma bolha em um líquido infinito até o momento na literatura. Além disso, mesmo quando o microstreaming de cavitação é investigado para bolhas acopladas ao substrato, a análise é limitada a observações qualitativas sem considerar a ligação com a dinâmica da bolha16. A medição do movimento das partículas é realizada em uma fina folha de laser fornecida por um laser de onda contínua. Uma vez que é necessário realizar quase simultaneamente (i) a nucleação a laser por laser pulsado, (ii) o rastreamento de partículas com uma folha de laser e (iii) o registro pela câmera de alta velocidade, especial atenção deve ser dada à potencial obstrução dos materiais ao redor do tanque de água. Isso leva a uma configuração compacta com muitas restrições na disposição dos dispositivos, como mostra a Figura 5. Ao capturar um padrão de microstreaming induzido por uma bolha oscilante de forma, é necessário acompanhar alternativamente a dinâmica da interface da bolha, como mencionado na etapa 4.2. De fato, alternar entre sequências alternativas de dinâmica de bolhas e visualização de fluxo de fluido permite associar com segurança o padrão de microstreaming a uma dada oscilação de forma. Este procedimento alternativo é obrigatório, pois (i) as oscilações de forma podem se desligar, (ii) a estabilidade da bolha pode aumentar abruptamente levando à instabilidade posicional da bolha, (iii) a bolha pode se fragmentar quando ocorrem grandes deformações. Mesmo que esses eventos sejam raros, é importante verificar se a dinâmica da bolha permanece a mesma, gravando-a antes e depois de filmar o padrão de microstreaming. (Desta forma, pode-se garantir que o movimento da bolha e o padrão estão realmente correlacionados).

Evidencia-se que uma bolha oscilando predominantemente sobre um dado número de modo leva a um padrão particular de microstreaming, como mostrado na Figura 12. O padrão é único e depende do conteúdo modal do movimento da interface. Como ilustrado na Figura 13, o mesmo número de modo predominante pode induzir vórtices de grande ou pequena distância, dependendo do número, amplitude e fase dos modos secundários que são excitados.

Essas observações podem ter uso prático em aplicações médicas, como a liberação de medicamentos direcionada e localizada mediada por ultrassom, por exemplo. Sabe-se que as bolhas atuam como vetores de permeabilização das tight junctions entre as células e até mesmo da própria membrana celular, levando à sonoporação1. No caso de microbolhas oscilantes estáveis, esse fenômeno pode ser induzido pelos gradientes de tensão de cisalhamento ou tensão de cisalhamento35 induzidos por oscilações de bolhas, através da geração de fluxos de microfluxos. Lembramos que o microstreaming é um fenômeno não linear, de segunda ordem. A princípio, escalar os padrões de fluxo observados para o obtido para microbolhas terapêuticas, descascadas, com tamanhos menores (raio de ~3 μm) não é simples. Já evidenciamos na introdução como a dinâmica não esférica de bolhas livres ou revestidas de uma ordem de magnitude de diferença de tamanho pode ser dimensionada: a autofrequência ω n de um dado modo n está relacionada ao tamanho da bolha como Equation 125. Em Dollet et al.27, modos de forma de ordem 4 foram capturados para bolhas micrométricas revestidas excitadas a 1,7 MHz, semelhante ao número de modo de forma observado em nosso experimento. Além disso, a pressão aplicada difere fortemente, pois pressões de até 200kPa são necessárias para desencadear modos de forma em microbolhas de contrasteultrassonográfico 27. Na configuração proposta, a pressão máxima aplicada não excede 25 kPa. A forte diferença na pressão aplicada resulta do desencadeamento de instabilidades superficiais, pois os modos de forma aparecem acima de um determinado limiar de pressão. Para as condições experimentais de 1,7 MHz dadas em Dollet e col. 27, demonstrou-se que o limiar de pressão que leva à instabilidade da forma é em torno de 150 kPa para um modo 436. Para uma frequência de condução de 30 kHz, apenas uma amplitude de campo de condução de 10 kPa é necessária para desencadear a instabilidade da forma em uma bolha de ~50 μm. Uma vez desencadeada, a instabilidade da forma se desenvolve após alguns ciclos acústicos, e demonstra uma saturação de platô da amplitude do modo. A saturação da amplitude foi observada tanto para bolhas livres 24,29 quanto para bolhas revestidas27. Indica a possibilidade de atingir oscilações de forma em estado estacionário para bolhas livres ou revestidas, com oscilações de forma tão grandes quanto 25 a 50% da amplitude do modo radial27,37. Usando nossa abordagem experimental, chegamos a deformações extremas de forma na configuração,Equation 2 (onde a n é a amplitude do modo de forma), como ilustrado na Figura 13.

Em síntese, o arranjo experimental proposto permite dimensionar as principais características das oscilações não esféricas das microbolhas, mesmo para tamanhos que variam com quase uma ordem de magnitude. Em relação ao fluxo de microfluxo, a escala da velocidade do fluxo pode ser investigada para bolhas exibindo oscilações laterais e radiais7, ou um modo não esférico que é auto-interagindo32. Em ambos os casos, as velocidades de transmissão escalam como v ~ ωR0 a i a j, onde i, j denota as amplitudes de modo consideradas normalizadas pelo raio da bolha. Para valores semelhantes do parâmetro de expansão não esférica ai, velocidades de fluxo idênticas são obtidas quando ωR0 ~ Constante. Comparando nossas condições experimentais com a utilizada para microbolhas com casca terapêutica27, as predições teóricas das velocidades de fluxo diferem apenas de um fator 2,5. Medidas de velocidades de fluxo por velocimetria de rastreamento de partículas levaram a estimativas da magnitude da velocidade de 1mm/s na configuração aqui apresentada. Esse valor é semelhante ao obtido na pesquisa de microstreaming induzido por contrasteultrassonográfico 19. Em relação à organização espacial do padrão de fluxo, a distribuição angular dos vórtices de fluxo ao redor da interface de bolhas é independente do raio da bolha31. Apenas a expansão radial do campo de streaming é afetada pela modificação do tamanho da bolha. Essa expansão radial escala como Equation 3, onde é um coeficiente ligado ao número da moda investigada. É claro que a forma geral do padrão de fluxo é conservada, pois a expansão radial é governada pelo raio de bolha R0. No entanto, como ilustrado na Figura 13, o padrão de streaming pode diferir significativamente mesmo quando se considera o mesmo número de modo de forma. A Figura 13 destaca o enorme impacto da dinâmica da interface de bolhas no padrão de fluxo e, particularmente, na taxa espacial de mudança no campo de velocidade. A distribuição espacial da tensão de cisalhamento, ou gradiente de tensão de cisalhamento, tem sido indicada como um indicador apropriado da eficiência da sonoporação35. Em nossa configuração experimental proposta, apenas a tensão de cisalhamento no fluido do volume pode ser avaliada nesta etapa. Uma maior extensão da tensão de cisalhamento da parede exigiria a adição de uma superfície próxima à bolha. É previsível que uma superfície nas proximidades da bolha perturbe a estabilidade posicional da bolha modificando localmente o campo de onda estacionária. Garantir a estabilidade da bolha a uma distância próxima de uma parede ainda é um desafio que pode ser parcialmente resolvido adicionando um campo de ultrassom secundário dedicado ao aprisionamento de bolhas com um comprimento de onda idêntico à distância da parede da bolha. Esta câmara de levitação acústica de dupla frequência já foi projetada para investigar a dinâmica de pares de bolhas e as forças de interação38. Infelizmente, a grande diferença de tamanho entre as bolhas investigadas aqui e as células biológicas (raio típico ~10μm) impossibilita o uso direto deste arranjo experimental para investigações biológicas. No entanto, esperamos que nossos resultados experimentais em combinação com os desenvolvimentos teóricos mais recentes sobre microstreaming induzido por bolhas ajudem a melhorar essa modelagem, bem como forneçam confiança na predição teórica de gradientes de tensão de cisalhamento induzidos por bolhas ou tensões de cisalhamento nas proximidades de uma membrana celular.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo LabEx CeLyA da Universidade de Lyon (ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspherical lens Thorlabs AL4050 Lens of focus 40 mm
Continuous wave laser source CNI MLL6FN DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LJ1277L1-A lens of focus -25?4mm
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LK1900L1 lens of focus 250 mm
Fluorescent particles Duke Scientific R700 Red polymer fluorescent microspheres
Function generator Agilent HP33120 Generator of function feeding the ultrasound transducer
High-speed camera Vision Research Phantom v12.0 High-speed recording up to 1 Mfps
Liquid medium Carlo Erba Water for analysis Demineralized, undegassed water
Multiphysics software Comsol None Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber
Nd:Yag pulsed laser New Wave Research Solo III-15 5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ
Plano-concave lens Thorlabs N-BK7 lens of focus 125 mm
Spherical concave lens Thorlabs N-SF11 Bi-concave lens of focus -25mm
Ultrasound transducer SinapTec Custom-made Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter
Visualization software NIH ImageJ Software for image processing and analysis in Java
XY Linear stage Newport M-406 Displacement stage with micrometric screw
Z-axis linear stage Edmund Optics 62-299 Vertical displacement stage with micrometric screw

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Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Induction of Microstreaming by Nonspherical Bubble Oscillations in an Acoustic Levitation System. J. Vis. Exp. (171), e62044, doi:10.3791/62044 (2021).

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