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Biology

जैविक ऊतक नमूनों के सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम)

Published: March 26, 2021 doi: 10.3791/62045
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 3,4, 1,4
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम), एक शक्तिशाली 3 डी इमेजिंग तकनीक का उपयोग करने के लिए एक नियमित विधि को रेखांकित करता है। एसबीएफ-एसईएम का सफल अनुप्रयोग उचित निर्धारण और ऊतक धुंधला तकनीकों पर टिका है, साथ ही इमेजिंग सेटिंग्स पर सावधानीपूर्वक विचार करना। इस प्रोटोकॉल में इस प्रक्रिया की संपूर्णता के लिए व्यावहारिक विचार शामिल हैं।

Abstract

धारावाहिक ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) सैकड़ों से हजारों धारावाहिक-पंजीकृत अल्ट्रास्ट्रक्चरल छवियों के संग्रह के लिए अनुमति देता है, जो ऊतक माइक्रोएनाटॉमी के अभूतपूर्व त्रि-आयामी दृश्य की पेशकश करता है। जबकि एसबीएफ-एसईएम ने हाल के वर्षों में उपयोग में घातीय वृद्धि देखी है, इस इमेजिंग मोडलि14 की सफलता के लिए उचित ऊतक तैयारी और इमेजिंग पैरामीटर जैसे तकनीकी पहलू सर्वोपरि हैं। यह इमेजिंग सिस्टम डिवाइस की स्वचालित प्रकृति से लाभान्वित होता है, जिससे एक ही दिन में सैकड़ों छवियों के स्वचालित संग्रह के साथ इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान माइक्रोस्कोप को उपेक्षित छोड़ने की अनुमति होती है। हालांकि, उचित ऊतक तैयारी के बिना सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर को इस तरह से बदला जा सकता है कि गलत या भ्रामक निष्कर्ष निकाले जा सकते हैं। इसके अतिरिक्त, छवियों को राल-एम्बेडेड जैविक नमूने के ब्लॉक-फेस को स्कैन करके उत्पन्न किया जाता है और यह अक्सर चुनौतियों और विचारों को प्रस्तुत करता है जिन्हें संबोधित किया जाना चाहिए। इमेजिंग के दौरान ब्लॉक के भीतर इलेक्ट्रॉनों का संचय, जिसे "ऊतक चार्जिंग" के रूप में जाना जाता है, इसके विपरीत नुकसान और सेलुलर संरचना की सराहना करने में असमर्थता का कारण बन सकता है। इसके अलावा, जबकि इलेक्ट्रॉन बीम तीव्रता बढ़ाने/वोल्टेज या बीम स्कैनिंग गति कम छवि संकल्प में वृद्धि कर सकते हैं, यह भी राल ब्लॉक को नुकसान पहुंचाने और इमेजिंग श्रृंखला में बाद की छवियों को विकृत करने का दुर्भाग्यपूर्ण दुष्प्रभाव हो सकता है । यहां हम जैविक ऊतक नमूनों की तैयारी के लिए एक नियमित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करता है और ऊतक चार्जिंग को कम करता है। हम ऊतक ब्लॉक को न्यूनतम क्षति के साथ उच्च गुणवत्ता वाले धारावाहिक-छवियों के तेजी से अधिग्रहण के लिए इमेजिंग विचार भी प्रदान करते हैं।

Introduction

सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) को पहली बार १९८१ में Leighton द्वारा वर्णित किया गया था, जहां उन्होंने एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप को एक इन-बिल्ट माइक्रोटॉम के साथ संवर्धित किया था जो राल में एम्बेडेड ऊतकों के पतले वर्गों को काट सकता है और छवि सकता है । दुर्भाग्य से, तकनीकी सीमाओं प्रवाहकीय नमूनों के लिए इसके उपयोग को प्रतिबंधित, जैसे जैविक ऊतक के रूप में गैर-प्रवाहकीय नमूने चार्जिंग (ऊतक नमूने के भीतर इलेक्ट्रॉन बिल्डअप)1के अस्वीकार्य स्तर जमा होते हैं। जबकि सुखाया कार्बन कम ऊतक चार्ज के साथ कटौती के बीच ब्लॉक-चेहरा कोटिंग, यह बहुत बढ़ी इमेजिंग अधिग्रहण समय और छवि भंडारण के रूप में एक समस्या बनी रही के रूप में समय पर कंप्यूटर प्रौद्योगिकी के लिए बड़ी फ़ाइल डिवाइस द्वारा बनाई गई आकार का प्रबंधन अपर्याप्त था । इस पद्धति को 2004 में डेंक और हॉर्स्टमैन द्वारा एक परिवर्तनीय दबाव कक्ष2से लैस एसबीएफ-एसईएम का उपयोग करके फिर से गौर किया गया था। यह इमेजिंग कक्ष जो नमूने के भीतर चार्ज कम कर देता है करने के लिए पानी वाष्प की शुरूआत के लिए अनुमति दी, गैर प्रवाहकीय नमूनों की इमेजिंग बनाने हालांकि छवि संकल्प की हानि के साथ व्यवहार्य । ऊतक तैयार करने और इमेजिंग विधियों में और सुधार अब उच्च वैक्यूम का उपयोग करके इमेजिंग की अनुमति देते हैं, और एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग अब3,4, 5,6,7,8,9को नष्ट करने के लिए जल वाष्प पर निर्भर नहीं करता है। जबकि एसबीएफ-एसईएम ने हाल के वर्षों में उपयोग में घातीय वृद्धि देखी है, इस इमेजिंग मोडलि14 की सफलता के लिए उचित ऊतक तैयारी और इमेजिंग पैरामीटर जैसे तकनीकी पहलू सर्वोपरि हैं।

एसबीएफ-एसईएम हजारों सीरियल-पंजीकृत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के स्वचालित संग्रह के लिए अनुमति देता है, जिसमें प्लानर संकल्प 3-5 एनएम10,11के रूप में छोटा है। ऊतक, भारी धातुओं के साथ गर्भवती और राल में एम्बेडेड, एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) के भीतर रखा जाता है जिसमें हीरे के चाकू से लगे अल्ट्रामाइक्रोटोम होते हैं। एक सपाट सतह हीरे के चाकू से काटी जाती है, चाकू मुकर जाता है, और ब्लॉक की सतह को ऊतक अल्ट्रास्ट्रक्चर की छवि बनाने के लिए इलेक्ट्रॉन बीम के साथ एक रैस्टर पैटर्न में स्कैन किया जाता है। ब्लॉक तो जेड-धुरी, एक "जेड कदम के रूप में जाना जाता है में एक निर्दिष्ट राशि (जैसे, १०० एनएम) उठाया है, और एक नई सतह कटौती से पहले प्रक्रिया दोहराया है । इस तरह ऊतक को काटते ही छवियों का 3-आयामी (3डी) ब्लॉक तैयार किया जाता है। यह इमेजिंग सिस्टम डिवाइस की स्वचालित प्रकृति से आगे लाभ उठाता है, जिससे एक ही दिन में सैकड़ों छवियों के स्वचालित संग्रह के साथ इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान माइक्रोस्कोप को उपेक्षित छोड़ने की अनुमति देता है।

जबकि एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग मुख्य रूप से ब्लॉक-फेस की छवि बनाने के लिए बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉनों का उपयोग करता है, इमेजिंग प्रक्रिया12के दौरान माध्यमिक इलेक्ट्रॉन उत्पन्न होते हैं। माध्यमिक इलेक्ट्रॉन बैकस्कैटर और प्राथमिक-बीम इलेक्ट्रॉनों के साथ जमा हो सकते हैं जो ब्लॉक से बच नहीं पाते हैं, और "ऊतक चार्जिंग" का उत्पादन करते हैं, जो ब्लॉक-फेस पर स्थानीयकृत इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षेत्र का कारण बन सकता है। यह इलेक्ट्रॉन संचय छवि को विकृत कर सकता है या इलेक्ट्रॉनों को ब्लॉक से बाहर निकाल सकता है और बैकस्कैटर डिटेक्टर द्वारा एकत्र किए गए सिग्नल में योगदान दे सकता है, जिससे सिग्नल-टू-शोर अनुपात13कम हो जाता है। जबकि ऊतक चार्जिंग के स्तर को इलेक्ट्रॉन बीम वोल्टेज या तीव्रता को कम करके कम किया जा सकता है, या बीम निवास समय को कम कर सकता है, इसके परिणामस्वरूप सिग्नल-टू-शोर अनुपात14कम हो जाता है। जब कम वोल्टेज या तीव्रता के इलेक्ट्रॉन बीम का उपयोग किया जाता है, या बीम को केवल कम अवधि के लिए प्रत्येक पिक्सेल अंतरिक्ष के भीतर रहने की अनुमति दी जाती है, तो ऊतक से कम बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉनों को बाहर निकाला जाता है और इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर द्वारा कब्जा कर लिया जाता है जिसके परिणामस्वरूप एक कमजोर संकेत होता है। Denk और Horstmann चैंबर में पानी वाष्प शुरू करने से इस समस्या से निपटा, जिससे चैंबर में प्रभारी को कम करने और छवि संकल्प की कीमत पर ब्लॉक चेहरे पर । 10-100 पीए के एक कक्ष दबाव के साथ, इलेक्ट्रॉन बीम का एक हिस्सा छवि शोर और संकल्प की हानि में योगदान देता है, हालांकि यह नमूना कक्ष में आयनों का उत्पादन करता है जो नमूना ब्लॉक2के भीतर चार्ज को बेअसर करता है। नमूना ब्लॉक के भीतर चार्ज बेअसर करने के लिए हाल के तरीकों इमेजिंग के दौरान ब्लॉक-फेस पर नाइट्रोजन के फोकल गैस इंजेक्शन का उपयोग करें, या जांच-बीम-लदान ऊर्जा को कम करनेऔर6,7,15एकत्र किए गए सिग्नल को बढ़ाने के लिए एसबीएफ-एसईएम चरण में नकारात्मक वोल्टेज शुरू करें। ब्लॉक सतह पर चार्ज बिल्डअप को कम करने के लिए चरण पूर्वाग्रह, कक्ष दबाव या स्थानीयकृत नाइट्रोजन इंजेक्शन शुरू करने के बजाय, राल मिश्रण में कार्बन शुरू करके राल की चालकता को बढ़ाना भी संभव है, जो अधिक आक्रामक इमेजिंग सेटिंग्स16के लिए अनुमति देता है। निम्नलिखित सामान्य प्रोटोकॉल 2010 में प्रकाशित डियरिंक एट अल प्रोटोकॉल का अनुकूलन है और इसमें ऊतक ों की तैयारी और इमेजिंग पद्धतियों में संशोधन शामिल हैं जो हमने उच्च संकल्प छवि अधिग्रहण 3 , 17 , 18,19कोबनाए रखते हुए ऊतकचार्जिंगको कम करने के लिए उपयोगी पाया। जबकि ऊतक प्रसंस्करण और भारी धातु गर्भवती पर ध्यान केंद्रित पहले उल्लिखित प्रोटोकॉल, यह प्रोटोकॉल इमेजिंग, डेटा विश्लेषण और पुनर्निर्माण कार्यप्रवाह एसबीएफ-एसईएम अध्ययनों में निहित अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हमारी प्रयोगशाला में, इस प्रोटोकॉल को कॉर्निया और पूर्वकाल खंड संरचनाओं सहित विभिन्न ऊतकों पर सफलतापूर्वक और पुन: लागू किया गया है, पलक, लैक्रिमल और कठिन ग्रंथि, रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका, दिल, फेफड़े और वायुमार्ग, गुर्दे, जिगर, क्रेमास्टर मांसपेशी, और सेरेब्रल कॉर्टेक्स/मेडुला, और माउस, चूहा, खरगोश, गिनी सुअर, मछली, मोनोलेयर और स्तरीकृत सेल संस्कृतियों, सुअर, गैर मानव रहनुमा, साथ ही मानव20,21,22,23सहित प्रजातियों की एक किस्म में । जबकि छोटे परिवर्तन विशिष्ट ऊतकों और अनुप्रयोगों के लिए सार्थक हो सकते हैं, यह सामान्य प्रोटोकॉल हमारे कोर इमेजिंग सुविधा के संदर्भ में अत्यधिक प्रजनन योग्य और उपयोगी साबित हुआ है।

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Protocol

सभी जानवरों को विजन और नेत्र अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए विजन और नेत्र विज्ञान बयान में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन में वर्णित दिशा निर्देशों के अनुसार संभाला गया और ऑप्टोमेट्री पशु हैंडलिंग दिशा निर्देशों के ह्यूस्टन कॉलेज के विश्वविद्यालय । सभी पशु प्रक्रियाओं को उन संस्थानों द्वारा अनुमोदित किया गया था जिनमें उन्हें संभाला गया था: माउस, चूहा, खरगोश, गिनी पिग और गैर-मानव रहनुमा प्रक्रियाओं को ह्यूस्टन विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, जेब्राफिश प्रक्रियाओं को DePauw विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, और सुअर प्रक्रियाओं को बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा मंजूरी दी गई थी । मानव ऊतक पर अनुसंधान के बारे में हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार सभी मानव ऊतक को संभाला गया था और उचित संस्थागत समीक्षा बोर्ड अनुमोदन प्राप्त किया गया था।

1. टिश्यू प्रोसेसिंग

  1. डीडीएच 2 ओ में सोडियम कैकोडिलेट पाउडर मिलाकर 0.4 मीटर सोडियम कैकोडिलेट बफर का स्टॉक घोल तैयार करें अच्छीतरहसे बफर मिलाएं और पीएच समाधान को 7.3 में समायोजित करें। इस बफर का उपयोग फिक्सेटिव (चरण 1.3 में नीचे वर्णित संरचना), धोने बफर, साथ ही ऑस्मियम और पोटेशियम फेरोसायनाइड समाधान बनाने के लिए किया जाता है।
    नोट: पर्फ्यूजन निर्धारण अक्सर एसबीएफ-एसईएम अध्ययनों के लिए निर्धारण का सबसे अच्छा तरीका होता है, क्योंकि निर्धारण तेजी से और पूरे शरीर में होता है। यदि आपके अध्ययन डिजाइन के भीतर परफ्यूजन निर्धारण संभव नहीं है, तो चरण 1.3 पर छोड़ दें।
  2. पशु मॉडल 24 , 25,26के लिए उपयुक्त शारीरिक दबाव के साथ परफ्यूजन निर्धारण करें । यह पृछता के साथ ट्रांसकार्डियल अनुक्रमिक परफ्यूजन के माध्यम से किया जाता है जिसके बाद फिक्सेटिव, प्रत्येक जीव के ऊपर एक विशिष्ट ऊंचाई (उदाहरण के लिए, 100 सेमी) पर रखा जाता है (पशु मॉडल में संवहनी प्रणाली के शारीरिक दबाव के लिए उपयुक्त), फिक्स्ड बायां वेंट्रिकल में बहने के साथ, और दाएं एट्रीम में बने चीरा से बाहर निकल जाता है। ब्याज के ऊतकों के रूप में रक्त फिक्सेटिव के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है पीला हो जाएगा, अगर सभी या अपने ऊतकों का एक हिस्सा ब्लैंच नहीं करता है तो ऊतक उचित रूप से तय नहीं किया जा सकता है और अल्ट्रास्ट्रक्चर संरक्षित नहीं किया जा सकता है ।
  3. 2 मिमी x 2 मिमी x 2 मिमी से बड़ा ब्लॉक में ऊतक नमूनों को ट्रिम करने के लिए एक रेजर ब्लेड या शार्प स्केलपेल का उपयोग करें। यदि चरण 1.2 को छोड़ दिया गया था, तो इसे तेजी से करें ताकि ऊतक को जितनी जल्दी हो सके तय किया जा सके।
    1. वैकल्पिक रूप से, सुधारक के तहत ऊतक को काटना और विसर्जन प्रक्रिया को पूरा करने के लिए ताजा सुधारक में स्थानांतरित करना। फिक्सेटिव की अंतिम संरचना में 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट बफर होता है जिसमें 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड और 2 एमएमएम कैल्शियम क्लोराइड होता है। फिक्सेशन को कमरे के तापमान पर न्यूनतम 2 घंटे और अधिकतम रात 4 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने दें। यदि संभव हो, तो फिक्सिंग करते समय नमूनों को धीरे से उत्तेजित करने के लिए एक घुमाव/झुकाव प्लेट का उपयोग करें ।
    2. वैकल्पिक रूप से, यदि एक इन्वर्टर माइक्रोवेव उपलब्ध है, तो 1 मिनट के 4 चक्रों के लिए 150 वाट पर वैक्यूम के तहत उपरोक्त फिक्सेटिव में ऊतक को ठीक करें, 1 मिनट की छुट्टी। माइक्रोवेव फिक्सेशन चरण 1.3 के लिए पसंदीदा तरीका है क्योंकि यह तेजी से ऊतक को ठीक करता है और ऊतक अल्ट्रास्ट्रक्चर27को संरक्षित करता है।
      नोट: ऊतक को इस प्रोटोकॉल के दौरान सूखने की अनुमति कभी नहीं दी जानी चाहिए, ऊतक को एक समाधान से अगले समाधान में जल्दी स्थानांतरित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
  4. 0.1 मीटर सोडियम कैकोडिलेट बफर में कमरे के तापमान पर 3 मिनट प्रत्येक (15 मिनट कुल) के लिए फिक्स्ड ऊतक 5x धोएं जिसमें 2 एमएमएम कैल्शियम क्लोराइड होता है।
  5. निम्नलिखित ऑस्मियम फेरोसाइनाइड समाधान को ताजा बनाएं, अधिमानतः पिछले धोने के चरणों के दौरान। 4 एमएम कैल्शियम क्लोराइड के साथ 0.2 एम कैकोडिलेट बफर में 3% पोटेशियम फेरोसाइनाइड की बराबर मात्रा के साथ 4% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड समाधान (डीडीएच 2 ओ में तैयार) मिलाएं। पिछले धोने के कदम के बाद, इस समाधान में ऊतक को अंधेरे में बर्फ पर और धुएं के हुड में 1 घंटे के लिए रखें।
    नोट: ऑस्मियम टेट्रोक्साइड एक पीला क्रिस्टलीय पदार्थ है जो एम्पुल में आता है। ऑस्मियम टेट्रोएक्साइड समाधान बनाने के लिए, एम्पुल को खोलें, डीएच2ओ जोड़ें, और अंधेरे में 3-4 घंटे के लिए सोनिकेट करें जब तक कि क्रिस्टल पूरी तरह से भंग न हो जाएं। ऑस्मियम टेट्रोक्साइड समाधान एक स्पष्ट पीला समाधान है, यदि समाधान काला है तो ऑस्मियम को कम कर दिया गया है और अब इसका उपयोग नहीं किया जाना चाहिए।
  6. जबकि ऊतक ऑस्मियम फेरोसाइनाइड समाधान में इनक्यूबेटिंग कर रहा है, थिओकार्बोहाइड्रेजाइड (TCH) समाधान तैयार करना शुरू करें। इस घोल को ताजा तैयार करें और इसे 1 घंटे के ऑस्मियम फेरोसाइनाइड निर्धारण अवधि के अंत में आसानी से उपलब्ध करें। 0.1 ग्राम थिओकार्बोहाइड्राज़ाइड को 10 एमएल डीडीएच2ओ के साथ मिलाएं और इस समाधान को 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि समाधान भंग हो जाए, हर 10 मिनट में धीरे-धीरे घूमता है। उपयोग करने से पहले, इस समाधान को 0.22 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  7. TCH में इनक्यूबेटिंग करने से पहले, कमरे के तापमान के साथ ऊतक धो 2 O5x3 मिनट प्रत्येक (कुल) के लिए ।
  8. कमरे के तापमान पर कुल 20 मिनट के लिए फ़िल्टर किए गए TCH समाधान में ऊतक रखें(चित्रा 1A-C)।
  9. TCH में इनक्यूबेशन के बाद, कमरे के तापमान ddH2O में 3 मिनट प्रत्येक (15 मिनट कुल) के लिए ऊतक 5x धोएं ।
  10. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड (पोटेशियम फेरोसाइनाइड के साथ कम ऑस्मियम नहीं) युक्त डीडीएच2ओ में ऊतक रखें। यह धूम हुड में और अंधेरे में किया जाना चाहिए क्योंकि ओस्मियम को प्रकाश (उदाहरण के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के तहत)(चित्रा 1D-F)द्वारा कम किया जा सकताहै।
  11. इनक्यूबेशन ऑस्मियम टेट्रोक्साइड के बाद, कमरे के तापमान डीडीएच2ओ में प्रत्येक (15 मिनट कुल) 3 मिनट के लिए ऊतक 5x धोएं।
  12. ऊतक को 1% जलीय यूरेसिल एसीटेट (डीएच2ओ में मिश्रित यूरेसिल एसीटेट पाउडर) में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में रखें।
  13. रेफ्रिजरेटर से टिश्यू हटाने से ठीक पहले फ्रेश वॉल्टन का लेड एस्पार्टेट सॉल्यूशन तैयार करें । 0.03 मीटर एस्पपार्टिक एसिड समाधान (10 मिली मिलियन पानी में 0.04 ग्राम एस्पार्टिक एसिड) के 10 एमएल में 0.066 ग्राम लीड नाइट्रेट को भंग करके शुरू करें और 1 एन कोह (10 5611 ग्राम में डिस्टिल्ड पानी) के साथ पीएच को 5.5 में समायोजित करें।
    सावधानी: पीएच को समायोजित करते समय एक तेज़ी बन सकती है। यह स्वीकार्य नहीं है ।
    1. एक हलचल बार का उपयोग करना, पीएच की निगरानी करते हुए धीरे-धीरे 1 एन कोह ड्रॉपवाइज जोड़ें। 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में तैयार स्पष्ट लीड एस्पार्टेट समाधान को प्री-हीट करें। यदि एक तेज़ रूपों समाधान का उपयोग नहीं किया जा सकता है और एक और समाधान तैयार किया जाना चाहिए ।
  14. फ्रिज से ऊतक निकालें और कमरे के तापमान ddH2O में 3 मिनट प्रत्येक (15 मिनट कुल) के लिए 5x धोएं ।
  15. धोने के बाद, ऊतक को गर्म वाल्टन के लीड एस्पार्टेट समाधान में 30 मिनट के लिए रखें, जबकि तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  16. वाल्टन के नेतृत्व में इनक्यूबेशन के बाद, कमरे के तापमान में 3 मिनट (15 मिनट कुल) के लिए ऊतक 5x धोएं , कमरे के तापमान में ddH2O(चित्रा 1G-I)।
  17. एक बर्फ ठंडा एसीटोन श्रृंखला (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 95%, 100%, और 100% एसीटोन (डीडीएच2ओ में जहां लागू हो) के माध्यम से ऊतक को निर्जलित करें।
  18. बर्फ-ठंड निर्जलीकरण श्रृंखला के बाद, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान एसीटोन में ऊतक रखें।
    1. इस दौरान एंबेड 812 एसीएम राल तैयार करें। "हार्ड मिक्स" नुस्खा का उपयोग करें क्योंकि यह बीम क्षति के लिए अधिक प्रतिरोधी है। राल को अच्छी तरह से मिलाएं, और ऊतक को 4 घंटे के लिए एम्बेड 812:एसीटोन (1:3 मिश्रण) में रखें, इसके बाद एम्बेड 812:एसीटोन (1:1 मिश्रण) 8 घंटे या रात भर के लिए, और अंत में रात भर 812:एसीटोन (3:1 मिश्रण) एम्बेड करें। कमरे के तापमान पर इन राल घुसपैठ कदम प्रदर्शन करते हैं।
  19. अगले दिन, ऊतक को 4-8 घंटे के लिए 812 एम्बेड 812 में रखें, फिर ताजा 100% एम्बेड में रात भर 812 एम्बेड करें, और अंत में 4 घंटे के लिए 812 ताजा 100% एम्बेड में रखें। कमरे के तापमान पर इन राल घुसपैठ कदम प्रदर्शन करते हैं।
    1. एम्बेड करने से ठीक पहले, एक मिश्रण कंटेनर में राल की एक छोटी राशि रखें और धीरे-धीरे कार्बन ब्लैक पाउडर में कार्बन ब्लैक पाउडर में (एक लकड़ी की छड़ी का उपयोग किया जा सकता है) जब तक राल पाउडर के साथ संतृप्त न हो जाए लेकिन अभी भी तरल पदार्थ है और दानेदार नहीं बन जाता है। यह मोटी स्याही के समान होना चाहिए और दिखाई झुरमुट के बिना लकड़ी की छड़ी से धीरे-धीरे ड्रिप करने में सक्षम होना चाहिए।
  20. एक सिलिकॉन रबर मोल्ड में ऊतक के नमूनों को उन्मुख करें और एक तस्वीर लें ताकि राल ब्लॉक के भीतर नमूना अभिविन्यास दर्ज किया जा सके और संदर्भित किया जा सके। सिलिकॉन मोल्ड की नोक पर कार्बन ब्लैक सैचुरेटेड राल में नमूनों को कवर करें और मोल्ड को 65 डिग्री सेल्सियस पर ~ 1 घंटे के लिए ओवन में रखें।
    1. मोल्ड की नोक पर राल को नियंत्रित करने के लिए मोल्ड को एक झुकाव पर रखें जहां यह ऊतक नमूने को कवर करता है। राल(चित्रा 2A)के विपरीत छोर पर मोल्ड में एक प्रयोग/ऊतक नमूना पहचानकर्ता के साथ एक लेबल रखें ।
  21. ओवन से सिलिकॉन मोल्ड निकालें और स्पष्ट राल (कोई कार्बन ब्लैक) के साथ मोल्ड के शेष भरने सुनिश्चित करें कि लेबल दिखाई रहता है । कार्बन ब्लैक के साथ संचार राल को पर्याप्त रूप से स्पष्ट राल के साथ आसानी से मिश्रण नहीं करने के लिए इलाज करें।
    1. मोल्ड के भीतर एक अतिरिक्त अच्छी तरह से तैयार करें जिसमें ऊतक नहीं होता है। अतिरिक्त अच्छी तरह से शुरू, स्पष्ट राल के साथ मोल्ड के शेष भरें।
    2. यदि कार्बन ब्लैक संचार राल स्पष्ट राल में खून आना शुरू हो जाता है, तो सिलिकॉन मोल्ड को अतिरिक्त समय (जैसे, 15 मिनट) के लिए ओवन में वापस रखें।
    3. एक बार ऊतक के नमूनों के सभी स्पष्ट राल के साथ बंद सबसे ऊपर किया गया है, सिलिकॉन मोल्ड वापस ओवन में जगह (फ्लैट, कोई झुकाव) ६५ डिग्री सेल्सियस पर ४८ घंटे के लिए इलाज की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए ।

2. ब्लॉक तैयारी

नोट: विधि इस बात पर निर्भर करेगी कि ब्लॉक में नमूना कैसे उन्मुख है और सेक्शनिंग कैसे होनी है। हालांकि, सबसे आम ऊतक अभिविन्यास राल ब्लॉक की नोक में केंद्रित ऊतक पाता है, राल ब्लॉक के लंबे अंत तक लंबवत।

  1. ज्यादातर मामलों में, पहले ब्लॉक के अंत को माइक्रोटॉम चक में नमूना ब्लॉक रखकर ऊतक का पता लगाने के लिए ट्रिम करें, जिसमें टेपरेड एंड चक से लगभग 5-6 मिमी चिपके हुए हैं। सेट स्क्रू के साथ इसे जगह में लॉक करें और इसे हीट लैंप के नीचे रखें।
  2. कई मिनट के बाद ब्लॉक निंदनीय और ट्रिम करने के लिए आसान हो जाएगा। चक को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप धारक में रखें और एक नए डबल-एज रेजर ब्लेड का उपयोग ब्लॉक चेहरे के समानांतर पतली धाराओं को बनाने के लिए तब तक करें जब तक कि ऊतक दिखाई न दे। यह सबसे अच्छा ब्लॉक चेहरे भर में प्रकाश angling द्वारा देखा जाता है, ऊतक नमूना कम चिंतनशील और दानेदार राल है कि ऊतक से रहित है के उन भागों की तुलना में होगा । ऊतक कैसे और कहां स्थित है की एक विचार के लिए कार्बन काले संतृप्त राल की शुरूआत करने से पहले ऊतक नमूनों की ली गई तस्वीर से परामर्श करें ।
  3. एक नमूना पिन धारक को ट्रिमिंग उद्देश्यों के लिए अलग सेट करें। इस पिन धारक एसईएम कक्ष में कभी नहीं रखा जाता है और इसलिए दस्ताने के बिना संभाला जा सकता है, यह ट्रिमिंग पिन धारक के रूप में संदर्भित किया जाएगा । इमेजिंग कक्ष में रखे जाने वाले किसी भी नमूना धारक को दस्ताने के बिना कभी नहीं छुआ जाना चाहिए। इससे माइक्रोस्कोप कक्ष में तेल और तेल शुरू करने से बचा जाताहै ।
  4. ट्रिमिंग पिन धारक में एक एल्यूमीनियम नमूना पिन रखें और पिन धारक के ऊपर 3-4mm आयोजित पिन के चेहरे (सपाट सतह) के साथ सेट स्क्रू को थोड़ा कस लें।
  5. पिन के चेहरे में कई गहरी, crisscrossing खरोंच बनाने के लिए जगह में नमूना पकड़ इस्तेमाल गोंद के लिए एक बड़ा सतह क्षेत्र प्रदान करते हैं । यदि एल्यूमीनियम पिन का उपयोग किया जाता है, तो इस चरण(चित्रा 2B)के लिए एक छोटे स्टील फ्लैटहेड पेचकश की सिफारिश की जाती है।
  6. जब तक राल नरम और निंदनीय न हो जाए तब तक ऊतक के नमूने को वापस हीट लैंप के नीचे चक रखें, फिर इसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे चक-पात्र में रखें।
  7. ऊतक नमूने युक्त राल ब्लॉक के हिस्से से अतिरिक्त राल को ट्रिम करने के लिए दोधारी रेजर ब्लेड का उपयोग करना। अंततः पिन से जुड़े ऊतक ब्लॉक का आकार व्यास में लगभग 3 मिमी और ऊंचाई में 2-3 मिमी होगा।
    1. ध्यान से रेजर को सीधे राल ब्लॉक में सीधे नीचे धकेलें लगभग 1-2 मिमी, फिर ध्यान से रेजर को क्षैतिज रूप से पिछले कट के बराबर गहराई पर राल ब्लॉक में धकेलें। यह धीरे-धीरे और बड़ी सावधानी के साथ करें, क्योंकि ऊतक नमूने वाले ब्लॉक के हिस्से को नुकसान या काटना संभव है। जैसे ही दो कट मिलते हैं, अतिरिक्त राल ब्लॉक से अलग हो जाएगा । राल को तब तक हटाना जारी रखें जब तक कि केवल 3 मिमी x 3 मिमी उठाया क्षेत्र बना न रहे।
  8. इस प्रारंभिक ट्रिमिंग के बाद, ब्लॉक (अभी भी चक में) को कई मिनट के लिए गर्मी दीपक के नीचे रखें।
  9. एक बार जब राल नरम और निंदनीय हो जाता है, तो ब्लॉक को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे वापस रखें। एक नए डबल-एज रेजर ब्लेड का उपयोग करके, राल ब्लॉक के शीर्ष को काट दें, छंटनी किए गए हिस्से के नीचे लगभग 1 मिमी, एक चिकनी कटौती के साथ। एक सपाट सतह बेहतर है क्योंकि यह नमूना पिन से चिपका होगा। सावधान रहें कि नमूना खो जाने की अनुमति न दें, क्योंकि इस कदम के लिए कुछ बल की आवश्यकता होती है जो ब्लॉक के हटाए गए हिस्से में स्थानांतरित हो सकती है और इसे उड़ने का कारण बन सकती है। कट और छंटनी का नमूना एक तरफ रखें।
  10. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप गोदाम में कट एल्यूमीनियम पिन युक्त ट्रिमिंग पिन धारक रखें। पिन चेहरे पर साइनोएक्रिलेट गोंद की एक पतली परत लगाएं ताकि यह एक दृश्य meniscus बनाने के बिना पिन को पूरी तरह से कवर करे। टिश्यू ब्लॉक के छंटनी किए गए टुकड़े को संदंश के साथ उठाएं और पिन चेहरे पर रखें। नमूना पिन पर ऊतक नमूना केंद्र। इसे नीचे धकेलें और इसे कई सेकंड के लिए पकड़ें। गोंद को कई मिनट के लिए सेट करने की अनुमति दें।
  11. जब गोंद अच्छी तरह से सूख जाए, तो ट्रिमिंग पिन होल्डर को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे वापस रखें। एक अच्छी फ़ाइल का उपयोग करके, अतिरिक्त राल को दूर करें ताकि कोई राल पिन को ओवरहैंग नहीं कर रहा है। राल का आकार गोलाकार पिन हेड के समान होना चाहिए।
  12. अपने राल ब्लॉक के उठाए गए हिस्से पर ऊतक का पता लगाएं, तिरछी प्रकाश व्यवस्था इसके लिए उपयोगी है। एक डबल-एज रेजर का उपयोग करके, ऊतक नमूने वाले राल के उठाए गए हिस्से को 1 मिमी2से बड़ा क्षेत्र में छंटनी की जानी चाहिए। यदि संभव हो, ब्लॉक चेहरे भी छोटे छंटनी की जा सकती है, यह हीरे चाकू पर तनाव को कम करने और अपनी दीर्घायु में सुधार होगा ।
    1. जितना संभव हो उतना अतिरिक्त राल निकालें, ब्लॉक को एक आयाम में थोड़ा लंबा छोड़ दें। यह धीरे-धीरे और देखभाल के साथ किया जाता है, क्योंकि ऊतक नमूने वाले राल के लिए बहुत अधिक बल लागू होने पर दूर तोड़ने के लिए संभव है। जबकि एक रेजर की सिफारिश की जाती है, इस चरण के लिए एक ठीक धातु फ़ाइल का उपयोग किया जा सकता है।
  13. एक ठीक धातु फ़ाइल कोण के साथ अतिरिक्त राल, ऊतक नमूना युक्त उठाया भाग के बाहर के क्षेत्र में, पिन के किनारे की ओरनीचे (चित्रा 2C)।
  14. चांदी के पेंट को लगाने से पहले तैयार नमूने से राल के कण और धूल निकालें और उसके बाद सोने की स्पंदन। एसीटोन के साथ चांदी मिलाएं ताकि यह एक आसानी से फैलने योग्य तरल हो, जो नेल पॉलिश के समान है (लेकिन इतनी पतली नहीं है कि यह एप्लीकेटर से टपकता है) और पूरे नमूना ब्लॉक सतह पर एक पतला कोट लागू करें। एसीटोन तेजी से वाष्पित हो जाता है, इसलिए अतिरिक्त एसीटोन जोड़ना आवश्यक हो सकता है क्योंकि चांदी का पेंट गाढ़ा होना शुरू होता है।
    1. माइक्रोस्कोप में लोड होने से पहले चांदी के पेंट को रात भर सूखने दें।
      नोट: यह चांदी की परत पतली होना चाहिए ताकि 1 मिमी x 1 मिमी से परे ब्लॉक-फेस का विस्तार करने से बचने के लिए, और जबकि चांदी के पेंट ने हीरे के चाकू को कभी क्षतिग्रस्त नहीं किया है, छोटे ब्लॉक-चेहरे अभी भी हीरे के चाकू की दीर्घायु को बनाए रखने की सिफारिश कर रहे हैं। चांदी के साथ मिश्रित एसीटोन को इमेजिंग कक्ष में एसीटोन वाष्प शुरू करने से बचने के लिए सोने-स्पंदन या माइक्रोस्कोप में नमूना लोड करने से पहले पूरी तरह से वाष्पित होना चाहिए।
    2. चांदी के पेंट के आवेदन के बाद, नमूना ब्लॉक करने के लिए सोने की एक पतली परत लागू होते हैं। एक मानक वैक्यूम स्पंदन डिवाइस का उपयोग करना एक मानक सोने की पन्नी लक्ष्य से लैस, 200 मिलीटोर (आर्गन गैस) और 2 मिनट के लिए चलने वाले 40 मिलीएम्प्स के एक कक्ष दबाव के परिणामस्वरूप 20 एनएम मोटी सोने की कोटिंग होगी।
  15. कोटिंग के बाद, उपयुक्त प्रयोग लेबल संलग्न के साथ एक ट्यूब में घुड़सवार और छंटनी ब्लॉक रखें। डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके कस्टम ट्यूब बनाएं।
    1. बल्ब के ठीक नीचे स्थानांतरण पिपेट काटें, जिससे बल्बस अंत के नीचे संलग्न स्थानांतरण पिपेट ट्यूब का एक छोटा हिस्सा निकल जाता है। ट्यूबलर भाग है कि दूर काट दिया गया था छोटा, और पिपेट टिप वापस काफी वापस काट ताकि एल्यूमीनियम नमूना पिन इसके अंदर snuggly धक्का दिया जा सकता है ।
    2. संशोधित हस्तांतरण पिपेट के बल्बस अंत के भीतर एल्यूमीनियम नमूना पिन युक्त अंत रखें।
  16. एक तैयार ऊतक ब्लॉक लोड करने से पहले, ध्यान से ब्लॉक चेहरे की सतह से अतिरिक्त चांदी के रंग को ट्रिम करें।

3. ब्लॉक फेस इमेजिंग के लिए एसईएम सेटिंग्स

नोट: इमेजिंग सेटिंग्स का पालन करें कि लेखकों द्वारा इस्तेमाल किया डिवाइस पर उत्पादित किया गया है, जो प्रदान की सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है । जबकि यह डिवाइस परिवर्तनीय दबाव इमेजिंग में सक्षम है, सबसे अच्छा परिणाम उच्च निर्वात के तहत कब्जा कर लिया गया ।

  1. निवास समय: सीरियल सेक्शनिंग के दौरान 12 μs/px का इस्तेमाल करें । जब ब्याज के क्षेत्र की पहचान की गई है, तो 32 μs/px पर एक उच्च संकल्प छवि प्राप्त की जा सकती है।
  2. वैक्यूम सेटिंग्स: 9e-008 Pa के एक बंदूक दबाव का उपयोग करें, 1.1e-004 Pa के एक स्तंभ दबाव, और 9.5e-002 Pa के एक चैंबर दबाव ।
  3. कैप्चर समय: उपरोक्त सेटिंग्स के साथ, प्रति छवि 50 सेकंड की दर से 2048x2048 पीएक्स इमेज स्टैक कैप्चर करें। ब्याज के क्षेत्रों के उच्च संकल्प छवियों को प्रति छवि 9 मिनट के नीचे 4096x4096 px पर कब्जा कर लिया जा सकता है।
  4. खंड मोटाई: 100-200 एनएम का प्रयोग करें। कम संभव है, लेकिन कम बीम वोल्टेज, तीव्रता, या रहने का समय की आवश्यकता हो सकती है।
  5. हाई वोल्टेज (एचवी): 7-12 केवी का प्रयोग करें। जबकि वोल्टेज बढ़ाने से स्पॉट का आकार कम हो जाता है और संकल्प बढ़ता है, यह बीम क्षति के लिए अधिक संभावना का परिचय देता है। उच्च केवी बीम प्रवेश को बढ़ाता है जिसके परिणामस्वरूप विवरणों की हानि होती है। हालांकि, केवी को कम करने से सिग्नल टू नॉमिनेशन रेशियो(चित्र 3)14हो जाता है ।
  6. बीम तीव्रता (बीआई): लेखक के SBF-SEM डिवाइस 1-20 से लेकर एक बीम तीव्रता पैमाने प्रदान करता है । इस पैमाने पर, 5-7 के मूल्य अत्यधिक चार्जिंग और बीम क्षति के बिना गुणवत्ता वाली छवियां देते हैं। बीआई जितना अधिक होगा संकल्प हालांकि, चार्जिंग और बीम क्षति14की अधिक संभावना है।
  7. स्पॉट आकार और छवि आवर्धन: बीम तीव्रता और वोल्टेज स्तर से स्पॉट आकार निर्धारित करें। आदर्श रूप में, स्पॉट आकार उपयोग किए गए पिक्सेल आकार से बड़ा नहीं होना चाहिए। पिक्सेल का आकार पिक्सल की संख्या से देखने के क्षेत्र (FOV) को विभाजित करके निर्धारित किया जाता है। उदाहरण के लिए, 2048x2048 पिक्सल के इमेज साइज वाला 25 माइक्रोन एफओवी 12.2 एनएम प्रति पिक्सल देगा। इसलिए स्पॉट आकार 12.2 एनएम से अधिक नहीं होना चाहिए। चित्रा 4 से पता चलता है कि एचवी, बीआई और स्पॉट साइज कैसे संबंधित हैं।
  8. वर्किंग डिस्टेंस (WD) - ब्लॉक फेस इमेजिंग के साथ कामकाजी दूरी समायोज्य नहीं है। यह केवल ध्यान का एक कारक है । यह सभी ब्लॉकों के लिए लगभग समान होगा। जबकि कामकाजी दूरी समायोज्य नहीं है, यह कैप्चर की गई छवि के समाधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। जैसे-जैसे काम की दूरी कम होती जाती है, कैप्चर की गई छवियों पर संकल्प सीमा बढ़ जाती है। कुछ मामलों में इमेजिंग चैंबर के भीतर संशोधन करके काम की दूरी को कम करना संभव हो सकता है, हालांकि ये संशोधन उपयोगकर्ता के विवेक पर किए जाने चाहिए। काम की दूरी को कम करने और छवि संकल्प को बढ़ाने के लिए, हमने दरवाजा माउंट माइक्रोटॉम शिकंजा को ढीला कर दिया और माइक्रोटॉम को फिर से तैनात किया ताकि यह शिकंजा को फिर से कड़ा करने के बाद बीम डिटेक्टर के करीब ~ 2 मिमी विश्राम कर सके।
  9. संकल्प - उपरोक्त सेटिंग्स का उपयोग करके, एक्स और वाई रिज़ॉल्यूशन का उपयोग 3.8 एनएम तक संभव है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि रिज़ॉल्यूशन बीम स्पॉट आकार के साथ-साथ इमेज कैप्चर के पिक्सेल रेजोल्यूशन (उदाहरण के लिए, 2048x2048 पिक्सेल इमेज में कैप्चर किए गए 20 माइक्रोम फील्ड ऑफ व्यू में 9.8 एनएम का पिक्सल रेजोल्यूशन होता है, भले ही 3.8 एनएम स्पॉट साइज का इस्तेमाल किया गया हो)। जेड-प्लेन में इमेज रिजॉल्यूशन सेक्शनिंग मोटाई पर निर्भर है, हम पाते हैं कि 100-200 एनएम इस प्रोटोकॉल के साथ अच्छी तरह से काम करता है ।

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Representative Results

माउस कॉर्निया
यह प्रोटोकॉल माउस कॉर्निया के लिए बड़े पैमाने पर लागू किया गया है। एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग का उपयोग करके इलास्टिन-फ्री माइक्रोफाइब्रिल बंडलों (ईएफएमबी) के नेटवर्क को वयस्क माउस कॉर्निया के भीतर मौजूद दिखाया गया था। यह पहले माना जाता था कि यह नेटवर्क केवल भ्रूणीय और प्रारंभिक प्रसवोत्तर विकास के दौरान मौजूद था। एसबीएफ-एसईएम ने पूरे कॉर्निया में एक व्यापक ईएफएमबी नेटवर्क का खुलासा किया, जिसमें व्यक्तिगत फाइबर क्रॉस-सेक्शन में मापा जाने पर व्यास में 100-200 एनएम पाया गया। यह भी पाया गया कि इस ईएफएमबी नेटवर्क को अलग-अलग परतों में व्यवस्थित किया गया था, जिसमें केराटोसाइट्स के साथ बारीकी से जुड़े फाइबर थे, यहां तक कि केराटोसाइट सतह(चित्रा 5)पर उथले इनवेजिनेशन के भीतर भी झूठ बोल रहे थे। वयस्क कॉर्निया में ईएमबी फाइबर की खोज ने इम्यूनोगोल्ड-लेबलिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टेम), फ्लोरेसेंस और कन्फोकल अध्ययनों का नेतृत्व किया ताकि इस नेटवर्क की प्रकृति को और अधिक समझा जा सके23।

इस प्रोटोकॉल के आगे आवेदन केंद्रीय कॉर्नियल नसों की एक पहले से अज्ञात आबादी की खोज के लिए नेतृत्व किया है कि स्ट्रोमल-epithelial सीमा(चित्रा 6)पर बेसल एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ फ्यूज । पहले, यह माना जाता था कि इस सीमा पर एपिथेलियम के साथ बातचीत करने वाली सभी तंत्रिकाएं कॉर्नियल एपिथेलियम में प्रवेश कर गईं और उपबासल और एपिथेलियल प्लेक्सी का उत्पादन कर रही हैं। इस अध्ययन में, बेसल एपिथेलियम के साथ बातचीत करने वाली केंद्रीय नसों का ~ 45% सरल प्रवेश के बजाय सेल-सेल फ्यूजन से गुजरा। एसबीएफ-एसईएम डेटा सेट पर लागू स्टीरियोलॉजिकल तरीकों का उपयोग करके, यह दिखाना संभव था कि इस उपन्यास तंत्रिका आबादी में सतह-से-मात्रा अनुपात लगभग आधा था, जो कि मर्मज्ञ नसों का लगभग आधा था, जो उनके "सूजन" उपस्थिति (तंत्रिका संलयन - 3.32±0.25, तंत्रिका प्रवेश - 1.39±0.14, पी ≤ 0.05)। तंत्रिका बंडलों और उनके माइटोकॉन्ड्रिया के मर्मज्ञ और फ्यूजिंग तंत्रिका बंडलों के 3 डी पुनर्निर्माण बनाए गए थे, जो तंत्रिका बंडलों के फ्यूज्ड हिस्सों में माइटोकॉन्ड्रिया की कमी को उजागर करते थे। एसबीएफ-एसईएम का उपयोग करके न्यूरोनल-एपिथेलियल सेल फ्यूजन की खोज ने फ्लोरेसेंस अध्ययन ों को दो फ्यूज्ड कोशिकाओं के बीच झिल्ली निरंतरता की पुष्टि करने के लिए नेतृत्व किया21।

केंद्रीय कॉर्निया एक अवस्कुलर ऊतक है, और इस तरह परिधीय लिम्बल वैक्यूल्चर कॉर्निया के समग्र स्वास्थ्य के लिए विशेष महत्व रखता है। इस क्षेत्र के सेल-सेल संबंध और अल्ट्रास्ट्रक्चर जटिल है; हालांकि, इन सेल-सेल इंटरैक्शन और अल्ट्रास्ट्रक्चरल कनेक्शन की सराहना करने की क्षमता फ्लोरेसेंस और सिंगल सेक्शन टेम अध्ययनों में सीमित रही है। इस कारण से एक एसबीएफ-एसईएम छवि स्टैक जिसमें लिम्बल वेक्यूलेचर, तंत्रिका बंडल और संबद्ध कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से 3 डी पुनर्निर्माण(चित्रा 7)के लिए खंडित किया गया था। इस छवि में संवहनी एंडोथेलियल जंक्शनों और एक ओवरलेइंग पेरिसाइट के बीच घनिष्ठ संबंध, पेरिवस्कुलर मास्ट सेल के व्यक्तिगत कणिकाएं, रक्त वाहिका दीवार की बाहरी सतह के साथ रेंगने वाले न्यूट्रोफिल के नाभिक और अग्रणी किनारे, साथ ही एक गुजरते तंत्रिका बंडल को देखा जा सकता है।

एक साथ लिया, काम का यह शरीर इस प्रोटोकॉल की क्षमता को दर्शाता है कि वह एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स और एपिथेलियम के साथ-साथ वैक्यूलेचर और संबद्ध कोशिकाओं से समृद्ध ऊतकों में उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा सेट का उत्पादन करता है।

उच्च आदेश रहनुमा रेटिना - तंत्रिका प्लेक्सस और संवहनी नेटवर्क
उच्च क्रम वानरों की रेटिना तंत्रिका फाइबर परत (आरएनएलएल) में शामिल है और एक व्यापक संवहनी नेटवर्क पर निर्भर करता है। अक्सर, रेटिना के रोगों में रेटिना तंत्रिका फाइबर परत के दोनों मापदंडों के साथ-साथ इसके भीतर पाए जाने वाले वैक्यूलेचर में परिवर्तन शामिल होते हैं। स्वस्थ, गैर रोग ऊतक में RNFL और उसके संवहनी नेटवर्क के बीच संबंधों को समझना रोग के परिणामस्वरूप होने वाले किसी भी परिवर्तन को समझने का पहला कदम है। इस संबंध को बेहतर ढंग से समझने के लिए, एसबीएफ-एसईएम प्रोटोकॉल को सामान्य उच्च क्रम रहनुमा रेटिना पर लागू किया गया था और संवहनी नेटवर्क का पुनर्निर्माण किया गया था और इस पुनर्निर्माण(चित्र 8)से निकाले गए वॉल्यूमेट्रिक डेटा का प्रदर्शन किया गया था। आरएनएफएल के इस 4,642,307 माइक्रोन3 क्षेत्र में वॉल्यूम में एक संवहनी बिस्तर 1.207x10-4 माइक्रोन निहित था, जो आरएनएफएल की कुल मात्रा का 2.6% बना था। यह काम घने न्यूरोलॉजिकल ऊतक में उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए इस प्रोटोकॉल की क्षमता को दर्शाता है।

ज़ेब्राफ़िश और विशालकाय दानियो हार्ट - स्ट्रेटेड मांसपेशी और विकासशील वाक्यूलेचर
जेब्राफिश और विशालकाय दानियो दोनों ही दिल के विकास और पुनर्जनन के लिए महत्वपूर्ण मॉडल हैं । ऐतिहासिक रूप से, जेब्राफिश दिल को जेब्राफिश की शारीरिक मांगों के समर्थन में एक साथ काम करने वाले दो शारीरिक रूप से अलग मायोकार्डियल सेगमेंट से मिलकर माना जाता है। हालांकि, इन दोनों वेंट्रिकुलर लेयर्स के बीच इंटरफेस को अच्छी तरह से नहीं समझा गया था । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, फाइब्रोब्लास्ट की पतली शीट से मिलकर पहले से अपरिचित जंक्शनल क्षेत्र की खोज की गई थी। यह पाया गया कि इस शीट के भीतर उद्घाटन ने दो अलग - अलग मायोकार्डियल खंडों को संपर्क में आने और डेस्मोसोम्स और प्रावरणी सहित जटिल आसंजन जंक्शनों के रूप में22का पालन करने की अनुमति दी।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग विकासशील विशाल डैनियो हार्ट(चित्रा 9)के संवहनी नेटवर्क की जांच करते हुए आगे के काम में किया गया है। यह विधि विकासशील कार्डियक मायोसाइट नेटवर्क की 3डी प्रशंसा और माइक्रोवैस्कुलेचर विकसित करने के साथ इसके संबंधों की अनुमति देती है। एक साथ लिया, यह काम मांसपेशियों और अत्यधिक संवहनी ऊतकों में उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा सेट का उत्पादन करने के लिए इस प्रोटोकॉल की क्षमता को दर्शाता है।

इमेज सेटिंग, चार्जिंग और रिज़ॉल्यूशन
जबकि उचित निर्धारण और भारी धातु धुंधला गुणवत्ता SBF-SEM इमेजिंग के लिए आवश्यक है, समान रूप से महत्वपूर्ण प्रवाहकीय राल और सवालों के लिए उचित इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग किया जा रहा है संबोधित किया जा रहा है । इस प्रोटोकॉल में, नमूना ब्लॉक की चालकता बढ़ाने और ब्लॉक-फेस से माध्यमिक इलेक्ट्रॉनों की निकासी के लिए बढ़ते पिन को एक नाली प्रदान करने के लिए कार्बन ब्लैक का उपयोग नियोजित किया जाता है। यह ऊतक चार्जिंग का मुकाबला करने में प्रभावी साबित हुआ है जो अक्सर कार्बन ब्लैक16से तैयार नहीं ऊतकों में छवि की गुणवत्ता को कम करता है । इसके अलावा, ब्लॉक पर लागू सिल्वर पेंट और गोल्ड स्पंदन इलेक्ट्रॉन बिल्डअप के लिए एक अपव्यय मार्ग प्रदान करता है। कुछ उपकरणों के एक फोकल चार्ज क्षतिपूर्ति के अलावा के लिए अनुमति देते हैं, जो ब्लॉक-फेस पर नाइट्रोजन का एक कश लागू करके चार्ज िंग को कम करता है, हालांकि हमें कार्बन ब्लैक के उपयोग और ब्लॉक15में चांदी के पेंट और सोने के आवेदन के साथ समान सफलता मिली है। नमूना चालकता की कमी से ऊतक चार्जिंग(चित्रा 1)के रूप में दिखाई देने वाले इलेक्ट्रॉन बिल्डअप के साथ-साथ डिस्चार्ज हो सकते हैं जो अचानक छवि स्थानांतरण और वारिंग के रूप में दिखाई देते हैं जो नाटकीय रूप से छवि की गुणवत्ता(चित्र 10 बी और एफ)को कम करते हैं। कार्बन ब्लैक का उपयोग उच्च वैक्यूम के तहत इमेजिंग और छवि सेटिंग्स के उपयोग के लिए अनुमति देता है जिसके परिणामस्वरूप उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात और बेहतर छवि रिज़ॉल्यूशन होता है। ऐसी ही एक सेटिंग जो बेहतर छवि गुणवत्ता की ओर ले जाती है, वह है पिक्सेल निवास समय। एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग प्रक्रिया में बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉनों को उत्पन्न करने के लिए नमूना सतह के पार एक इलेक्ट्रॉन बीम की रैस्टर स्कैनिंग शामिल है जिसे माइक्रोस्कोप डिटेक्टर सिग्नल के रूप में एकत्र और व्याख्या कर सकता है। इस बीम को प्रत्येक पिक्सेल के स्थान के भीतर रहने की अनुमति दी जाती है जिससे प्रत्येक पिक्सेल स्थान(चित्र 3ए और B)2 को अधिक सटीक पिक्सेल मूल्य सौंपाजाताहै । वहां एक संतुलन है कि वृद्धि हुई संकेत के बीच मारा जाना चाहिए शोर, संकल्प और नुकसान ब्लॉक के लिए निपटा चेहरा लेकिन । बीम प्रभावी रूप से उच्च ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों के साथ ब्लॉक-फेस को विकिरणित करता है जो राल को तोड़ सकता है और नरम कर सकता है जिसके परिणामस्वरूप छवि क्षरण और जटिलताओं में कटौती(चित्र 10)28। जेड-रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता जितनी पतली होगी, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग बनाए रखना उतना ही कठिन हो जाता है। हम आम तौर पर 100-200 एनएम के जेड-स्टेप्स का उपयोग करते हैं, हालांकि 25-50 एनएम के जेड-चरण आकार5,29,30, 31की सूचना दी गई है। इस आकार के जेड-चरणों के साथ, बीम क्षति के कारण राल के ब्रेक-डाउन और नरम होने से या तो राल का संपीड़न हो सकता है जिससे चाकू एक कट को याद कर सकता है या ब्लॉक-फेस को काट सकता है लेकिन "बकवास" के साथ जहां चाकू लहर और बैंड13बनाने वाले ब्लॉक की सतह के पार रुक जाता है। जबकि छोटे जेड-स्टेप्स एक आकर्षक संभावना हैं, उचित जेड-स्टेप चुनते समय विशिष्ट शोध प्रश्न को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। अधिक नमूना पर्याप्त डेटा भंडारण विचार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 3 डी पुनर्निर्माण का उत्पादन करने के लिए आवश्यक समय में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

ऊतक निर्धारण और धुंधला
भारी धातु इनक्यूबेशन से पहले, ऊतकों को ग्लूटारल्डिहाइड में तय किया जाना चाहिए। जबकि हम ऊतक अल्ट्रास्ट्रक्चर27के संरक्षण के लिए वैक्यूम के तहत माइक्रोवेव निर्धारण की अत्यधिक सलाह देते हैं , यदि प्रयोगशाला ग्रेड माइक्रोवेव उपलब्ध नहीं है तो एक वाणिज्यिक इन्वर्टर माइक्रोवेव जिसमें चर वाट32 , 33,34,35प्रतिस्थापित किया जा सकता है । यदि ऐसा किया जाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए कि ऊतक विरूपण न हो। अनुचित ऊतक निर्धारण के परिणामस्वरूप ऊतक आकृति विज्ञान बदल सकता है जैसा कि चित्र 10Eमें देखा जा सकता है। सबसे आधुनिक एसबीएफ-एसईएम स्टेनिंग प्रोटोकॉल की तरह इस प्रोटोकॉल को 201017में डियरिंक द्वारा उल्लिखित धुंधला प्रक्रिया से अनुकूलित किया गया है, जो 1 9 8436में विलिंघम और रदरफोर्ड द्वारा बनाए गए ऑस्मियम-थिओकार्बोहाइड्रेजाइड-ऑस्मियम दाग के आधार पर है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली भारी धातुएं ऊतक नमूने(चित्र 1)के भीतर सेलुलर संरचनाओं के विपरीत जोड़ती हैं। प्रारंभिक ऑस्मिमियम इनक्यूबेशन कम ऑस्मिमियम के साथ होता है जो असंतृप्त वसा में सी = सी बांड से बांधता है जिससे झिल्ली और लिपिड धुंधला हो जाता है37,38. ऑस्मियम पोटेशियम फेरोसाइनाइड द्वारा कम हो जाता है, जो संतृप्त लिपिड के धुंधला होने में सहायता करता है और फॉस्फोलिपिड39,40को स्थिर करने का भी कार्य करता है। थिओकार्बोहाइड्रेजाइड को बाद में एक मॉरडेंट के रूप में जोड़ा जाता है जो पहले इनक्यूबेशन से ऑस्मियम से बांधता है, एक पुल के रूप में कार्य करता है जिस पर प्रोटोकॉल41में बाद के चरण में आगे ऑस्मियम बाध्य होता है। यूरेनाइल एसीटेट, जो यूरेनियम नमक है, लिपिड, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के लिए एक प्रभावी विषम एजेंट है, जबकि सीसा साइट्रेट प्रोटीन और ग्लाइकोजन के विपरीत को बढ़ाता है। सेलुलर घटकों के लिए इन एजेंटों की अलग - अलग समानताएं ऑस्मियम इन्क्यूबेशन42के ऊपर और ऊपर के ऊतकों के समग्र विपरीत को बढ़ाती हैं ।

ब्लॉक-फेस इमेजिंग
चित्रा 11, चित्रा 12, चित्र 13 वोल्टेज, पिक्सेल निवास समय और बीम तीव्रता के संयुक्त प्रभाव को दर्शाते हैं। पारंपरिक अभ्यास से पता चलता है कि कम वोल्टेज का संयोजन, कम निवास समय और कम बीम तीव्रता इष्टतम इमेजिंग और नमूना ब्लॉक को बीम क्षति को रोकने के लिए आवश्यक हैं। इन सेटिंग्स के विपरीत, चित्र 11, चित्रा 12, चित्रा 13 स्पष्ट करता है कि उच्च वोल्टेज (जैसे, 7 केवी), लंबे समय (32 माइक्रोन/पीएक्स) और उच्च बीम तीव्रता (हमारे मामले में 6 की स्थापना) पारंपरिक सेटिंग्स पर बेहतर छवि गुणवत्ता का उत्पादन कर सकते हैं।

एसबीएफ-एसईएम सीरियल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के संग्रह के लिए अनुमति देता है जिसे स्वरों के शामिल 3 डी डेटा सेट के रूप में एकत्र किया जा सकता है। हालांकि यह एसबीएफ-एसईएम का एक अविश्वसनीय रूप से शक्तिशाली उपयोग है, यह विधि दुर्लभ जैविक घटनाओं या कोशिकाओं के तेजी से और दोहराने योग्य इमेजिंग के लिए भी अनुमति देती है। SBF-SEM का उपयोग कर छवि अधिग्रहण दुर्लभ घटनाओं के लिए निगरानी की जा सकती है, और इमेजिंग के क्रम में इन घटनाओं के उच्च आवर्धन/संकल्प छवियों को इकट्ठा करने के लिए रुका हुआ है । इसके अलावा, ब्लॉक को माइक्रोस्कोप चैंबर और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) इमेजिंग के लिए ब्लॉक-फेस सेक्शन्ड से हटाया जा सकता है। इस तरह से एसबीएफ-एसईएम का उपयोग करके दुर्लभ घटनाओं के बड़े डेटासेट एकत्र किए जा सकते हैं और साथ ही TEM का उपयोग करके एंग्स्ट्रॉम पैमाने पर सराहना की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1:प्रोटोकॉल में विभिन्न चरणों में एसबीएफ-एसईएम और तेम तुलना। इस प्रोटोकॉल में कई चरण होते हैं जिनमें नमूना ऊतक भारी धातुओं से सना हुआ होता है। यह न केवल ऊतक के विपरीत और सेलुलर संरचनाओं और ऑर्गेनेल्स की सराहना को प्रभावित करता है, बल्कि ऊतक के चित्र होने पर चार्ज करने का स्तर भी होता है। इस आंकड़े में तैयार ऊतकों के तीन अलग-अलग विचार हैं: एक कम आवर्धन दृश्य(ए, डी और जी),एक उच्च आवर्धन दृश्य(बी, ई और एच),और तैयार माउस कॉर्निया(सी, एफ और आई)की एक टीएम तुलना । यह ध्यान दिया जा सकता है कि उच्च आवर्धन छवियों के परिणामस्वरूप ऊतक चार्जिंग में वृद्धि हो सकती है, क्योंकि इलेक्ट्रॉन बीम ऊतक के एक छोटे क्षेत्र में केंद्रित होता है। शीर्ष पंक्ति(ए-सी)चरण 1.8 के पूरा होने के माध्यम से संसाधित ऊतक से एक प्रतिनिधि नमूना है, और पोटेशियम फेरोसाइनाइड, ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और थिओकार्बोहाइड्रेजाइड के साथ प्रत्यारोपित किया गया है। पहले दो स्तंभों में तीर एक संदर्भ बिंदु के रूप में एपिथेलियल-स्ट्रोमल इंटरफेस दिखाते हैं। नीचे की दो पंक्तियों की तुलना में इसके विपरीत के निम्न स्तर पर ध्यान दें, साथ ही ऊतक चार्जिंग के बढ़े हुए स्तर पर ध्यान दें। मध्य पंक्ति(डी-एफ)में नमूना चरण 1.10 के पूरा होने और एक अतिरिक्त ऑस्मियम टेट्रोएक्साइड चरण से लाभ के माध्यम से संसाधित किया गया था, और शीर्ष पंक्ति में नमूने की तुलना में अधिक विपरीत दिख रहा है। जबकि सेलुलर संरचनाएं प्रत्यक्ष हैं, चार्जिंग अभी भी मौजूद है। नीचे की पंक्ति(जी-1)में नमूना पूर्ण धुंधला प्रोटोकॉल से लाभ और न्यूनतम ऊतक चार्ज है। TEM इमेजिंग प्रत्येक चरण (दाएं कॉलम) पर मौजूद भारी धातुओं द्वारा प्रदान किए गए ऊतक विपरीत स्तरों का पता चलता है: कॉर्नियल एंडोथेलियम (*) में ऑर्गेनेल्स अधिक विपरीत और स्पष्ट होते हैं क्योंकि ऊतक प्रसंस्करण प्रोटोकॉल के माध्यम से जारी रहता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल पूरा होने के साथ ही स्ट्रोमल कोलेजन और फाइब्रिलिन विवरण अधिक दृश्यमान (एरोहेड) हो जाते हैं। पैनल ए, डी और जी स्केल बार = 50 माइक्रोन पैनल बी, ई एंड एच स्केल बार = 10 माइक्रोन पैनल सी, एफ एंड आई स्केल बार = 1 माइक्रोन । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक, नमूना पिन और अंतिम तैयारी की योजनाबद्ध। (ए)ऊतक को राल मोल्ड के बहुत टिप पर एक ज्ञात अभिविन्यास में रखा जाना चाहिए और कार्बन काले संतृप्त राल से भरे मोल्ड के ऊपरी तीसरे हिस्से को। ऊतक से मोल्ड दूर का क्षेत्र स्पष्ट रहना चाहिए ताकि प्रयोग लेबल स्पष्ट रूप से देखा जा सके। (ख)नमूना पिन सतह एक ग्रिड पैटर्न का उत्पादन करने के लिए खरोंच किया जाना चाहिए, यह तैयार नमूना ब्लॉक और पिन के बीच कठोर करने के लिए साइनोएक्रेलेट गोंद के लिए संपर्क के एक बड़े क्षेत्र के लिए अनुमति देता है । (ग)कार्बन ब्लैक सैचुरेटेड राल को नमूना पिन हेड के साथ संपर्क का एक विस्तृत क्षेत्र बनाना चाहिए, हालांकि हीरे के चाकू से काटा गया क्षेत्र 1x1 मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए। टिप की ओर ब्लॉक को टैपर करना अच्छा अभ्यास है। यह हीरे के चाकू पर काटने की ताकतों को कम करता है और एक व्यापक आधार होने से, ब्लॉक खंड के दौरान पिन से अलग करने के लिए अधिक प्रतिरोधी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:इमेज कैप्चर सेटिंग्स की तुलना। (ए और बी)पैनल ए और बी पिक्सेल के एक समारोह के रूप में छवि की गुणवत्ता और संकल्प की तुलना करते हैं। पैनल ए 4 kV पर एक ३२ μs/पिक्सेल निवास समय का उपयोग कर बनाया गया था और शोर अनुपात के लिए एक कम संकेत से ग्रस्त है के रूप में बढ़े हुए इनसेट के "दानेदार" उपस्थिति में स्पष्ट है । पैनल बी 4 kV पर एक १०० μs/पिक्सेल निवास समय का उपयोग कर बनाया गया था । पिक्सेल निवास समय बढ़ाने शोर अनुपात के लिए संकेत बढ़ जाती है और सेलुलर विस्तार के एक बढ़े हुए स्तर से पता चलता है, लेकिन वृद्धि हुई पिक्सेल निवास समय ऊतक चार्ज करने के लिए नेतृत्व करने की क्षमता है और/ पैनल सी और डी समान एक्सपोजर स्थितियों के तहत कैप्चर की गई छवियों की तुलना करते हैं लेकिन दो अलग-अलग बीम केवी मूल्यों के साथ। इन पैनलों में ऊतक को बीम-प्रवेश गहराई में अंतर बनाने के लिए सोने-टोंड नैनोगोल्ड कणों के साथ लगाया गया था। पैनल सी 9 केवी पर कब्जा कर लिया गया था, जबकि पैनल डी 21 केवी पर कब्जा कर लिया गया था । बढ़ी हुई केवी में बढ़े हुए कंट्रास्ट(डी)का लाभ होता है, हालांकि ऊतक(सी)की अधिक गहराई से इलेक्ट्रॉनों को इकट्ठा करने के परिणामस्वरूप विवरण खो जाते हैं। एक बड़े क्रॉस सेक्शन के नमूने के परिणामस्वरूप, गैप 43 के लिए विशिष्ट इम्यूनोगोल्ड कणों की बड़ी संख्या दिखाई देती है जबकि गैर-विशिष्ट लेबलिंग समान रहती है जिसके परिणामस्वरूप सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि होती है। पैनल ए और बी स्केल बार = 2 माइक्रोन पैनल सी और डी स्केल बार = 1 माइक्रोन । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:बीम तीव्रता, केवी और स्पॉट आकार। (ए)ऊतक नमूने से संपर्क करने पर, इलेक्ट्रॉन बीम (हल्के नीले) एक अश्रु के आकार की बातचीत की मात्रा पैदा करता है, जिसमें से बीम इलेक्ट्रॉनों और ऊतक नमूने के बीच बातचीत से ऊर्जा के विभिन्न रूपों का उत्पादन होता है। अश्रु आकार बीम ऊर्जा के साथ ऊतक घनत्व और भारी धातु धुंधला का एक कार्य है, और इलेक्ट्रॉन बीम43के झुकाव कोण। जबकि एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग के दौरान एक्स-रे, बरमा इलेक्ट्रॉन और तृतीयक इलेक्ट्रॉनों का उत्पादन किया जाता है, प्राथमिक चिंता बैकस्कैटर (गहरे नीले) और माध्यमिक (हरे)इलेक्ट्रॉनों 13के साथ है। एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग के साथ उत्पादित छवि बैकस्कैटर इलेक्ट्रॉनों को इकट्ठा करके उत्पादित की जाती है। ये इलेक्ट्रॉन बीम और नमूने के बीच लोचदार बातचीत से उत्पन्न होते हैं, और एकत्र किए गए संकेत परमाणुओं की परमाणु संख्या पर अत्यधिक निर्भर हैं - इसलिए भारी धातु धुंधला44की आवश्यकता होती है। माध्यमिक इलेक्ट्रॉन बीम और नमूने के बीच लोचदार बातचीत से उत्पन्न होते हैं और उनके संकेत का पता लगाना सतह अभिविन्यास पर अत्यधिक निर्भर करता है। क्योंकि ब्लॉक-चेहरा एसबीएफ-एसईएम में सपाट है, माध्यमिक इलेक्ट्रॉन13एकत्र किए गए सिग्नल में सार्थक योगदान नहीं देते हैं। वास्तव में, ब्लॉक की सतह पर माध्यमिक इलेक्ट्रॉन संचय चार्ज करने का एक प्रमुख स्रोत हो सकता है और छवि गुणवत्ता2पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है। (ख)यह ग्राफ बीम तीव्रता, बीम केवी और स्पॉट साइज के बीच संबंध को दर्शाता है । स्पॉट आकार बीम का स्थानिक संकल्प है, और उत्पादित छवियों की संकल्प सीमा निर्धारित करता है। केवी कम करने से स्पॉट का आकार बढ़ जाता है, लेकिन विस्तार की महीन प्रशंसा के लिए इमेजिंग गहराई भी कम हो जाती है। इससे डिटेक्शन सिग्नल कम होने का असर भी होता है। बीम तीव्रता में वृद्धि स्पॉट आकार और संकेत का पता लगाने पर एक प्रारंभिक सुधार प्रदान करता है, लेकिन तेजी से ऊतक चार्ज के स्तर में वृद्धि होती है । अंततः, बीम तीव्रता और केवी मूल्यों को चुना नमूना निर्भर और सबसे अच्छा वैज्ञानिक सवाल पूछा जा रहा है के संबंध में अनुभवजन्य निर्धारित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:माउस कॉर्निया में इलास्टिन-मुक्त माइक्रोफिब्रिल बंडल नेटवर्क। कॉर्नियल स्ट्रोमा के भीतर केराटोसाइट्स (पीला, नारंगी और हरा) से निकटता से जुड़े माइक्रोफिब्रिल (सफेद) का 3 डी पुनर्निर्माण। माइक्रोफिब्रिल को निकट देखा जा सकता है, और कुछ मामलों में उथले खांचे के भीतर, कॉर्नियल केराटसाइट्स (तीर)(ए)। इलास्टिन-मुक्त माइक्रोफिब्रिल का यह नेटवर्क कॉर्नियल स्ट्रोमा(बी)के भीतर अलग-अलग परतों में आयोजित किया जाता है। स्केल बार = 2 माइक्रोन। पुनर्निर्मित छवि ब्लॉक एक्स और वाई एक्सिस में 45x45 माइक्रोन है, और 22x22x100 एनएम के संकल्प के साथ z धुरी में 30 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:स्ट्रोमल-एपिथेलियल सीमा पर बेसल लैमिना से गुजरने वाली कॉर्नियल नसों का पुनर्निर्माण। 3डी एक मर्मज्ञ तंत्रिका (बैंगनी) का पुनर्निर्माण क्योंकि यह बेसल लैमिना (हरा) से गुजरता है। इस तंत्रिका को प्रवेश से पहले विभाजित करने के लिए देखा जा सकता है। एपिथेलियम में प्रवेश करने के बाद, दोनों तंत्रिका शाखाओं का असर हुआ। तंत्रिका बंडल के स्ट्रोमल और एपिथेलियल भागों में माइटोकॉन्ड्रिया (पीला) दिखाई देता है। स्केल बार = 2.5 माइक्रोन। पुनर्निर्मित छवि ब्लॉक एक्स और वाई एक्सिस में 25x25 माइक्रोन है, और 12x12x100 एनएम के स्वर संकल्प के साथ जेड एक्सिस में 14 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7:परिधीय माउस कॉर्निया में लिम्बल वैक्यूलेचर और संबद्ध कोशिकाएं। एक एकल छवि(ए)एक 3 डी छवि ब्लॉक(बी)से देखा जा सकता है जिसके माध्यम से एक पोत, तंत्रिका बंडल, और संबद्ध कोशिकाओं यात्रा करते हैं । पैनल सी एंडोथेलियल सेल जंक्शनों को कवर करने के चारों ओर लिपटे एक संबद्ध पेरिसाइट (ग्रे) के साथ एक पुनर्निर्मित पोत (लाल) दिखाता है। एक तंत्रिका बंडल (नीला) इस पोत के निकट होने के साथ-साथ ऊतक के माध्यम से यात्रा करता है। एक न्यूट्रोफिल (पीला) पोत की लंबी धुरी के समानांतर देखा जा सकता है, इसके बहुरूपिक नाभिक के साथ इसके सेल शरीर के भीतर दिखाई देते हैं और छवि के दाईं ओर एक फलाव के रूप में दिखाई देते हैं। पोत के नीचे एक मस्तूल कोशिका (मजेंटा) दिखाई देती है। पैनल डी इस मस्तूल कोशिका को अलग करता है, जहां इसके कणिकाओं (हरे) को कोशिका के भीतर नाभिक (बैंगनी) को अधिक आसानी से देखा जा सकता है। पैनल ई सेलुलर पुनर्निर्माण पर मढ़ा सेलुलर संरचनाओं पर प्रकाश डाला गया, एंडोथेलियल नाभिक नीले रंग में चिह्नित के साथ, और अनुयायी माइक्रोकणों पोत lumen (नारंगी) में दिखाई देते हैं । तीर एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच सेल-सेल सीमाओं को दिखाते हैं, जिन्हें आगे पोत के चमकदार पक्ष पर कोशिकाओं के साथ विस्तारित उठाए गए लकीरें के रूप में देखा जा सकता है। पैनल एक स्केल बार = 2 माइक्रोन। इन कोशिकाओं के पुनर्निर्माण के लिए उपयोग किया जाने वाला इमेज ब्लॉक एक्स एंड वाई एक्सिस में 30x30 माइक्रोन और जेड एक्सिस में 42.5 माइक्रोन है, जिसमें 14.6x14.6x100 एनएम का स्वर संकल्प है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8:गैर मानव रहनुमा रेटिना तंत्रिका फाइबर परत के संवहनी नेटवर्क खंगाला। (A)8192x8192 px पर ली गई रहनुमा रेटिना की 200x200 माइक्रोन एसबीएफ-एसईएम छवि। नमूना स्थान कोई विकृति के साथ एक स्वस्थ आंख के अवर लौकिक रिम मार्जिन से ~ 500 माइक्रोन है। पैनलों में खंगाला गया छवि श्रृंखला सी एंड डी को 2048x2048 पीसी पर कब्जा कर लिया गया था, जिसमें इमेजिंग रुकी हुई थी ताकि इच्छुक क्षेत्रों को 8192x8192 पीसी पर इमेज किया जा सके । पैनल बी पैनल एका इनले एड क्षेत्र है, जो सीधे मूल छवि से लिया जाता है। बड़ी संख्या में एक्सॉन और उनके माइटोकॉन्ड्रिया पर ध्यान दें। (ग)ऑर्थोस्लाइस सेक्शन 200x200x200 एक नियंत्रण आंख अवर लौकिक तंत्रिका फाइबर परत की माइक्रोन ऊतक मात्रा के माध्यम से, वैक्यूलेचर खंडित के साथ। (घ)तंत्रिका फाइबर परत वास्कुलेचर का जेड-प्रोजेक्शन। यह श्रृंखला इस पद्धति का उपयोग करके एक बड़े क्षेत्र में संभव संकल्प को दर्शाती है। पैनल एक स्केल बार = 20 माइक्रोन पैनल बी स्केल बार = 2 माइक्रोन। इमेज सीरीज स्वराल रेजोल्यूशन 97.6x97.6x500 एनएम है। इंटरेस्ट पिक्सल रेजोल्यूशन का क्षेत्र 24.4x24.4 एनएम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9:विशाल दानियो(Devario malabaricus)कॉम्पैक्ट दिल में जहाजों के विभाजन और 3 डी मात्रा प्रतिपादन । (A)एक छवि ढेर में दो आयामी माइक्रोग्राफ, एक केंद्रीय वेंलर आकार के पोत (तीर) और एक एंडोथेलियल नाभिक (तीर) के प्रोफ़ाइल दिखा, आसपास के हृदय myocytes के साथ mitochondria और अच्छी तरह से संगठित sarcomeres (*) । (ख)एक केशिका आकार के पोत (तीर) के साथ छवि स्टैक का दो आयामी माइक्रोग्राफ। (ग)माइक्रोग्राफ स्टैक के Biorthogonal अनुमानों एक ऑर्थोगोनल स्लाइस के माध्यम से अनुमानित पैनल बी में केशिका दिखा । (घ)पुनर्निर्मित पोत को अस्तर करने वाली खंडित एंडोथेलियल कोशिकाओं का 3डी प्रतिपादन। हरे, लाल, नीले और बैंगनी रंग में सचित्र चार अलग-अलग एंडोथेलियल कोशिकाएं हैं; नीले रंग में चित्रित एंडोथेलियल सेल को पैनल बी (तीर) में क्रॉस सेक्शन में देखा जा सकता है, जबकि लाल (तीर) और हरे (तीर) में चित्रित एंडोथेलियल कोशिकाओं को पैनल ए पैनल ए एंड बी स्केल बार = 2 माइक्रोन में क्रॉस सेक्शन में देखा जाता है । एक्स एंड वाई एक्सिस में 30x30 माइक्रोन और 14.6x14.6x100 एनएम के स्वरोंल रेजोल्यूशन के साथ जेड एक्सिस में 16 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्र 10:इमेजिंग जटिलताओं और कलाकृतियों । (A)इस छवि की लहराती और विकृत प्रकृति इमेजिंग का परिणाम है कि एक पिक्सेल निवास समय है कि बहुत लंबा है का उपयोग कर इमेजिंग । यह राल ब्लॉक को तपता है, जिससे ब्लॉक का सामना नरम और रबड़ होता है जिसके परिणामस्वरूप काटने पर विकृत छवि होती है। (ख)इस छवि में कई कलाकृतियां हैं । तारांकन एक उच्च आवर्धन पर पूर्व इमेजिंग के कारण एक लहराती विरूपण इंगित करता है और पैनल एके समान, एक छोटे क्षेत्र पर बीम को ध्यान केंद्रित करने के साथ एक लंबे पिक्सेल निवास समय ने ब्याज के इस क्षेत्र में राल को नरम कर दिया है। जबकि एकत्र की गई उच्च आवर्धन छवि कलाकृतियों से मुक्त थी, इससे छवियों की एक बाद की श्रृंखला हो सकती है जहां ब्याज के क्षेत्र में अंतर्निहित नमूना विकृत दिखाई देता है। यह पैनल इमेजिंग के दौरान ब्लॉक चेहरे (तीर) पर मलबे संचय के मुद्दे को भी दिखाता है, जो पैनल ईमें तीर द्वारा भी दर्शाया गया है। यदि यह एक लगातार इमेजिंग समस्या बन जाता है, तो वैक्यूम को तोड़ना, कक्ष खोलना और हीरे के चाकू पर और नमूने के आसपास जमा मलबे को उड़ा देना आवश्यक होगा। ब्लॉक-फेस से इलेक्ट्रॉनों के छोटे निर्वहन से सफेद तीर सिर द्वारा चिह्नित तेजी से विपरीत परिवर्तन और रेखाएं हो सकती हैं। (ग)यह छवि ब्लॉक चेहरे पर चाकू खरोंच दिखाता है । यह एक क्षतिग्रस्त चाकू, या चाकू के किनारे पर मलबे संचय के कारण हो सकता है। (घ)विरूपित (तीर) इलेक्ट्रॉन बीम पर ध्यान केंद्रित करने का परिणाम है (खंड के बिना) ब्लॉक चेहरे के साथ समय की एक विस्तारित अवधि के लिए नमूना अभी भी इमेजिंग कक्ष में । (ई)ऊतकों के अनुचित निर्धारण सेलुलर संरचनाओं और संयोजी ऊतक (*) के जुदाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । (च)यदि आपके ऊतक या राल ब्लॉक में बड़ी मात्रा में चार्जिंग होती है, तो बाद में संचय और निर्वहन हो सकता है जो छवि को "लंघन" की ओर ले जाता है जैसा कि इस छवि में देखा जाता है। इन लंघन बिंदुओं (तीर) पर छवि में ऊतक की विकृति पर ध्यान दें। पैनल एक स्केल बार = 1 माइक्रोन पैनल बी स्केल बार = 2 माइक्रोन. पैनल सी स्केल बार = 5 माइक्रोन पैनल डी स्केल बार = 2 माइक्रोन पैनल ई स्केल बार = 25 उम। पैनल एफ स्केल बार = 50 उम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11:विभिन्न पिक्सेल निवास समय और बीम तीव्रता का उपयोग कर 3 केवी पर इमेजिंग ऊतक। सभी छवियों को एक 3 केवी बीम का उपयोग कर इकट्ठा कर रहे थे, बीम तीव्रता एक डिवाइस विशिष्ट 1 से 20 से लेकर पैमाने पर है । चित्रित क्षेत्र सफेद और लाल रक्त कोशिकाओं वाले संवहनी ल्यूमेन का है। इस कम केवी में सेलुलर विस्तार की सराहना करना मुश्किल है। पिक्सेल निवास समय बढ़ाने का बहुत कम प्रभाव पड़ा। 6 बेहतर छवि विपरीत करने के लिए बीम तीव्रता में वृद्धि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 12
चित्रा 12:विभिन्न पिक्सेल निवास समय और बीम तीव्रता का उपयोग कर 7 केवी पर इमेजिंग ऊतक। सभी छवियों को 7 केवी बीम का उपयोग करके एकत्र किया गया था, बीम तीव्रता 1 से 20 तक के डिवाइस-विशिष्ट पैमाने पर है। चित्रित क्षेत्र सफेद और लाल रक्त कोशिकाओं वाले संवहनी ल्यूमेन का है। 7 केवी में, बीम तीव्रता और पिक्सेल निवास समय में वृद्धि उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के लिए योगदान दिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 13
चित्र 13:विभिन्न पिक्सेल निवास समय और बीम तीव्रता का उपयोग कर 12 केवी पर इमेजिंग ऊतक। सभी छवियों को 12 केवी बीम का उपयोग करके एकत्र किया गया था, बीम तीव्रता 1 से 20 तक के डिवाइस-विशिष्ट पैमाने पर है। चित्रित क्षेत्र सफेद और लाल रक्त कोशिकाओं वाले संवहनी ल्यूमेन का है। 12 केवी पर, इमेजिंग पिक्सेल निवास समय और बीम तीव्रता को समायोजित करके अनुकूलित है। चार्जिंग कम/कम पिक्सेल निवास समय पर अनुपस्थित है, जबकि सेलुलर विस्तार और छवि विपरीत एक लंबे समय पिक्सेल निवास समय और उच्च बीम तीव्रता के साथ सबसे अच्छा कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस तरीके कागज का उद्देश्य ऊतक तैयारी और इमेजिंग पद्धति है कि हमारी प्रयोगशाला मज़बूती से उच्च संकल्प धारावाहिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों पर कब्जा करने की अनुमति दी है पर प्रकाश डाला है, और महत्वपूर्ण कदम है कि इस परिणाम के लिए नेतृत्व के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित नुकसान है कि जब SBF-SEM इमेजिंग का आयोजन हो सकता है बिंदु है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सफलता के लिए ऊतकों के उचित निर्धारण, नमूने में भारी धातुओं का प्रत्यारोपण, चार्जिंग को कम करने के लिए एम्बेडिंग राल के संशोधनों के साथ-साथ छवियों को इकट्ठा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप और इमेजिंग सेटिंग्स की समझ की आवश्यकता होती है। कहावत, "गुणवत्ता में, गुणवत्ता से बाहर" एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त स्वयंसिद्ध है। चूंकि एसबीएफ-एसईएम का लक्ष्य अक्सर अल्ट्रास्ट्रक्चरल विस्तार की सराहना या मात्रा है, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक विरूपण नहीं होता है, निर्धारण रणनीति को अतिरिक्त देखभाल दी जानी चाहिए। यदि ऊतक नमूनों की तैयारी में किसी भी बिंदु पर विकृत हो जाता है (यानी, सूजन, सिकुड़ने, या सेलुलर आकृति विज्ञान के व्यवधान से गुजरता है), तो ऊतक पुनर्निर्माण और मात्राकरण सटीक डेटा नहीं निकलेगा। इसके अलावा, गलत इमेजिंग सेटिंग्स के उपयोग से डेटा का नुकसान हो सकता है जिसे फिर से कब्जा नहीं किया जा सकता है क्योंकि एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग एक विनाशकारी प्रक्रिया है। इसके अतिरिक्त, नाजुक हीरे के चाकू के रूप में एक ऊतक नमूना लोड करते समय देखभाल का उपयोग किया जाना चाहिए जल्दबाजी या गलत नमूना तैयारी से क्षतिग्रस्त हो सकता है। इसके परिणामस्वरूप चाकू में चिप्स या ब्रेक हो सकते हैं, जो छवियों(चित्रा 10C)में दिखाई देने वाले खरोंच के निशान छोड़ सकते हैं। हीरे के चाकू को कैल्शियमयुक्त संरचनाओं, कठोर कणिकाओं, या गलती से एम्बेडेड ग्लास (उदाहरण के लिए, रीएजेंट एम्प्यूल्स से) द्वारा भी क्षतिग्रस्त किया जा सकता है।

जबकि आज तक एसबीएफ-एसईएम साहित्य के बहुमत 1 से 3 केवी की सीमा में बीम त्वरण वोल्टेज का उपयोग करता है, साथ पिक्सेल 1-5 μs/px के करीब रहता है (अंक 11)45,46,47,48,49, वर्तमान प्रोटोकॉल 7-12 केवी के त्वरण वोल्टेज और धारावाहिक इमेजिंग के लिए 12 μs/px के एक पिक्सेल निवास समय और ब्याज की इमेजिंग क्षेत्रों के लिए ३२ μs/px का उपयोग करता है (आंकड़े 12 और 13). ये सेटिंग्स, 100-200 एनएम की एक टुकड़ा मोटाई के साथ मिलकर जैविक ऊतक की एक विस्तृत श्रृंखला के उच्च गुणवत्ता और उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । बढ़ी हुई त्वरण वोल्टेज इसके विपरीत, संकल्प, साथ ही सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि के लिए अनुमति देता है। समय में वृद्धि और संकल्प और संकेत से शोर अनुपात बढ़ जाती है, जबकि वृद्धि की टुकड़ा मोटाई खंड के दौरान ब्लॉक सतह पर चार्ज कम हो जाता है और बाद की छवियों में बीम प्रेरित क्षति का मुकाबला14. हालांकि यह इमेजिंग विधि सम्मेलन से भिन्न हो सकती है, उत्पादित छवियां और डेटासेट खुद के लिए बोलते हैं। यदि हमें इस सफलता के कारण पर अटकलें लगानी थीं, तो यह संभव है कि यह उच्च केवी मूल्यों, लंबे समय तक पिक्सेल निवास समय और ब्लॉक तैयारी के हमारे अद्वितीय संयोजन का परिणाम है। इमेजिंग केवी बढ़ाने के परिणामस्वरूप इलेक्ट्रॉन बीम और नमूने के बीच बातचीत की मात्रा में वृद्धि हुई है। यह बातचीत की मात्रा दोनों गहरी है और साथ ही व्यापक है जिसके परिणामस्वरूप पता चला इलेक्ट्रॉनों की संख्या में सैद्धांतिक वृद्धि हुई है जो नमूना ब्लॉक के भीतर गहरे से उत्पन्न होती है, या ऊतक के एक व्यापक क्रॉस सेक्शन से होती है क्योंकि स्पॉट आकार अश्रु व्यास में बढ़ जाता है। चूंकि एसबीएफ-एसईएम ब्लॉक के सतह विस्तार में रुचि रखता है, इसलिए इसके परिणामस्वरूप सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सैद्धांतिक कमी आती है। हालांकि, केवी में वृद्धि भी नमूने में गहरी इलेक्ट्रॉनों धक्का जहां वे कम ब्लॉक से बचने की संभावना है और डिटेक्टर द्वारा एकत्र इलेक्ट्रॉनों के लिए योगदान करते हैं । अब पिक्सेल निवास समय और उच्च बीम तीव्रता के माध्यम से एक वृद्धि हुई संकेत के अतिरिक्त लाभ के साथ, यह संभव है कि इस इमेजिंग विधि बातचीत की मात्रा के भीतर उद्भव शोर के संबंध में नमूना सतह से संकेत में अधिक वृद्धि हुई है । इसके अतिरिक्त, कार्बन ब्लैक के साथ-साथ चांदी और सोने की कोटिंग के साथ पेश की गई बढ़ी हुई नमूना चालकता चार्ज बिल्डअप को सुधारने में मदद करती है जो अब ब्लॉक के भीतर और ब्लॉक-फेस से आगे गहरी होती है। सचमुच अंक 11, अंक 12, अंक 13 बताते हैं कि केवी के रूप में नमूना चार्ज बढ़ जाता है के रूप में यह संभवतः ब्लॉक में गहरी धक्का दिया है कम करने के लिए शुरू होता है । कम आवर्धन पर इमेज किए गए नमूनों को पारंपरिक सेटिंग्स का उपयोग करके पर्याप्त विपरीत के साथ कैप्चर किया जा सकता है, हालांकि इन छवियों में अक्सर क्लोज निरीक्षण पर विस्तार की कमी होती है। हमारे डेटा स्पष्ट रूप से बताते हैं कि अपेक्षाकृत उच्च आवर्धन का उपयोग करते समय जहां लक्ष्य सेलुलर विस्तार है, पारंपरिक सेटिंग्स में वृद्धि असाधारण परिणाम पैदा कर सकती है। पी गोगिन द्वारा 2020 लेख, एट अल अंतिम छवि गुणवत्ता पर इमेजिंग सेटिंग्स को बदलने के प्रभाव को रेखांकित करने वाली एक उपयोगी तालिका प्रदान करता है, और यदि उपन्यास ऊतकों के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन आवश्यक हो जाता है तो परामर्श करने के लिए एक उपयोगी संदर्भ है14. इस प्रोटोकॉल में अनुशंसित 100-200 एनएम स्लाइस मोटाई में तेजी से दर पर बड़े एसबीएफ-एसईएम डेटा सेट के संग्रह की अनुमति देने का अतिरिक्त लाभ है। उदाहरण के लिए 12μs/px पर छवियों का संग्रह करते समय, 2048x2048 px पर 100 माइक्रोन गहराई के माध्यम से इमेजिंग ~ 14 घंटे की आवश्यकता होती है, जबकि 100nm/section पर अनुभागित लेकिन ~56 घंटे की आवश्यकता होगी अगर 25nm/section पर अनुभागित । जबकि x, y संकल्प अनुभाग मोटाई के परिणामस्वरूप अपरिवर्तित रहता है, उच्च केवी मूल्यों और पिक्सेल निवास समय है कि बड़े वर्गों के साथ आने का उपयोग कर छवि के लिए जोड़ा क्षमता के लिए लेखांकन नहीं है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जेड-अक्ष के साथ संकल्प पीड़ित है । जेड-रिज़ॉल्यूशन का नुकसान एक महत्वपूर्ण विचार है और यह तय करते समय विचार किया जाना चाहिए कि राल ब्लॉक में और इमेजिंग विमान के संबंध में ऊतक को कैसे उन्मुख किया जाना चाहिए, और इसमें छोटे सेल सुविधाओं या इंटरैक्शन (जैसे, सिनैप्टिक इनवेजिरेशन या नैनोमीटर के दसियों के पैमाने पर इंट्रासेल्युलर सुविधाओं) के अध्ययन को बाधित करने की क्षमता है। हालांकि, रैपिड इमेजिंग समय के अलावा, इस प्रोटोकॉल में अतिरिक्त अतिरिक्त लाभ हैं कि यह तेजी से स्टीरियोलॉजिकल विश्लेषण के साथ-साथ दुर्लभ जैविक घटनाओं या कोशिकाओं के अध्ययन के लिए आदर्श डेटासेट पैदा करता है। बड़ा खंड मोटाई मैनुअल 3 डी पुनर्निर्माण में भी सहायता कर सकती है, क्योंकि 100 एनएम/अनुभाग में खंडित 100 माइक्रोन क्षेत्र को 1,000 छवियों के मैनुअल विभाजन की आवश्यकता होगी, जबकि 25 एनएम/अनुभाग में खंडित एक ही क्षेत्र को 4,000 छवियों के मैनुअल विभाजन की आवश्यकता होगी।

एसबीएफ-एसईएम को अपेक्षाकृत कम अवधि में बड़े डेटासेट पैदा करने का लाभ मिलता है। जबकि डेटा विश्लेषण स्टीरियोलॉजी जैसे मात्रात्मक तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है, जिस पर नीचे चर्चा की जाएगी, अक्सर छवि विभाजन के माध्यम से 3 डी पुनर्निर्माण बनाने के लिए जानकारीपूर्ण हो सकता है। एसबीएफ-एसईएम का उपयोग करके बनाई गई एक छवि स्टैक को स्वरों के संग्रह के रूप में सोचा जा सकता है, जबकि विभाजन इन स्वरों को उपयोगकर्ता-परिभाषित वस्तुओं को निर्दिष्ट करने की प्रक्रिया है जिससे ऊतक संरचनाओं के 3डी अभ्यावेदन बनाए जाते हैं। ये पुनर्निर्माण अक्सर ऊतक अल्ट्रास्ट्रक्चर और सेल-सेल इंटरैक्शन (चित्र 5, चित्र 6, चित्र 7, चित्र 8, चित्र 9)पर एक heretofore अनदेखी परिप्रेक्ष्य प्रदान करतेहैं । इसके अलावा, एक बार पुनर्निर्माण बनाया गया है यह खंडित ऊतक से जानकारी का खजाना निकालने के लिए पुनर्निर्माण में निहित डेटा का उपयोग करने के लिए संभव है । सतह क्षेत्र, मात्रा, लंबाई और दूरी के साथ-साथ कोणीय डेटा से लेकर पैरामीटर सभी आसानी से उपलब्ध हैं एक बार पुनर्निर्माण50, 51बनाया गया है। हालांकि यह अविश्वसनीय रूप से उपयोगी हो सकता है, खासकर जब पुनर्निर्मित डेटा सेट से खींचे गए वीडियो और छवियों के साथ जोड़ा जाता है, तो एसबीएफ-एसईएम डेटासेट से डेटा को एक्सट्रपलेशन करने का प्रयास करते समय मैनुअल सेगमेंटेशन के लिए आवश्यक समय एक महत्वपूर्ण विचार है। वर्तमान में एसबीएफ-एसईएम छवि स्टैक के मैनुअल और अर्ध-मैनुअल विभाजन के लिए मुफ्त और परचेजीय सॉफ्टवेयर उपलब्ध हैं। पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के लिए एक मुफ्त विकल्प इमेजजे के लिए इमेज प्रोसेसिंग पैकेज फिजी है, जो एक ओपन सोर्स इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम है, जिसमें एक सेगमेंटेशन एडिटर प्लगइन होता है जो मैनुअल सेगमेंटेशन52, 53के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, सॉफ्टवेयर पुनर्निर्माण एक वैकल्पिक मुक्त विभाजन विकल्प54 (चित्रा 8)प्रदान करता है। जबकि संभावित रूप से महंगे, पर्णीय विकल्पों में अक्सर अधिक मजबूत सुविधा सेट होते हैं, जैसे अर्ध-स्वचालित विभाजन प्रक्रियाएं या फिल्म और छवि निर्माण सूट। ऐसा ही एक विकल्प चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7 और चित्रा 9 (सामग्री की तालिकामें उपलब्ध विवरण) में पाए गए पुनर्निर्माण को बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके अतिरिक्त, आभासी वास्तविकता का उपयोग करके इसके निर्माण, विश्लेषण और प्रतिपादन के लिए उपकरण उपलब्ध हैं, जिसमें पुनर्निर्माण प्रक्रिया20,55को बहुत गति देने की क्षमता है। जबकि सभी अनुप्रयोगों के लिए हमेशा उपलब्ध नहीं है, कंप्यूटर असिस्टेड मैनुअल सेगमेंटेशन के लिए कई सॉफ्टवेयर टूल उपलब्ध हैं, जिनमेंविभाजन56, 57,58के लिए आवश्यक समय को बहुत कम करने की क्षमता है। इस्तेमाल सॉफ्टवेयर की परवाह किए बिना, काफी पूर्वविचार और सवाल की समझ का जवाब दिया जा रहा है, या ज्ञान में अंतर को भरा जा सकता है, धारावाहिक पुनर्निर्माण द्वारा विभाजन से पहले होना चाहिए, के रूप में प्रक्रिया श्रमसाध्य और समय गहन है ।

3 डी पुनर्निर्माण का उत्पादन अपने विचारों के साथ आता है । बड़े डेटा सेट के साथ प्रसंस्करण शक्ति एक सीमित कारक हो सकता है, और इसलिए सिस्टम संसाधनों के उपयोग को अनुकूलित करना एक उत्पादक कार्यप्रवाह को बनाए रखने और पुनर्निर्माण और प्रतिपादन प्रक्रिया को तेज करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। 3 डी पुनर्निर्माण प्रदान करते समय, अधिकांश सॉफ़्टवेयर खंडित छवि के ढेर को एक सतह में परिवर्तित कर देता है जिसमें परस्पर त्रिकोण शामिल होते हैं। यदि एक पुनर्निर्माण परियोजना बड़ी या जटिल है, इन त्रिकोण के प्रतिपादन कंप्यूटिंग शक्ति का एक बड़ा सौदा की आवश्यकता हो सकती है । 3 डी पुनर्निर्माण पर काम करते समय, यह त्रिकोण की संख्या को सीमित करने के लिए उपयोगी हो सकता है पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर खंडित छवियों को पुनर्निर्मित सतहों में बदलने के लिए उपयोग कर सकता है। यह विभाजन प्रक्रिया के दौरान 3 डी पुनर्निर्माण की प्रगति की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है। एक बार विभाजन पूरा हो जाने के बाद, पुनर्निर्माण की छवियों या वीडियो को प्रस्तुत करने से पहले त्रिकोण सीमा को हटाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, और यदि पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर इसके लिए अनुमति देता है, तो हमने सतह उत्पादन के बजाय मात्रा प्रतिपादन का उपयोग करके पुनर्निर्माण की प्रगति की निगरानी करने में सफलता पाई है। वॉल्यूम प्रतिपादन, जबकि प्रकाशन या प्रस्तुति के लिए बने चित्रों या वीडियो के लिए उपयुक्त नहीं है, को बहुत कम प्रसंस्करण शक्ति की आवश्यकता होती है और इस तरह पुनर्निर्माण की छवियों और वीडियो को पुनर्निर्माण और तैयार करते समय एक चिकनी अनुभव प्रदान करने में सहायक हो सकता है। इसके अतिरिक्त, यह सबसे अच्छा अभ्यास है जब मैन्युअल रूप से एक एसबीएफ-एसईएम डेटा सेट को सेगमेंट करते हैं ताकि हर वस्तु को अपने अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ खंगाला जा सके। यदि एपिथेलियल कोशिकाओं के क्षेत्र को उदाहरण के लिए खंगाला जा रहा है, तो सभी एपिथेलियल कोशिकाओं को "एपिथेलियम" नामक स्वर समूह को निर्दिष्ट करने के बजाय, प्रत्येक एपिथेलियल सेल को अपना मोनिकर (यानी, Epi1, Epi2, Epi3, आदि) सौंपा जाना चाहिए। यह अधिक स्वतंत्रता प्रदान करता है जब पुनर्निर्माण पूरा हो गया है, के रूप में प्रत्येक सेल या तो शामिल किया जा सकता है या अंतिम प्रतिपादन से बाहर रखा, अलग रंग या पारदर्शिता सौंपा, या हटा दिया या व्यक्तिगत रूप से शुरू की अगर एक वीडियो का उत्पादन किया जा रहा है । इसके अलावा, यह पूरे ऑब्जेक्ट समूह के बजाय प्रत्येक पुनर्निर्मित वस्तु से सतह क्षेत्र या मात्रा जैसे मैट्रिक्स को एकत्र करने की अनुमति देता है।

एसबीएफ-एसईएम छवि ढेर से मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए एक और अविश्वसनीय रूप से शक्तिशाली उपकरण स्टीरियोलॉजी का अभ्यास है। स्टीरियोलॉजी तीन आयामी वस्तुओं और उनके दो आयामी अभ्यावेदन (यानी, इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ) के बीच अंतर्निहित गणितीय संबंधों का लाभ उठाता है। एसबीएफ-एसईएम डेटा सेट स्टीरियोलॉजी के अनुप्रयोग के लिए आदर्श हैं, क्योंकि बड़े डेटासेट से 3डी जानकारी निकालने के लिए यह विधि खंडित पुनर्निर्माण की तुलना में काफी कम समय और श्रम-प्रधान है। स्टीरियोलॉजी में आम तौर पर ज्यामितीय ग्रिडों को यादृच्छिक, समान रूप से नमूना छवियों पर लागू किया जाता है और सेल/ऑर्गेनेल संख्या, लंबाई, सतह क्षेत्र, और मात्रा 21, 59,60,61, 62,63के सटीक और निष्पक्ष अनुमानों का उत्पादन करने के लिए पिछले50वर्षों में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। जबकि 3 डी पुनर्निर्माण प्रभावशाली हो सकते हैं और जैविक ऊतकों पर एक उपन्यास परिप्रेक्ष्य प्रदान करते हैं, यह अक्सर डेटा निष्कर्षण के लिए एक स्टीरियोलॉजिकल दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए बड़े नमूना आकारों के लिए तेज, अधिक सटीक, प्रजनन योग्य और अनुकूल होता है। जबकि स्टीरियोलॉजी64, 65,66के व्यावहारिक अनुप्रयोग पर चर्चा करने वाले कई कागजात हैं, कई पाठ्यपुस्तकें कार्यप्रणाली के उपयोगी, गहन अवलोकन प्रदान करती हैं और साथ ही कई स्टीरियोलॉजिकल ग्रिड प्रदान करती हैं जिन्हें ऊतक अल्ट्रास्ट्रक्चर67, 68,69के अध्ययन में लागू किया जा सकता है।

एसबीएफ-एसईएम एक शक्तिशाली इमेजिंग विधि है जो ऊतक अल्ट्रास्ट्रक्चर की त्रि-आयामी प्रशंसा के लिए अनुमति देती है। जबकि एसईएम रिज़ॉल्यूशन के साथ 3डी डेटासेट बनाने की क्षमता हमारी पहुंच के भीतर पहले से अनुत्तरदायी प्रश्न डालती है, उचित ऊतक तैयारी और एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग की समझ इस माइक्रोस्कोपी विधि का उपयोग करने वाले अध्ययनों की सफलता के लिए सर्वोपरि है। यह हमारी आशा है कि भविष्य के अध्ययनों के लिए इस प्रोटोकॉल के आवेदन जैविक रहस्यों है कि हमें चारों ओर में अधिक से अधिक अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व करेंगे, और हमें आगे मानव ज्ञान की सीमाओं में धक्का जारी है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ सैम हैलोन, एवलिन ब्राउन, और मार्गरेट गोंडो उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) आर01 ईवाई-018239 और पी 30 EY007551 (राष्ट्रीय नेत्र संस्थान) द्वारा भाग में, लायन फाउंडेशन फॉर दृष्टि द्वारा और एनआईएच 1R15 एचडी084262-01 (राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

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Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).

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