Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد واسع النطاق للسائل الزليلي الوسيط الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة بواسطة ثقافة المفاعل الحيوي 3D

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/62221
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,3
1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لإنتاج عدد كبير من الإكسوسومات من الدرجة GMP من الخلايا الجذعية الوسيطة للسائل الزليلي باستخدام مفاعل حيوي 3D.

Abstract

تم اقتراح الإكسوسومات التي تفرزها الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كمرشحين واعدين لإصابات الغضاريف وعلاج هشاشة العظام. تتطلب الإكسوسومات للتطبيق السريري إنتاجا واسع النطاق. وتحقيقا لهذا الهدف، نمت مركبات MSCs للسائل الزليلي البشري (hSF-MSCs) على حبات حاملة للصغر، ثم زرعت في نظام استزراع ديناميكي ثلاثي الأبعاد (3D). من خلال استخدام الثقافة الديناميكية 3D ، نجح هذا البروتوكول في الحصول على إكسوسومات واسعة النطاق من سوبرناتورز ثقافة SF-MSC. تم حصاد الإكسوسومات عن طريق الطرد المركزي الفائق والتحقق منها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل ، وفحص انتقال الجسيمات النانوية ، والنشاف الغربي. أيضا ، تم الكشف عن السلامة الميكروبيولوجية للإكسوسومات. تشير نتائج الكشف عن الإكسوسومات إلى أن هذا النهج يمكن أن ينتج عددا كبيرا من الإكسوسومات الجيدة من فئة ممارسات التصنيع (GMP). يمكن استخدام هذه الإكسوسومات في أبحاث البيولوجيا الإكسوسومية وعلاج هشاشة العظام السريرية.

Introduction

لا يزال الفصال العظمي (OA) ، الناتج عن غضروف المفاصل وانهيار العظام الأساسي ، يمثل تحديا شديدا يؤدي إلى الإعاقة 1,2. بدون إمدادات الدم والأعصاب ، تكون قدرة الغضروف على الشفاء الذاتي ضئيلة بمجرد الإصابة 3,4. في العقود الماضية ، حققت العلاجات القائمة على زرع الخلايا الغضروفية الذاتية (ACI) بعض التقدم في علاج OA5. لعزل الخلايا الغضروفية وتوسيعها ، من الضروري حصاد غضروف صغير من المنطقة غير الحاملة للوزن في مفصل OA ، مما يسبب إصابات في الغضروف. أيضا ، سيتطلب الإجراء عملية ثانية لزرع الخلايا الغضروفية الموسعة6. وبالتالي ، فإن العلاجات المكونة من خطوة واحدة لعلاج OA دون إصابات الغضروف تخضع لاستكشاف مكثف.

تم اقتراح الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كبدائل واعدة لعلاج OA 7,8. تنشأ MSCs من أنسجة متعددة ، ويمكن أن تتمايز إلى خلايا غضروفية مع تحفيز محدد. الأهم من ذلك ، يمكن ل MSCs تعديل الاستجابات المناعية عبر مضاد للالتهابات9. لذلك ، فإن MSCs لها مزايا كبيرة في علاج OA عن طريق إصلاح عيوب الغضروف وتعديل الاستجابة المناعية ، خاصة في بيئة الالتهاب. بالنسبة لعلاج OA ، جذبت MSCs من السائل الزليلي (SF-MSCs) مؤخرا الكثير من الاهتمام بسبب قدرتها على تمايز الخلايا الغضروفية الأقوى من مصادر MSC الأخرى10,11. والجدير بالذكر أنه في عيادة العظام ، يعد استخراج SF الالتهابي من تجويف المفصل علاجا روتينيا لتخفيف أعراض الألم لدى مرضى OA. عادة ما يتم التخلص من SF الالتهابي المستخرج كنفايات طبية. كل من المرضى والأطباء على استعداد للنظر في MSCs الذاتية المعزولة عن SF الالتهابية كعلاج OA مع عدد قليل جدا من الصراعات الأخلاقية. ومع ذلك ، فإن علاج SF-MSC معرض للخطر بسبب المخاطر السرطانية ، والتخزين طويل الأمد ، وحواجز الشحن البعيدة.

تحمل الإكسوسومات ، التي تفرزها العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك MSCs ، معظم المعلومات الحيوية للخلية الأم. وقد تم التحقيق فيه بشكل متعمق كعلاج خال من الخلايا12,13. وفقا للموارد المحدثة المتاحة على موقع حكومة التجارب السريرية (ClinicalTrials.gov) ، يتم بدء دراسات سريرية أكثر شمولا وإجراؤها في مجالات أبحاث السرطان وارتفاع ضغط الدم والأمراض العصبية التنكسية. يمكن أن يكون علاج الإكسوسوم SF-MSC تجربة مثيرة وصعبة للتعامل مع OA. يعد إنتاج الإكسوسومات من فئة ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) والإنتاج الخارجي على نطاق واسع أمرا ضروريا للترجمة السريرية. تم إجراء عزل الإكسوسوم على نطاق صغير على نطاق واسع على أساس زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D). ومع ذلك ، تحتاج استراتيجيات إنتاج exosome واسعة النطاق إلى التحسين. تم تطوير طريقة تصنيع إكسوسوم واسعة النطاق في هذه الدراسة ، استنادا إلى ثقافة SF-MSC الضخمة في ظروف خالية من الأجانب. بعد الطرد المركزي الفائق من المواد الفائقة لزراعة الخلايا ، تم التحقق من سلامة ووظيفة الإكسوزوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات الإنسان في مستشفى شنتشن الثاني للشعب. يوضح الشكل 1 مخططا تخطيطيا للإكسوسومات المعزولة من hSF-MSCs في بروتوكول المختبر.

1. ثقافة SF-MSCs البشرية وتحديد الهوية

  1. حصاد 20 مل من SF باستخدام حقنة وإبرة من مرضى الزراعة العضوية السريرية.
    1. تطهير مفصل الركبة لمريض OA. ثقب من وتر عظم الفخذ رباعي الرؤوس خارج الرضفة إلى التجويف المفصلي بإبرة 7 #.
    2. استخراج 10 مل من سائل المفصل. قم بتغطية موقع الثقب بعصا نقل الدم واضغط لمدة 5 دقائق.
  2. تخلص من المادة الفائقة SF بعد الطرد المركزي عند 1500 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. أعد تعليق بيليه الخلية مع 10 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) ، وأجهزة طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من PBS.
  4. أعد تعليق الكريات مع 10 مل من وسط زراعة MSC البشري بكثافة خلية تبلغ 5 × 104 خلايا / مل (انظر جدول المواد) ، ثم قم بطلاء التعليق في طبق 100 مم.
  5. احتضان الطبق على درجة حرارة 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  6. بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق تغيير الوسط واغسلها باستخدام 1x PBS. استبدال المتوسطة كل 3 أيام لمدة 2 أسابيع.
  7. جمع الخارقين ثقافة الخلية.
  8. تحديد SF-MSCs باستخدام قياس التدفق الخلوي.
    1. هضم الجيل الثالث (P3) من SF-MSCs ، جهاز طرد مركزي عند 1000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت واجمع حبيبات الخلية.
      ملاحظة: يتم التعرف على المقطع على أنه الثقافة الفرعية للخلايا إلى طبق زراعة آخر. يتم تصنيف الخلايا الأولية المعزولة من SF والمبذرة على الأطباق على أنها ممر صفر (P0). عند التقاء حوالي 75٪ ، يتم هضم الخلايا وفصلها عن الأطباق ، وزرعها على أطباق أخرى ، وتصنيفها على أنها P1.
    2. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (1٪ BSA في 1x PBS) إلى حبيبة الخلية (5 × 104) واتركها تقف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. جهاز طرد مركزي عند 1000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من supernatant ، وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من 1x PBS.
    4. أضف 1 ميكرولتر من CD105 و CD73 و CD90 و CD45 و CD34 و HLA-DR الجسم المضاد الفلوري أحادي النسيلة (نسبة التخفيف 1:100) (انظر جدول المواد) لكل أنبوب واحتضنه في RT لمدة 30 دقيقة.
    5. يغسل مرتين مع 1x PBS وتخلص من supernatant. جمع بيليه الخلية وإعادة تعليق في 100 ميكرولتر من 1x PBS.
    6. الكشف على مقياس التدفق الخلوي ما يصل إلى 10000 خلية باستخدام مرشحات 525/50 و 585/40 للكشف عن الفلوروفورات.

2.3D زراعة خلايا المفاعل الحيوي

  1. إعداد الناقل الصغير
    1. قم بنفخ 0.75 جم جاف من الناقلات الدقيقة (انظر جدول المواد) ورطب في 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 مل / غرام من الناقلات الدقيقة) لمدة 3 ساعات على الأقل في RT.
    2. قم بصب السوبرناتانت واغسل الناقلات الدقيقة لمدة 5 دقائق في DPBS الطازجة (50 مل / غرام من الناقلات الدقيقة). تخلص من PBS واستبدله ب 1x DPBS جديد (50 مل / غرام من الناقلات الدقيقة).
    3. تعقيم الناقلات الدقيقة عن طريق التعقيم (121 درجة مئوية ، 15 دقيقة ، 15 رطل لكل بوصة مربعة). اسمح للناقلات الدقيقة المعقمة بالاستقرار ، صب supernatant.
    4. شطف لفترة وجيزة الناقلات الدقيقة في وسط الثقافة (50 مل / غرام من الناقلات الدقيقة) في RT. السماح للناقلات الدقيقة بالاستقرار ، والتخلص من supernatant.
  2. المفاعل الحيوي للتروية
    1. تعقيم المفاعل الحيوي عن طريق التعقيم (121 درجة مئوية ، 15 دقيقة ، 15 رطل لكل بوصة مربعة).
    2. احسب عدد SF-MSCs وخصص 2.5 × 107 SF-MSCs والناقلات الدقيقة للمفاعل الحيوي الذي يتم دمجه مع وسيط استزراع MSC من فئة GMP (250 مل).
    3. ضع المفاعل الحيوي في حاضنة تحتوي على 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. قم بتدوير المفاعل الحيوي بسرعة 15 دورة في الدقيقة. تغيير وسط الثقافة كل 6 أيام.
    4. جمع الخارقين لزراعة الخلايا والناقلات الدقيقة لمزيد من التحليل بعد الزراعة لمدة 14 يوما.

3. تحديد الإكسوسوم والكشف عن السلامة

  1. الطرد المركزي الفائق
    1. الطرد المركزي لسوبر نات زراعة الخلايا عند 300 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع supernatant ؛ تخلص من الحطام الخلوي.
    2. الطرد المركزي للسوبرنات عند 2000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع supernatant ؛ تخلص من الحويصلات الأكبر (الأجسام الماصة وبعض الحويصلات الدقيقة الأكبر).
    3. قم بطرد مركزي السوبرنات مرة أخرى عند 10000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحويصلات الأكبر ؛ جمع الكريات وإعادة التعليق في 40 مل من 1x PBS.
    4. قم بالطرد المركزي للكريات المعاد تعليقها عند 120000 × g لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من supernatant ، وأعد تعليق الكريات التي تحتوي على exosomes في 500 ميكرولتر من 1x PBS.
  2. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
    ملاحظة: لكل تشغيل، تم حقن 500 ميكرولتر من العينة في الغرفة بمعدل تدفق 30 ميكرولتر/دقيقة. قم بإجراء التحليل عند 24.4 درجة مئوية -24.5 درجة مئوية.
    1. قم بتخفيف عينات الإكسوسوم المعزولة حديثا باستخدام 1x PBS معقمة إلى 1 مل تحتوي على 107-10 9 / مل من الجسيمات وحقنها في نظام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (انظر جدول المواد).
    2. اضبط نظام الالتقاط والتحليل يدويا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تصور الجسيمات عن طريق تشتت ضوء الليزر والتقاط حركتها البراونية على الفيديو الرقمي.
    3. قم بتحليل أشرطة الفيديو المسجلة باستخدام البرنامج (انظر جدول المواد) استنادا إلى تتبع ما لا يقل عن 200 جسيم فردي لكل تشغيل.
  3. المجهر الإلكتروني الناقل
    1. إصلاح exosomes في 4٪ بارافورمالديهايد (في الباردة 1x DPBS) لمدة 5 دقائق.
    2. جبل 5 ميكرولتر من الإكسوسومات على الشبكات النحاسية. في هذه التجربة ، يكون تركيز الإكسوسومات 1 ملغ / مل مقدرا بواسطة مجموعة فحص البروتين (انظر جدول المواد).
    3. قم بتضمين الإكسوسومات في حمض الفوسفوتونجستيك بنسبة 3٪ لمدة 10 دقائق على الجليد. إزالة الحمض الزائد وتجفيف العينات في RT.
    4. صور العينات الإكسوسومية بواسطة TEM عند جهد تسارع يبلغ 100 كيلو فولت.
  4. نشاف غربي
    1. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل (1٪ Triton X-100 ، 0.1٪ SDS ، 0.1 M Tris HCl ، الرقم الهيدروجيني 7) وكوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد) إلى الإكسوسومات.
    2. امزج الإكسوسومات في المخزن المؤقت للتحلل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل واتركها تقف على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    3. الطرد المركزي للخليط في 9,391 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع supernatant. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة البروتين (انظر جدول المواد).
    4. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل البروتين 4x وقم بتسخينه عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    5. قم بتحميل 15 ميكرولتر من البروتينات بتركيز 10 مجم / مل ويتم تشغيله بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي (120 فولت ، 70 دقيقة) والنشاف الكهربائي عند 100 فولت ، 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    6. الكشف عن العلامات غير الخاصة بالإكسوسوم (الكالنكسين) والمؤشرات الحيوية الإكسوسومية (CD9 و CD63 و CD81) عن طريق النشاف الغربي الفلورسنت (انظر جدول المواد).
  5. اختبار السلامة
    1. للكشف عن البكتيريا والفطريات والمتفطرة السلية اتبع الخطوات 3.5.2-3.5.5.
    2. بذور 100 ميكرولتر من محلول الإكسوسوم (1 ملغم / مل) على صفيحة زراعة أجار الدم (انظر جدول المواد) واحتضن صفيحة الاستزراع عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    3. بذور 100 ميكرولتر من محلول الإكسوسوم (1 ملغم / مل) على صفيحة متوسطة الحجم من سابورود أجار (انظر جدول المواد) وتحضن عند 35 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    4. بذور 100 ميكرولتر من محلول الإكسوسوم (1 ملغم/مل) على صفيحة متوسطة من مستزرعة لوينشتاين-جنسن (انظر جدول المواد) وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع.
    5. الكشف عن ظهور البكتيريا والفطريات والمتفطرة السلية عن طريق الملاحظة العيانية.
      ملاحظة: معايير تقييم سلامة الإكسوسومات هي عدم وجود كائنات دقيقة على لوحة الثقافة.
    6. للكشف عن الميكوبلازما، اتبع الخطوات 3.5.7-3.5.9.
    7. أعد تعليق الإكسوسومات في 50 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت المضمن في المجموعة وقم بتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    8. تضخيم الميكوبلازما في محلول إكسوسوم باستخدام مجموعة الكشف عن الميكوبلازما PCR (انظر جدول المواد).
    9. الكشف عن منتجات PCR على 1.5٪ هلام الأغاروز الكهربائي (30 دقيقة، 120 فولت).

4. في المختبر الكشف عن وظيفة exosome

  1. وضع العلامات على الإكسوسوم
    1. قم بتسمية 100 ميكرولتر من الإكسوسومات (1 ملغم / مل) مع 1 ملليمتر ديل (1000x) (انظر جدول المواد) واحتضنها في RT لمدة 30 دقيقة.
    2. استرجع الإكسوسومات عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100,000 × g لمدة 70 دقيقة. أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من 1x PBS.
  2. تحميل Cy3-miR-140 يحاكي في exosomes
    1. امزج 1 ميكروغرام / ميكرولتر من البروتين الخارجي و 5 ميكرومول / مل من Cy3-miR-140 في حجم نهائي من 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت الكهربائي (1.15 mM فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 7.2) ، 25 mM كلوريد البوتاسيوم و 21٪ (v / v) (انظر جدول المواد).
    2. انقل الخليط إلى كوفيت كهربائي بارد بحجم 0.4 سم وبوترات كهربائية بسعة 300 فولت/100 ميكروفهرنهايت باستخدام نظام نقل الجينات (انظر جدول المواد).
    3. مباشرة بعد الكهربية ، حافظ على الخليط في RT لمدة 30 دقيقة لضمان استعادة الغشاء الخارجي بالكامل.
    4. عالج المخاليط بوحدة واحدة من RNase A (انظر جدول المواد) لمدة 20 دقيقة للقضاء على miRNA الذي يحاكي خارج الإكسوسومات.
    5. الطرد المركزي الفائق لخليط الإكسوسوم عند 120000 × غرام لمدة 90 دقيقة ، وتخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الإكسوسومات في 500 ميكرولتر من 1x PBS.
  3. فحص امتصاص الإكسوسوم
    1. زرع الخلايا الغضروفية (1 × 107) في أطباق متحدة البؤرة 35 مم مع 1 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS.
    2. بعد 24 ساعة، عالج الخلايا الغضروفية باستخدام إكسوسومات تحمل علامة DiI (100 نانوغرام/مل) أو إكسوسومات محملة ب cy3-miR-140 (100 نانوغرام/مل) لمدة ساعة واحدة.
    3. اغسل ب 1x PBS ثلاث مرات ، ثم قم بلصقه باستخدام DAPI (10 نانوغرام / مل) لمدة 10 دقائق في RT.
    4. سجل إشارة التألق في المجهر الفلوري للمسح بالليزر البؤري (CLSM) باستخدام المرشحات المناسبة (انظر جدول المواد).

5. التحليل الإحصائي

  1. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج الإحصائية المناسبة.
    ملاحظة: تم التعبير عن البيانات التمثيلية في كل رقم كمتوسط ± SD. تم استخدام اختبار t للطالب للمقارنة بين مجموعتين باستخدام برنامج الإحصاء. تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا بمضاعف Tukey في حالة المقارنات بين مجموعات متعددة. قيم P <0.05 (*) أو <0.01 (**) أو <0.001 (***).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد العلامات السطحية ل SF-MSCs ، وفقا للحد الأدنى من المعايير لتحديد MSCs البشرية الموصى بها من قبل الجمعية الدولية للعلاج الخلوي14,15. كشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن SF-MSCs المستزرعة في هذه الدراسة استوفت معايير تحديد MSCs. وكانت سلبية بالنسبة ل CD34 و CD45 و HLA-DR (أقل من 3٪) وإيجابية ل CD73 و CD90 و CD105 (أعلى من 95٪) (الشكل 2).

تحت المجهر المقلوب ، لوحظ أن SF-MSCs تتكاثر على الناقلات الدقيقة (الشكل 3A). بعد هضم الخلايا وغسلها من لوحة ثقافة 2D والناقلات الدقيقة للثقافة 3D ، تم حساب رقم الخلية. بالمقارنة مع ثقافة 2D ، حفزت الثقافة ثلاثية الأبعاد SF-MSC على التكاثر بسرعة أكبر من 6 أيام فصاعدا (الشكل 3B). تم تقديم نتائج ثلاث تجارب مستقلة.

لتحديد الإكسوسومات (Exos) من SF-MSCs من ثقافة 2D و 3D ، تم الكشف عن البروتينات المرتبطة بالإكسوسوم (CD63 و CD9 و CD81) والبروتين السلبي (calnexin) باستخدام النشاف الغربي. كشفت النتائج أن 2D-Exos و 3D-Exos يعبرون عن CD63 و CD9 و CD81 ، في حين أنهم سلبيون للكالنكسين (الشكل 4A). أيضا ، تم فحص قطر exosome والمورفولوجيا باستخدام NTA و TEM. أظهر تحليل الرؤية النانوية أن قطر 2D-Exos (الشكل 4B) و 3D-Exos (الشكل 4D) يبلغ حوالي 120 نانومتر. كشف تحليل المجهر الإلكتروني للإرسال عن مورفولوجيا 2D-Exos و 3D-Exos ، مما يدل على الحويصلات الكروية تقريبا (الشكل 4C ، E).

بعد الثقافة ثلاثية الأبعاد ، يكون تركيز الجسيمات من جزيئات بحجم 30-160 نانومتر هو 4.0 × 106 لكل مل تم تحليله باستخدام NTA. ومع ذلك ، بعد ثقافة 2D ، فإن تركيز الجسيمات من جسيمات 30-160 نانومتر هو 2.5 × 106 لكل مل (الشكل 5A). عند حساب محصول البروتين exosome في الوسط ، أنتجت ثقافة 3D بروتينا إكسوسوميا أكثر من ثقافة 2D (الشكل 5B). وبالتالي ، بالمقارنة مع ثقافة 2D ، عززت ثقافة 3D بشكل كبير العائد exosome.

تم تصنيف الإكسوسومات أولا ب Dil ، ثم تم احتضانها بتركيز 10 ميكروغرام / مل مع الخلايا الغضروفية لمدة 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات لفحص ما إذا كانت الإكسوسومات يمكن أن تدخل الخلايا الغضروفية الأولية في المختبر. دخلت الإكسوسومات المسماة ديل الخلايا الغضروفية الأولية ، مع رؤية الذروة في 3 ساعات (الشكل 6).

للكشف عن وظيفة الإكسوسومات كحاملات نانوية ، تم تحميل الإكسوسومات ب miR-140 المسمى Cy3 من خلال الكهربية ، ثم عولجت بالخلايا الغضروفية بتركيز 10 ميكروغرام / مل لمدة 3 ساعات. أظهرت النتائج أن الإكسوسومات يمكن أن توصل miR-140 إلى الخلايا الغضروفية (الشكل 7). جميع النتائج استوفت المواصفات ؛ كانت جميع العينات معقمة وسلبية للميكوبلازما.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تخطيطي للإكسوسومات المعزولة من hSF-MSCs في المختبر.

Figure 2
الشكل 2: تحديد SF-MSCs عن طريق قياس التدفق الخلوي. يظهر قياس التدفق الخلوي النمط المناعي الإيجابي أو السلبي ل hSF-MSCs. (أ) وضع العلامات باستخدام جسم مضاد للتحكم في النمط المتماثل IgG1. (ب) CD73 موجب ، و CD34 سلبي. (C) CD90 موجب ، و CD45 سلبي. (D) CD105 موجب ، و HLA-DR سالب ، والمعروفة باسم علامات MSC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: منحنى نمو SF-MSC. (A) صور تمثيلية تظهر SF-MSCs (الأسهم الحمراء) على الناقلات الدقيقة تحت المجهر المقلوب (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ب) منحنى نمو SF-MSC تحت ثقافة 2D و 3D. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحديد الإكسوسومات . (أ) نتائج النشاف الغربية ل 2D-Exos و 3D-Exos. (ب) تحليل الرؤية النانوية لقطر 2D-Exos و 3D-Exos. (ج) الكشف عن TEM لمورفولوجيا 2D-Exos و 3D-Exos. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: العائد المعزز لإنتاج الإكسوسوم بواسطة ثقافة المفاعل الحيوي ثلاثي الأبعاد . (أ) النتائج التمثيلية لحجم الإكسوسوم التي تم تحليلها بواسطة NTA. (ب) محصول البروتين = البروتين الخارجي (ميكروغرام) / الوسط المشروط (مل). تظهر المخططات العائد لكل طريقة ومتوسط ± SD لجميع القياسات (** p < 0.01). تم إجراء مقارنات إحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه مع تصحيح Bonferroni بعد المخصص واختبار t للطالب. ** p < 0.01 اعتبر فرقا كبيرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 صور تمثيلية تبين استيعاب الإكسوسومات المسماة بدل بواسطة الخلايا الغضروفية الأولية. تم احتضان الخلايا الغضروفية مع الإكسوسومات التي تحمل علامة ديل لمدة 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات. تم تصنيف الإكسوسومات ب Dil (أحمر) ، وتم تصنيف النوى ب Hoechst (أزرق). تم الكشف عن العينات عند تكبير 60x. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: التسليم في المختبر ل miR-140 بواسطة exosomes MSC. بعد أخذ miR-140 المسمى Cy3 الذي تم تغليفه في الإكسوسومات المشتقة من SF-MSCs ، تم تصوير الخلايا الغضروفية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم استخدام الخلايا الجذعية الوسيطة على نطاق واسع في الطب التجديدي بسبب تجديدها الذاتي ، وتمييزها إلى خلايا الأنسجة ذات الوظائف المتخصصة ، وتأثيرات paracrine16,17. ومن الجدير بالذكر أن تأثيرات الباراكرين التي تمارسها الإكسوسومات قد جذبت الكثير من الاهتمام18. تحمل الإكسوسومات المعلومات الحيوية ل MSCs وتؤدي وظيفتها البيولوجية وتتغلب على أوجه القصور في MSC ، مثل التخزين والشحن المزعجين. وبالتالي ، تم استخدام الإكسوسومات المشتقة من MSCs للتدخلات العلاجية ، والتي جذبت أكبر قدر من الاهتمام في علاج OA.

حاليا ، هناك طريقتان لنشر MSCs ، ثقافة 2D وثقافة ثلاثية الأبعاد (3D)19. ثقافة 2D هي طريقة تقليدية لزراعة MSCs للدراسات في المختبر بتكاليف منخفضة. ومع ذلك ، فهي تستغرق وقتا طويلا ومحدودة في إمكانات الحجم. أيضا ، انتشار MSC في البيئة الدقيقة ثنائية الأبعاد يستنتج بسرعة الجذعية20,21 ، واحدة من أكثر الخصائص أهمية ل MSCs. وبالتالي ، لا يمكن لثقافة 2D تلبية متطلبات العلاج MSC. في هذه الدراسة ، بهدف SF-MSCs في علاج OA ، نسعى جاهدين للحفاظ على خصائص SF-MSC باستخدام ثقافة مفاعل حيوي 3D ، والذي يمكن أن يحاكي بدقة أكبر البيئة الدقيقة البيولوجية. في الآونة الأخيرة ، استخدم باحثون آخرون السقالات أو 3D القائمة على الناقلات الدقيقة لثقافة MSCs. وجدنا أن سقالات الكولاجين 3D سمحت بإكسوسومات أكثر تركيزا تنتجها MSCs المشتقة من نخاع العظام البشري من ثقافة 2D23.

نظرا لأن الإكسوسومات يمكن أن تؤدي جزءا كبيرا من وظيفة MSC مع تجنب بعض أوجه القصور في MSCs ، فإننا نهدف إلى إنتاج exosomes لعلاج OA. كما كشفت هذه الدراسة عن وظيفة الإنتاج والتسليم الإكسوسوم باستخدام هذا النظام استنادا إلى الكمية الكبيرة والجودة العالية لانتشار MSC للثقافة 3D. تم استخدام نظام زراعة الخلايا الدوارة (RCCS) لزراعة 3D لإنتاج exosomes من انتشار MSC على نطاق واسع. بالمقارنة مع ثقافة قارورة 2D التقليدية ، قد يتجنب نظام الثقافة 3D هذا التلوث من التغيير المتوسط المتكرر ومرور الخلايا. الأهم من ذلك ، أظهرت هذه الدراسة أن المفاعل الحيوي 3D يمكن أن يعزز إنتاج الإكسوسوم لتلبية متطلبات الدراسة السريرية. تجدر الإشارة إلى أن الإكسوسومات المعزولة من supernatants ثقافة 3D يمكن أن تقدم miRNAs إلى الخلايا ، مما يشير إلى أن ثقافة 3D لا تتداخل مع وظيفة exosome. تدعم نتائج الكشف عن الميكروبات والسموم الداخلية أن هذه الدراسة قد أنشأت بروتوكولا يمكن أن ينتج الإكسوسومات ، وهي آمنة بيولوجيا وواعدة لعلاج OA. في الوقت الحاضر ، لا يمكن للكمية الخارجية المنتجة في هذه الدراسة تلبية الاحتياجات التجارية. وبالتالي ، يجب تطوير استراتيجيات لكمية هائلة من إنتاج الإكسوزوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية منافسة.

Acknowledgments

المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81972116، رقم 81972085، رقم 81772394)؛ البرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ (No.2018B0303110003) ؛ مشروع قوانغدونغ للتعاون الدولي (No.2021A0505030011)؛ مشاريع شنتشن للعلوم والتكنولوجيا (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (No.2020M682907) ؛ مؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية الأساسية (رقم 2021A1515010985) ؛ مشروع سانمينغ للطب في شنتشن (SZSM201612079) ؛ صناديق خاصة لبناء مستشفيات رفيعة المستوى في مقاطعة قوانغدونغ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA assay kit ThermoFisher 23227 Protein concentration assay
Blood agar plate Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. P0903 Bacteria culture
CD105 antibody Elabscience E-AB-F1243C Flow cytometry
CD34 antibody Elabscience E-AB-F1143C Flow cytometry
CD45 antibody BD Bioscience 555483 Flow cytometry
CD63 antibody Abclonal  A5271 Western blotting
CD73 antibody Elabscience E-AB-F1242C Flow cytometry
CD81 antibody ABclonal  A5270 Western blotting
CD9 antibody Abclonal  A1703 Western blotting
CD90 antibody Elabscience E-AB-F1167C Flow cytometry
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810R
CO2 incubator Thermo Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy ZEISS LSM 800
Cytodex GE Healthcare Microcarrier
Dil ThermoFisher D1556 Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit BI 20-700-20 Mycoplasma detection
Flowcytometry Beckman MSC identification
Gene Pulser II System Bio-Rad Laboratories 1652660 Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2 GraphPad Software, Inc. Version 8.0.2
HLA-DR antibody Elabscience E-AB-F1111C Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. T0573 Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro StemRD MGro-500 MSC culture
Nanosight NS300 Malvern Nanosight NS300 Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software Malvern Data analysis
Odyssey FC Gene Company Limited Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer Sigma D3911 Gene transfection
Protease inhibitors cocktail Sigma P8340 Proteinase inhibitor
RNase A Qiagen 158924 Removal of RNA
Sabouraud agar plate Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. P0919 Fungi culture
TEM JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-4HD 3D culture
Ultracentrifuge Beckman Optima XPN-100 Exosome centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
  2. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  3. Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
  4. Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
  5. Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
  6. Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
  7. McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
  8. Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
  9. Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
  10. Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
  11. Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
  12. Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
  13. Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  15. Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
  16. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  17. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  18. Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
  19. Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
  22. Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
  23. Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).

Tags

علم الأحياء ، العدد 185 ، الإكسوسوم ، السائل الزليلي ، الخلايا الجذعية الوسيطة ، ثقافة 3D
إعداد واسع النطاق للسائل الزليلي الوسيط الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة بواسطة ثقافة المفاعل الحيوي 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duan, L., Li, X., Xu, X., Xu, L.,… More

Duan, L., Li, X., Xu, X., Xu, L., Wang, D., Ouyang, K., Liang, Y. Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture. J. Vis. Exp. (185), e62221, doi:10.3791/62221 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter