Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando um biorreator 3D.
Abstract
Exossomos secretados por células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridos como candidatos promissores para lesões cartilaginosas e tratamento da osteoartrite. Exossomos para aplicação clínica requerem produção em larga escala. Para esse fim, as MSCs do líquido sinovial humano (hSF-MSCs) foram cultivadas em esferas de microcarreador e, em seguida, cultivadas em um sistema de cultura tridimensional dinâmico (3D). Através da utilização da cultura dinâmica 3D, este protocolo obteve com sucesso exossomos em larga escala de sobrenadantes da cultura SF-MSC. Os exossomos foram colhidos por ultracentrifugação e verificados por microscópio eletrônico de transmissão, ensaio de transmissão de nanopartículas e western blotting. Além disso, a segurança microbiológica dos exossomos foi detectada. Os resultados da detecção de exossomos sugerem que essa abordagem pode produzir um grande número de exossomos de boas práticas de fabricação (BPF). Esses exossomos podem ser utilizados em pesquisas de biologia de exossomos e tratamento clínico da osteoartrite.
Introduction
A osteoartrite (OA), resultante da cartilagem articular e da degradação óssea subjacente, continua sendo um desafio grave que leva à incapacidade 1,2. Sem suprimento de sangue e nervos, a capacidade de auto-cicatrização da cartilagem é mínima uma vez lesada 3,4. Nas últimas décadas, terapias baseadas no implante autólogo de condrócitos (ACI) têm feito alguns progressos no tratamento da OA5. Para o isolamento e expansão dos condrócitos, é necessária a colheita de pequenas cartilagens da área de suporte de peso da articulação OA, causando lesões na cartilagem. Além disso, o procedimento exigirá uma segunda operação para implantar os condrócitos expandidos6. Assim, terapias de uma etapa para o tratamento da OA sem lesões cartilaginosas estão sob extensa exploração.
As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridas como alternativas promissoras para o tratamento da OA 7,8. Originárias de múltiplos tecidos, as CTMs podem se diferenciar em condrócitos com estimulação específica. É importante ressaltar que as CTMs podem modular as respostas imunes por meio da anti-inflamação9. Portanto, as MSCs possuem vantagens significativas no tratamento da OA, reparando defeitos da cartilagem e modulando a resposta imune, especialmente no meio inflamatório. Para o tratamento da OA, as CTMs do líquido sinovial (SF-MSCs) têm atraído recentemente muita atenção devido à sua maior capacidade de diferenciação de condrócitos do que outras fontes deCTMs 10,11. Notavelmente, na clínica ortopédica, a extração de SF inflamatória da cavidade articular é uma terapia de rotina para aliviar o sintoma de dor de pacientes com OA. A SF inflamatória extraída geralmente é descartada como resíduo médico. Tanto os pacientes quanto os médicos estão prontos para considerar as CTMs autólogas isoladas da SF inflamatória como tratamento da OA com muito poucos conflitos éticos. No entanto, a terapia SF-MSC está comprometida devido a riscos tumorigênicos, armazenamento de longo prazo e barreiras de remessa distantes.
Os exossomos, secretados por muitos tipos de células, incluindo MSCs, carregam a maior parte da bioinformação da célula-mãe. Tem sido investigada em profundidade como terapia livre de células12,13. De acordo com os recursos atualizados disponíveis no site do governo de ensaios clínicos (ClinicalTrials.gov), estudos clínicos exossômicos mais extensos são iniciados e realizados nos campos de pesquisa de câncer, hipertensão e doenças neurodegenerativas. O tratamento com exossomos SF-MSC pode ser um estudo empolgante e desafiador para lidar com a OA. A produção de exossomos de boas práticas de fabrico (BPF) e de exossomas em larga escala é essencial para a tradução clínica. O isolamento exossomático em pequena escala tem sido amplamente realizado com base em cultura de células bidimensionais (2D). No entanto, as estratégias de produção de exossomos em larga escala precisam de otimização. Um método de fabricação de exossomos em larga escala foi desenvolvido neste estudo, baseado na cultura maciça de SF-MSC em condições livres de xeno. Após a ultracentrifugação de sobrenadantes de cultura celular, a segurança e a função do exossomo foram validadas.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana do Segundo Hospital Popular de Shenzhen. Um diagrama esquemático de exossomos isolados do protocolo in vitro de hSF-MSCs é mostrado na Figura 1.
1. Cultura e identificação de SF-MSCs humanas
- Colher 20 mL de SF usando seringa e agulha de pacientes clínicos com OA.
- Desinfetar a articulação do joelho do paciente com OA. Punção do tendão do quadríceps femoral fora da patela para a cavidade articular com uma agulha 7#.
- Extraia 10 mL do fluido articular. Cubra o local da punção com o bastão de transfusão e pressione por 5 min.
- Rejeitar o sobrenadante SF após centrifugação a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C.
- Ressuspender o pellet celular com 10 mL de solução salina 1x tampão fosfato (PBS), centrifugar a 1.500 x g por 10 min a 4 °C e descartar o PBS.
- Ressuspeite o pellet com 10 mL de meio de cultura MSC humano a uma densidade celular de 5 x 104 células/mL (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, coloque a suspensão em um prato de 100 mm.
- Incubar o prato a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO2.
- Após 48 h, retire as células não aderentes trocando o meio e lave com 1x PBS. Substitua o meio a cada 3 dias por 2 semanas.
- Colete os sobrenadantes da cultura celular.
- Identificar SF-MSCs usando citometria de fluxo.
- Digerir a terceira geração (P3) de SF-MSCs, centrífuga a 1.000 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e colete o pellet celular.
NOTA: Uma passagem é reconhecida como a subcultura das células para outro prato de cultura. As células primárias isoladas de SF e semeadas em pratos são rotuladas como passagem zero (P0). Com cerca de 75% de confluência, as células são digeridas e separadas dos pratos, semeadas em outros pratos e rotuladas como P1. - Adicione 400 μL de tampão de bloqueio (1% BSA em 1x PBS) ao pellet da célula (5 x 104) e deixe-o repousar durante 15 min à temperatura ambiente (RT).
- Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 100 μL de 1x PBS.
- Adicionar 1 μL de CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, anticorpo fluorescente monoclonal HLA-DR (razão de diluição 1:100) (ver Tabela de Materiais) por tubo e incubar a RT durante 30 min.
- Lave duas vezes com 1x PBS e descarte o sobrenadante. Recolher o pellet celular e ressuspender em 100 μL de 1x PBS.
- Detectar em um citômetro de fluxo até 10.000 células usando filtros de 525/50 e 585/40 para detectar os fluoróforos.
- Digerir a terceira geração (P3) de SF-MSCs, centrífuga a 1.000 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e colete o pellet celular.
2.3D cultura de células de biorreator
- Preparação de microtransportadores
- Inchar 0,75 g secos de microcarreadores (ver Tabela de Materiais) e hidratar em 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 mL/g de microcarreadores) por pelo menos 3 h no RT.
- Decantar o sobrenadante e lavar os microtransportadores por 5 min em DPBS fresco (50 mL/g de microcarreadores). Descarte o PBS e substitua-o por 1x DPBS fresco (50 mL/g de microcarreadores).
- Esterilizar os microcarreadores por autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi). Deixe os microportadores esterilizados se assentarem, decantando o sobrenadante.
- Enxaguar brevemente os microcarreadores no meio de cultura (50 mL/g de microcarreadores) no RT. Deixe os microcarreadores assentarem, descarte o sobrenadante.
- Biorreator de perfusão
- Esterilizar o biorreator por autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi).
- Conte o número de SF-MSCs e aloque 2,5 x 107 SF-MSCs e microtransportadores ao biorreator perfundido com meio de cultura MSC de grau GMP (250 mL).
- Colocar o biorreator em uma incubadora com 5% de CO2 a 37 °C. Gire o biorreator a uma velocidade de 15 rpm. Mude o meio de cultura a cada 6 dias.
- Coletar os sobrenadantes e microportadores da cultura celular para análise mais aprofundada após a cultura por 14 dias.
3. Identificação de exossomos e detecção de segurança
- Ultracentrifugação
- Centrifugar o sobrenadante da cultura celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante; descartar os detritos celulares.
- Centrifugar os sobrenadantes a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante; descarte as vesículas maiores (corpos apoptóticos e algumas microvesículas maiores).
- Centrifugar novamente o sobrenadante a 10.000 x g durante 30 minutos a 4 °C para remover vesículas maiores; coletar os pellets e ressuspender em 40 mL de 1x PBS.
- Centrifugar os pellets ressuspensos a 120.000 x g durante 70 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante e ressuspender os pellets que contêm exossomas em 500 μL de 1x PBS.
- Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
NOTA: Para cada corrida, 500 μL da amostra foram injetados na câmara a uma taxa de fluxo de 30 μL/min. Efectuar a análise a 24,4 °C-24,5 °C.- Diluir as amostras de exossomas recém-isoladas com PBS estéril de 1x a 1 mL contendo 107-10 9 /mL de partículas e injetá-las no sistema de análise de rastreamento de nanopartículas (ver Tabela de Materiais).
- Defina manualmente o sistema de captura e análise de acordo com o protocolo do fabricante. Visualize as partículas por dispersão de luz laser e capture seu movimento browniano em vídeo digital.
- Analise as fitas de vídeo gravadas utilizando software (consulte Tabela de materiais) com base no rastreamento de pelo menos 200 partículas individuais por execução.
- Microscopia eletrônica de transmissão
- Fixe os exossomos em paraformaldeído a 4% (em frio 1x DPBS) por 5 min.
- Monte 5 μL dos exossomos em grades de cobre. Neste experimento, a concentração de exossomos é de 1 mg/mL quantificada por um kit de ensaio de proteínas (ver Tabela de Materiais).
- Incorpore os exossomos em ácido fosfotúngstico a 3% por 10 min no gelo. Remova o excesso de ácido e seque as amostras no RT.
- Fotografe as amostras de exossomos por um MET a uma tensão de aceleração de 100 kV.
- Mancha ocidental
- Adicione 300 μL de tampão de lise (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) e coquetel de inibidores de protease (ver Tabela de Materiais) aos exossomos.
- Misture os exossomos no tampão de lise pipetando para cima e para baixo e deixe-o repousar sobre o gelo por 20 minutos.
- Centrifugar a mistura a 9,391 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante. Meça a concentração de proteína usando um kit de ensaio de proteína (consulte Tabela de materiais).
- Adicionar 100 μL de tampão de carga proteica 4x e aquecer a 100 °C durante 10 min.
- Carga de 15 μL de proteínas na concentração de 10 mg/mL e executado por eletroforese em gel (120 V, 70 min) e eletroblotting a 100 V, 60 min a 4 °C.
- Detecte os marcadores não específicos do exossomo (calexina) e os biomarcadores exossômicos (CD9, CD63 e CD81) por western blotting fluorescente (consulte Tabela de Materiais).
- Teste de segurança
- Para a detecção de bactérias, fungos e Mycobacterium tuberculosis , siga as etapas 3.5.2-3.5.5.
- Semear 100 μL da solução exossomótica (1 mg/mL) numa placa de cultura em ágar sangue (ver Tabela de Materiais) e incubar a placa de cultura a 37 °C durante 24 h.
- Semear 100 μL da solução exossomótica (1 mg/ml) numa placa média de ágar sabouraud (ver Tabela de Materiais) e incubar a 35 °C durante 48 h.
- Semear 100 μL da solução exossómica (1 mg/ml) numa placa de meio de cultura de Lowenstein-Jensen (ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C durante 3 semanas.
- Detectar o aparecimento de bactérias, fungos e colônias de Mycobacterium tuberculosis por observação macroscópica.
NOTA: Os critérios para avaliar a segurança dos exossomos são a ausência de microrganismos na placa de cultura. - Para detecção de Mycoplasma, siga as etapas 3.5.7-3.5.9.
- Ressuspender os exossomos em 50 μL de solução tampão incluída no kit e aquecer a 95 °C durante 3 min.
- Amplificar o Mycoplasma em solução exossômica usando um kit de detecção de Mycoplasma por PCR (consulte Tabela de Materiais).
- Detectar os produtos de PCR em eletroforese em gel de agarose a 1,5% (30 min, 120 V).
4. Detecção da função exossômica in vitro
- Rotulagem de exossomos
- Rotular 100 μL de exossomos (1 mg/mL) com 1 mM de Dil (1000x) (ver Tabela de Materiais) e incubar em RT por 30 min.
- Recuperar os exossomos por ultracentrifugação a 100.000 x g por 70 min. Ressuscite o pellet em 500 μL de 1x PBS.
- Carregamento de Cy3-miR-140 imita em exossomos
- Misture 1 μg/μL de proteína exossômica e 5 μmol/mL de Cy3-miR-140 em um volume final de 400 μL de tampão de eletroporação (1,15 mM de fosfato de potássio (pH 7,2), 25 mM de cloreto de potássio e 21% (v/v) (ver Tabela de Materiais).
- Transfira a mistura para cuvetes de eletroporação frias de 0,4 cm e eletroporate a uma capacitância de 300 V/100 μF usando um sistema de transfecção gênica (ver Tabela de Materiais).
- Imediatamente após a eletroporação, mantenha a mistura em RT por 30 minutos para garantir que a membrana do exossomo seja totalmente restaurada.
- Trate as misturas com uma unidade de RNase A (ver Tabela de Materiais) por 20 minutos para eliminar os miRNA imitados fora dos exossomos.
- Ultracentrifugar a mistura de exossomos a 120.000 x g por 90 min, descartar o sobrenadante e ressuspender os exossomos em 500 μL de 1x PBS.
- Ensaio de absorção de exossomos
- Semeando os condrócitos (1 x 107) em placas confocais de 35 mm com 1 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS.
- Após 24 h, tratar os condrócitos com exossomos marcados com DiI (100 ng/mL) ou exossomos carregados com cy3-miR-140 (100 ng/mL) por 1 h.
- Lave com 1x PBS três vezes e, em seguida, rotule com DAPI (10 ng/mL) por 10 min no RT.
- Registre o sinal de fluorescência em microscopia de fluorescência a laser confocal (CLSM) usando os filtros apropriados (consulte Tabela de materiais).
5. Análise estatística
- Realizar análises estatísticas utilizando software estatístico apropriado.
NOTA: Os dados representativos em cada figura foram expressos como a média ± DP. O teste t de Student foi utilizado para a comparação de dois grupos utilizando um software de estatística. Uma ANOVA one-way seguida do múltiplo de Tukey foi realizada no caso de comparações entre múltiplos grupos. Os valores de p <0,05 (*), <0,01 (**) ou <0,001 (***).
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Representative Results
A citometria de fluxo foi utilizada para identificar os marcadores de superfície das SF-MSCs, de acordo com os critérios mínimos para definição de CTMs humanas recomendados pela International Society for Cellular Therapy14,15. A análise da citometria de fluxo revelou que as SF-MSCs cultivadas neste estudo preencheram os critérios de identificação das CTMs. Foram negativos para CD34, CD45 e HLA-DR (abaixo de 3%) e positivos para CD73, CD90 e CD105 (acima de 95%) (Figura 2).
Sob microscopia invertida, observou-se que as SF-MSCs proliferam em microportadores (Figura 3A). Depois que as células foram digeridas e lavadas da placa de cultura 2D e dos microcarregadores de cultura 3D, o número de células foi contado. Em comparação com a cultura 2D, a cultura 3D induziu a proliferação mais rápida do SF-MSC a partir dos 6 dias (Figura 3B). Foram apresentados os resultados de três experimentos independentes.
Para identificar os exossomos (Exos) de SF-MSCs de cultura 2D e 3D, as proteínas associadas ao exossomo (CD63, CD9 e CD81) e a proteína negativa (calexina) foram detectadas usando western blotting. Os resultados revelaram que os 2D-Exos e 3D-Exos expressam CD63, CD9 e CD81, enquanto são negativos para a calexina (Figura 4A). Além disso, o diâmetro e a morfologia do exossomo foram ensaiados usando NTA e MET. A análise da nanovisão demonstrou que o diâmetro dos Exos 2D (Figura 4B) e dos Exos 3D (Figura 4D) é de aproximadamente 120 nm. A análise do microscópio eletrônico de transmissão revelou a morfologia de 2D-Exos e 3D-Exos, mostrando vesículas aproximadamente esferoidais (Figura 4C,E).
Após a cultura 3D, a concentração de partículas de 30-160 nm de tamanho é de 4,0 x 106 por mL analisadas usando NTA. No entanto, após a cultura 2D, a concentração de partículas de 30-160 nm é de 2,5 x 106 por mL (Figura 5A). Ao calcular o rendimento de proteína exossômica no meio, a cultura 3D produziu mais proteína exossômica do que a cultura 2D (Figura 5B). Assim, em comparação com a cultura 2D, a cultura 3D aumentou significativamente o rendimento exossômico.
Os exossomos foram primeiramente marcados com Dil e, em seguida, incubados a uma concentração de 10 μg/mL com os condrócitos por 1 h, 2 h e 3 h para examinar se os exossomos podem entrar nos condrócitos primários in vitro. Exossomos marcados com dil entraram nos condrócitos primários, com o pico observado às 3 h (Figura 6).
Para detectar a função dos exossomos como nanocarreadores, os exossomos foram carregados com miR-140 marcado com Cy3 através de eletroporação e, em seguida, tratados com condrócitos na concentração de 10 μg/mL por 3 h. Os resultados demonstraram que os exossomos poderiam fornecer miR-140 aos condrócitos (Figura 7). Todos os resultados atenderam às especificações; todas as amostras foram estéreis e negativas para Mycoplasma.
Figura 1: Diagrama esquemático de exossomos isolados de hSF-MSCs in vitro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação de SF-MSCs por citometria de fluxo. A citometria de fluxo mostra o imunofenótipo positivo ou negativo das hSF-MSCs. (A) Marcação com um anticorpo de controle do isotipo IgG1. (B) CD73 é positivo e CD34 é negativo. (C) CD90 é positivo e CD45 é negativo. (D) CD105 é positivo e HLA-DR é negativo, conhecidos como marcadores MSC. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Curva de crescimento SF-MSC. (A) Imagens representativas mostrando SF-MSCs (setas vermelhas) em microportadores sob microscopia invertida (barra de escala = 100 μm). (B) A curva de crescimento do SF-MSC sob cultura 2D e 3D. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Identificação dos exossomos . (A) Resultados de Western blotting dos Exos 2D e Exos 3D. (B) Análise da nanovisão do diâmetro de 2D-Exos e 3D-Exos. (C) Detecção de ETM da morfologia de 2D-Exos e 3D-Exos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O aumento do rendimento da produção de exossomos pela cultura de biorreatores 3D . (A) Resultados representativos do tamanho do exossomo analisados pela NTA. (B) Rendimento proteico = proteína exossômica (μg)/meio condicionado (mL). Os gráficos mostram o rendimento para cada método e a média ± DP de todas as medidas (** p < 0,01). As comparações estatísticas foram realizadas por ANOVA one-way com correção post-hoc de Bonferroni e pelo teste t de Student. ** p < 0,01 foi considerada uma diferença significativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 Imagens representativas mostrando a internalização de exossomos marcados com Dil por condrócitos primários. Os condrócitos foram incubados com exossomos marcados com Dil por 1 h, 2 h e 3 h. Os exossomos foram marcados com Dil (vermelho) e os núcleos com Hoechst (azul). As amostras foram detectadas com ampliação de 60x. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Entrega in vitro de miR-140 por exossomos de MSC. Após a captação de miR-140 marcado com Cy3 que foi encapsulado em exossomos derivados de SF-MSCs, os condrócitos foram fotografados. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As células-tronco mesenquimais têm sido amplamente utilizadas na medicina regenerativa devido à sua auto-renovação, diferenciadas em células teciduais com funções especializadas e efeitos parácrinos16,17. Notavelmente, os efeitos parácrinos exercidos pelos exossomos têm atraído muita atenção18. Os exossomos carregam a bioinformação das MSCs e desempenham sua função biológica e superam as deficiências das MSC, como armazenamento e remessa problemáticos. Assim, exossomos derivados de CTMs têm sido utilizados para intervenções terapêuticas, que têm atraído a maior atenção na terapia da OA.
Atualmente, existem dois métodos para propagar CTMs, a cultura 2D e a cultura tridimensional (3D)19. A cultura 2D é uma forma convencional de cultivar CTMs para estudos in vitro com baixos custos. No entanto, é demorado e limitado em potencial de escala. Além disso, a propagação de MSC no microambiente 2D rapidamente deduz a haste20,21, uma das características mais críticas das MSCs. Assim, a cultura 2D não pode cumprir os requisitos para a terapia MSC. Neste estudo, para o objetivo das SF-MSCs na terapia de OA, buscamos manter as características da SF-MSC utilizando a cultura de um biorreator 3D, que pode mimetizar com mais precisão o microambiente biológico. Recentemente, outros pesquisadores usaram andaimes ou 3D baseados em microportadores para cultivar MSCs. Descobrimos que os andaimes de colágeno 3D permitiram exossomos mais concentrados produzidos por CTMs derivadas da medula óssea humana do que a cultura 2D23.
Como os exossomos podem desempenhar uma grande parte da função da CTM, evitando algumas deficiências das CTMs, pretendemos produzir exossomos para a terapia da OA. Este estudo detectou ainda a função de produção e entrega de exossomos usando este sistema baseado na grande quantidade e alta qualidade de propagação de MSC da cultura 3D. O Sistema de Cultura de Células Rotativas (CCRC) foi utilizado para a cultura 3D para produzir exossomos a partir da propagação de MSC em larga escala. Em comparação com a cultura tradicional de frascos 2D, este sistema de cultura 3D pode evitar a contaminação por repetidas mudanças de meio e passagem celular. Mais importante, este estudo mostrou que um biorreator 3D poderia aumentar a produção de exossomos para atender aos requisitos do estudo clínico. É importante notar que os exossomos isolados de sobrenadantes de cultura 3D podem entregar miRNAs nas células, sugerindo que a cultura 3D não interfere na função do exossomo. Os resultados da detecção microbiana e de endotoxinas reforçam ainda mais o fato de que este estudo estabeleceu um protocolo que poderia produzir exossomos, que são biologicamente seguros e promissores para a terapia da OA. Atualmente, a quantidade de exossomas produzida neste estudo não pode satisfazer as necessidades comerciais. Assim, estratégias para uma enorme quantidade de produção de exossomos precisam ser desenvolvidas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81972116, No. 81972085, No. 81772394); Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (No.2018B0303110003); Projecto de Cooperação Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Projetos de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, Não. JCYJ20170817172023838, Não. JCYJ20170306092215436, Não. JCYJ20170413161649437); Fundação de Ciência de Pós-Doutorado da China (No.2020M682907); Fundação de Investigação Básica e Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Projeto Sanming de Medicina em Shenzhen (SZSM201612079); Fundos Especiais para a Construção de Hospitais de Alto Nível na Província de Guangdong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
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