Summary
Her presenterer vi en protokoll for å produsere et stort antall GMP-klasse eksosomer fra synovialvæske mesenkymale stamceller ved hjelp av en 3D-bioreaktor.
Abstract
Exosomer utskilt av mesenkymale stamceller (MSCs) har blitt foreslått som lovende kandidater for bruskskader og slitasjegiktbehandling. Exosomer for klinisk anvendelse krever storskala produksjon. Til dette formål ble humane synovialvæske MSCs (hSF-MSCs) dyrket på mikrobærerperler, og deretter dyrket i et dynamisk tredimensjons (3D) kultursystem. Gjennom å bruke 3D-dynamisk kultur, oppnådde denne protokollen vellykket storskala eksosomer fra SF-MSC-kultursupernatanter. Eksosomer ble høstet ved ultracentrifugering og verifisert av et transmisjonselektronmikroskop, nanopartikkeloverføringsanalyse og vestlig blotting. Også den mikrobiologiske sikkerheten til eksosomer ble detektert. Resultater av eksosomdeteksjon antyder at denne tilnærmingen kan produsere et stort antall eksosomer av god produksjonspraksis (GMP). Disse eksosomene kan brukes i eksosombiologiforskning og klinisk slitasjegiktbehandling.
Introduction
Artrose (OA), som følge av leddbrusk og underliggende beinbrudd, er fortsatt en alvorlig utfordring som fører til uførhet 1,2. Uten blod- og nerveforsyning er brusk selvhelbredende evne minimal når den først ble skadet 3,4. I de siste tiårene har terapier basert på autolog kondrocyttimplantasjon (ACI) gjort noen fremskritt i OA-behandling5. For kondrocyttisolasjon og ekspansjon er høsting av liten brusk fra OA-leddets ikke-vektbærende område nødvendig, noe som forårsaker skader på brusk. Prosedyren vil også kreve en annen operasjon for å implantere de utvidede kondrocyttene6. Dermed er ett-trinns terapier for OA-behandling uten bruskskader under omfattende leting.
Mesenkymale stamceller (MSCs) har blitt foreslått som lovende alternativer for OA-behandling 7,8. Stammer fra flere vev, kan MSCs differensiere i kondrocytter med spesifikk stimulering. Det er viktig at MSCs kan modulere immunresponser via antiinflammasjon9. Derfor har MSCs betydelige fordeler i OA-behandling ved å reparere bruskdefekter og modulere immunresponsen, spesielt i betennelsesmiljøet. For OA-behandling har MSC fra synovialvæske (SF-MSCs) nylig fått mye oppmerksomhet på grunn av deres sterkere kondrocyttdifferensieringsevne enn andre MSC-kilder10,11. Spesielt på ortopedisk klinikk er ekstraksjonen av inflammatorisk SF fra felleshulen en rutinemessig terapi for å lindre smerte symptomet hos OA-pasienter. Ekstrahert inflammatorisk SF kastes vanligvis som medisinsk avfall. Både pasienter og leger er klare til å vurdere autolog MSC isolert fra inflammatorisk SF som OA-behandling med svært få etiske konflikter. Imidlertid er SF-MSC-terapi kompromittert på grunn av tumorigen risiko, langvarig lagring og fjerne forsendelsesbarrierer.
Eksosomer, utskilt av mange celletyper, inkludert MSCs, bærer det meste av foreldrecellens bioinformasjon. Det har blitt undersøkt i dybden som en cellefri terapi12,13. I følge de oppdaterte ressursene som er tilgjengelige på nettstedet til Clinical Trial Government (ClinicalTrials.gov), blir mer omfattende eksosomkliniske studier initiert og gjennomført innen forskningsfeltene kreft, hypertensjon og nevrodegenerative sykdommer. SF-MSC eksosombehandling kan være en spennende og utfordrende studie for å takle OA. God produksjonspraksis (GMP)-grad og storskala eksosomproduksjon er avgjørende for klinisk oversettelse. Småskala eksosomisolasjon har blitt mye utført basert på todimensjonal (2D) cellekultur. Imidlertid trenger store eksosomproduksjonsstrategier optimalisering. En storskala eksosomproduksjonsmetode ble utviklet i denne studien, basert på massiv SF-MSC-kultur under xenofrie forhold. Etter ultrasentrifugering fra cellekultursupernatanter ble eksosom sikkerhet og funksjon validert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Human Ethics Committee of Shenzhen Second People's Hospital. Et skjematisk diagram over eksosomer isolert fra hSF-MSCs in vitro-protokoll er vist i figur 1.
1. Menneskelig SF-MSCs kultur og identifikasjon
- Høst 20 ml SF ved hjelp av sprøyte og nål fra kliniske OA-pasienter.
- Desinfiser kneleddet til OA-pasienten. Punktering fra quadriceps femoris senen utenfor patella inn i leddhulen med en 7 # nål.
- Trekk ut 10 ml av leddvæsken. Dekk punkteringsstedet med transfusjonspinnen og trykk i 5 minutter.
- Kast SF-supernatanten etter sentrifugering ved 1 500 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Resuspender cellepelleten med 10 ml 1x fosfatbuffersaltvann (PBS), sentrifuge ved 1 500 x g i 10 minutter ved 4 °C, og kast PBS.
- Resuspender pelleten med 10 ml humant MSC-kulturmedium ved en celletetthet på 5 x 104 celler/ml (se materialfortegnelse), og legg deretter suspensjonen i en 100 mm tallerken.
- Inkuber retten ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5 % CO2.
- Etter 48 timer, fjern de ikke-adherente cellene ved å bytte medium og vask med 1x PBS. Bytt mediet hver 3. dag i 2 uker.
- Samle cellekultursupernatantene.
- Identifiser SF-MSCs ved hjelp av flowcytometri.
- Fordøy tredje generasjon (P3) av SF-MSC, sentrifuger ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og samle cellepelleten.
MERK: En passasje er anerkjent som subkulturen til cellene til en annen kulturskål. De primære cellene isolert fra SF og sådd på servise er merket som passasje null (P0). Ved ca 75% sammenløp blir cellene fordøyd og løsrevet fra oppvasken, sådd på andre retter og merket som P1. - Tilsett 400 μL blokkeringsbuffer (1% BSA i 1x PBS) til cellepelleten (5 x 104) og la den stå i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
- Sentrifuge ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 °C, kast supernatanten og resuspender pelleten i 100 μL 1x PBS.
- Tilsett 1 μL CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR monoklonalt fluorescerende antistoff (fortynningsforhold 1:100) (se Materialtabell) per rør og inkuber ved RT i 30 minutter.
- Vask to ganger med 1x PBS og kast supernatanten. Samle cellepelleten og resuspendere i 100 μL 1x PBS.
- Oppdag på et flowcytometer opptil 10 000 celler ved hjelp av filtre på 525/50 og 585/40 for å oppdage fluoroforene.
- Fordøy tredje generasjon (P3) av SF-MSC, sentrifuger ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og samle cellepelleten.
2.3D bioreaktorcellekultur
- Microcarrier forberedelse
- Svell de tørre 0,75 g mikrobærerne (se materialtabellen) og hydrater i 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) (50 ml/g mikrobærere) i minst 3 timer ved RT.
- Dekanter supernatanten og vask mikrobærerne i 5 minutter i fersk DPBS (50 ml / g mikrobærere). Kast PBS og erstatt den med fersk 1x DPBS (50 ml / g mikrobærere).
- Steriliser mikrobærerne ved autoklavering (121 °C, 15 min, 15 psi). Tillat de steriliserte mikrobærerne å bosette seg, dekanter supernatanten.
- Skyll mikrobærerne kort i kulturmediet (50 ml/g mikrobærere) ved RT. La mikrobærerne slå seg til ro, kast supernatanten.
- Perfusjon bioreaktor
- Steriliser bioreaktoren ved autoklavering (121 °C, 15 min, 15 psi).
- Tell antall SF-MSCs og allokere 2,5 x 107 SF-MSCs og mikrobærere til bioreaktoren som er perfundert med GMP-grade MSC-kulturmedium (250 ml).
- Sett bioreaktoren i en inkubator med 5% CO2 ved 37 °C. Roter bioreaktoren med en hastighet på 15 o / min. Bytt kulturmedium hver 6.
- Samle cellekultursupernatanter og mikrobærere for videre analyse etter kultur i 14 dager.
3. Exosomidentifikasjon og sikkerhetsdeteksjon
- Ultrasentrifugering
- Sentrifuge cellekultursupernatanten ved 300 x g i 10 minutter ved 4 ° C og samle supernatanten; kast det cellulære rusk.
- Sentrifuge supernatantene ved 2,000 x g i 10 minutter ved 4 ° C og samle supernatanten; kast de større vesiklene (apoptotiske legemer og noen større mikrovesikler).
- Sentrifuge supernatanten igjen ved 10 000 x g i 30 minutter ved 4 °C for å fjerne større vesikler; samle pellets og resuspendere i 40 ml 1x PBS.
- Sentrifuge de resuspenderte pellets ved 120 000 x g i 70 minutter ved 4 ° C, kast supernatanten og resuspender pellets som inneholder eksosomer i 500 μL 1x PBS.
- Nanopartikkel sporing analyse (NTA)
MERK: For hver kjøring ble 500 μL av prøven injisert i kammeret med en strømningshastighet på 30 μL/min. Utfør analysen ved 24,4 °C-24,5 °C.- Fortynn de nyisolerte eksosomprøvene med sterile 1x PBS til 1 ml som inneholder 107-10 9 / ml partikler og injiser dem i nanopartikkelsporingsanalysesystemet (se materialtabell).
- Still inn fangst- og analysesystemet manuelt i henhold til produsentens protokoll. Visualiser partiklene ved laserlysspredning og fang deres brownske bevegelse på digital video.
- Analyser de innspilte videobåndene ved hjelp av programvare (se Materialtabell) basert på sporing av minst 200 individuelle partikler per kjøring.
- Transmisjonselektronmikroskopi
- Fest eksosomene i 4% paraformaldehyd (i kald 1x DPBS) i 5 min.
- Monter 5 μL av eksosomene på kobbergitter. I dette eksperimentet er konsentrasjonen av eksosomer 1 mg / ml kvantifisert av et proteinanalysesett (se Materialtabell).
- Legg eksosomene i 3% fosfotungstinsyre i 10 minutter på is. Fjern overflødig syre og tørk prøvene ved RT.
- Avbilde eksosomprøvene med en TEM ved en akselerasjonsspenning på 100 kV.
- Vestlig blotting
- Tilsett 300 μL lysisbuffer (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) og proteasehemmere cocktail (se Materialtabell) til eksosomene.
- Bland eksosomene i lysisbufferen ved å pipettere opp og ned og la den stå på is i 20 minutter.
- Sentrifuge blandingen ved 9,391 x g i 10 minutter ved 4 °C og samle supernatanten. Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et proteinanalysesett (se Materialfortegnelse).
- Tilsett 100 μL 4x proteinbelastningsbuffer og varme ved 100 °C i 10 minutter.
- Last 15 μL proteiner i en konsentrasjon på 10 mg / ml og kjør av gelelektroforese (120 V, 70 min) og elektroblotting ved 100 V, 60 min ved 4 ° C.
- Oppdag de ikke-eksosomspesifikke markørene (calnexin) og exosomale biomarkører (CD9, CD63 og CD81) ved fluorescerende vestlig blotting (se Materialtabell).
- Sikkerhetstest
- For påvisning av bakterier, sopp og Mycobacterium tuberculosis , følg trinnene 3.5.2-3.5.5.
- Frø 100 μL av eksosomoppløsningen (1 mg / ml) på en blodagarkulturplate (se materialtabell) og inkuber kulturplaten ved 37 ° C i 24 timer.
- Frø 100 μL av eksosomoppløsningen (1 mg/ml) på en sabouraud agar medium plate (se materialtabell) og inkuber ved 35 °C i 48 timer.
- Frø 100 μL av eksosomoppløsningen (1 mg/ml) på en lavenstein-Jensen kulturmediumplate (se materialtabell) og inkuber ved 37 °C i 3 uker.
- Oppdag utseendet av bakterier, sopp og Mycobacterium tuberculosis kolonier ved makroskopisk observasjon.
MERK: Kriterier for evaluering av sikkerheten til eksosomer er fraværet av mikroorganismer på kulturplaten. - For Mycoplasma-deteksjon, følg trinn 3.5.7-3.5.9.
- Resuspender eksosomene i 50 μL bufferløsning inkludert i settet og varme ved 95 °C i 3 minutter.
- Forsterk Mycoplasma i eksosomoppløsning ved hjelp av et PCR Mycoplasma-deteksjonssett (se Materialfortegnelse).
- Oppdag PCR-produktene på 1,5% agarosegelelektroforese (30 min, 120 V).
4. Deteksjon av eksosomfunksjon in vitro
- Exosome merking
- Merk 100 μL eksosomer (1 mg / ml) med 1 mM Dil (1000x) (se Materialtabell) og inkuber ved RT i 30 minutter.
- Gjenopprett eksosomene ved ultracentrifugering ved 100 000 x g i 70 minutter. Resuspender pelleten i 500 μL av 1x PBS.
- Lasting av Cy3-miR-140 etterligner i eksosomer
- Bland 1 μg / μL eksosalt protein og 5 μmol / ml Cy3-miR-140 i et endelig volum på 400 μL elektroporeringsbuffer (1,15 mM kaliumfosfat (pH 7,2), 25 mM kaliumklorid og 21% (v / v) (se materialtabell).
- Overfør blandingen til kalde 0,4 cm elektroporeringskyvetter og elektroporater ved 300 V / 100 μF kapasitans ved hjelp av et gentransfeksjonssystem (se materialtabell).
- Umiddelbart etter elektroporering, vedlikehold blandingen ved RT i 30 minutter for å sikre at eksosommembranen er fullstendig restaurert.
- Behandle blandingene med en enhet RNase A (se Materialtabell) i 20 minutter for å eliminere miRNA-etterligningene utenfor eksosomene.
- Ultracentrifugate eksosomblandingen ved 120 000 x g i 90 minutter, kast supernatanten og resuspender eksosomene i 500 μL 1x PBS.
- Exosome opptak analyse
- Frø kondrocyttene (1 x 107) i 35 mm konfokale retter med 1 ml DMEM/F12 inneholdende 10 % FBS.
- Etter 24 timer, behandle kondrocyttene med DiI-merkede eksosomer (100 ng / ml) eller cy3-miR-140 lastede eksosomer (100 ng / ml) i 1 time.
- Vask med 1x PBS tre ganger, og merk deretter med DAPI (10 ng / ml) i 10 minutter ved RT.
- Ta opp fluorescenssignalet i konfokal laserskanning fluorescensmikroskopi (CLSM) ved hjelp av passende filtre (se Materialtabell).
5. Statistisk analyse
- Utfør statistisk analyse ved hjelp av passende statistisk programvare.
MERK: Representative data i hver figur ble uttrykt som gjennomsnittlig ± SD. Studentens t-test ble brukt til sammenligning av to grupper ved hjelp av statistikkprogramvare. En enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys multiplum ble utført ved sammenligninger mellom flere grupper. P-verdier <0,05 (*), <0,01 (**) eller <0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flowcytometri ble brukt til å identifisere overflatemarkørene til SF-MSCs, i henhold til minimumskriteriene for å definere humane MSCs anbefalt av International Society for Cellular Therapy14,15. Flowcytometrianalyse viste at SF-MSCs dyrket i denne studien oppfylte identifikasjonskriteriene til MSCs. De var negative for CD34, CD45 og HLA-DR (under 3%) og positive for CD73, CD90 og CD105 (over 95%) (figur 2).
Under invertert mikroskopi ble det lagt merke til at SF-MSCs sprer seg på mikrobærere (figur 3A). Etter at cellene ble fordøyd og vasket fra 2D-kulturplaten og 3D-kulturmikrobærere, ble cellenummeret talt. Sammenlignet med 2D-kultur førte 3D-kultur til at SF-MSC spredte seg raskere fra 6 dager og utover (figur 3B). Resultater fra tre uavhengige eksperimenter ble presentert.
For å identifisere eksosomene (Exos) fra SF-MSCs av 2D og 3D-kultur, ble de eksosomassosierte proteinene (CD63, CD9 og CD81) og negativt protein (calnexin) detektert ved bruk av vestlig blotting. Resultatene viste at 2D-Exos og 3D-Exos uttrykker CD63, CD9 og CD81, mens de er negative for calnexin (figur 4A). Også eksosomdiameteren og morfologien ble analysert ved hjelp av NTA og TEM. Nanosight-analyse viste at diameteren på 2D-Exos (figur 4B) og 3D-Exos (figur 4D) er ca. 120 nm. Transmisjonselektronisk mikroskopanalyse avslørte morfologien til 2D-Exos og 3D-Exos, og viste omtrent sfæroidale vesikler (figur 4C, E).
Etter 3D-kultur er partikkelkonsentrasjonen på 30-160 nm store partikler 4,0 x 106 per ml analysert ved hjelp av NTA. Etter 2D-kulturen er imidlertid partikkelkonsentrasjonen på 30-160 nm partikler 2,5 x 106 per ml (figur 5A). Ved beregning av eksosomproteinutbyttet i mediet produserte 3D-kultur mer eksosomprotein enn 2D-kultur (figur 5B). Således, sammenlignet med 2D-kultur, forbedret 3D-kulturen betydelig eksosomutbytte.
Eksosomene ble først merket med Dil, og deretter inkubert i en konsentrasjon på 10 μg / ml med kondrocyttene i 1 time, 2 timer og 3 timer for å undersøke om eksosomer kan komme inn i primære kondrocytter in vitro. Dilmerkede eksosomer gikk inn i primære kondrocytter, med toppen sett ved 3 timer (figur 6).
For å oppdage funksjonen av eksosomer som nanobærere, ble eksosomer lastet med Cy3-merket miR-140 gjennom elektroporering, og deretter behandlet med kondrocytter i en konsentrasjon på 10 μg / ml i 3 timer. Resultatene viste at eksosomer kunne levere miR-140 til kondrocytter (figur 7). Alle resultatene oppfylte spesifikasjonene; alle prøvene var sterile og negative for mykoplasma.
Figur 1: Skjematisk diagram over eksosomer isolert fra hSF-MSCs in vitro. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Identifisering av SF-MSC ved flowcytometri. Flowcytometri viser den positive eller negative immunfenotypen til hSF-MSCs. (A) Merking med et IgG1 isotypekontrollantistoff. (B) CD73 er positiv, og CD34 er negativ. (C) CD90 er positiv, og CD45 er negativ. (D) CD105 er positiv, og HLA-DR er negativ, kjent som MSC-markører. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: SF-MSC vekstkurve. (A) Representative bilder som viser SF-MSCs (røde piler) på mikrobærere under invertert mikroskopi (skalalinje = 100 μm). (B) Vekstkurven for SF-MSC under 2D og 3D-kultur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Identifisering av eksosomer . (A) Western blotting resultater av 2D-Exos og 3D-Exos. (B) Nanosight-analyse av diameteren til 2D-Exos og 3D-Exos. (C) TEM-deteksjon av morfologien til 2D-Exos og 3D-Exos. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Det økte utbyttet av eksosomproduksjon ved 3D-bioreaktorkultur . (A) Representative resultater av eksosomstørrelse analysert av NTA. (B) Proteinutbytte = eksosalt protein (μg)/betinget medium (ml). Tomter viser utbytte for hver metode og gjennomsnittlig ± SD av alle målinger (** p < 0,01). Statistiske sammenligninger ble utført ved enveis ANOVA med post-hoc Bonferronis korreksjon og ved Student t-test. ** p < 0,01 ble vurdert som en signifikant forskjell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 Representative bilder som viser internalisering av dilmerkede eksosomer ved primære kondrocytter. Kondrocytter ble inkubert med Dil-merkede eksosomer i 1 time, 2 timer og 3 timer. Eksosomer ble merket med Dil (rød), og kjerner ble merket med Hoechst (blå). Prøver ble påvist ved 60x forstørrelse. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: In vitro levering av miR-140 av MSC-eksosomer. Etter å ha tatt Cy3-merket miR-140 som ble innkapslet i SF-MSCs-avledede eksosomer, ble kondrocytter avbildet. Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mesenkymale stamceller har blitt mye brukt i regenerativ medisin på grunn av deres selvfornyelse, differensiert i vevsceller med spesialiserte funksjoner, og parakrine effekter16,17. Spesielt har de parakrine effektene som utøves av eksosomer tiltrukket seg mye oppmerksomhet18. Eksosomer bærer bioinformasjonen til MSC-er og utfører sin biologiske funksjon og overvinner MSC-mangler, for eksempel plagsom lagring og forsendelse. Dermed har eksosomer avledet fra MSCs blitt brukt til terapeutiske inngrep, som har tiltrukket seg mest oppmerksomhet i OA-terapi.
For tiden er det to metoder for å forplante MSCs, 2D-kultur og tredimensjonal (3D) kultur19. 2D-kultur er en konvensjonell måte å dyrke MSC på for in vitro-studier med lave kostnader. Det er imidlertid tidkrevende og begrenset i skalapotensial. MSC-forplantning i 2D-mikromiljøet utleder også raskt stammen20,21, en av de mest kritiske egenskapene til MSC-er. Dermed kan ikke 2D-kulturen oppfylle kravene til MSC-terapi. I denne studien, til målet med SF-MSCs i OA-terapi, forsøker vi å opprettholde SF-MSC-egenskaper ved hjelp av kulturen til en 3D-bioreaktor, som mer nøyaktig kan etterligne det biologiske mikromiljøet. Nylig har andre forskere brukt stillaser eller microcarrier-basert 3D til å dyrke MSCs. Vi fant at 3D-kollagenstillasene tillot mer konsentrerte eksosomer produsert av humane benmargsavledede MSCer enn2D-kultur 23.
Siden eksosomer kan utføre en stor del av MSC-funksjonen samtidig som vi unngår noen mangler ved MSCs, tar vi sikte på å produsere eksosomer for OA-terapi. Denne studien oppdaget videre eksosomproduksjons- og leveringsfunksjonen ved hjelp av dette systemet basert på den store mengden og høye kvaliteten på MSC-forplantning av 3D-kultur. Rotary Cell Culture System (RCCS) ble brukt til 3D-kultur for å produsere eksosomer fra storskala MSC-forplantning. Sammenlignet med tradisjonell 2D-kolbekultur, kan dette 3D-kultursystemet unngå forurensning fra gjentatt mediumendring og cellepassasje. Enda viktigere, denne studien viste at en 3D-bioreaktor kunne forbedre eksosomproduksjonen for å oppfylle de kliniske studiekravene. Merk at eksosomer isolert fra 3D-kultursupernatanter kan levere miRNA i celler, noe som tyder på at 3D-kultur ikke forstyrrer eksosomfunksjonen. Mikrobielle og endotoksindeteksjonsresultater støtter videre at denne studien har etablert en protokoll som kan produsere eksosomer, som er biologisk trygge og lovende for OA-terapi. For tiden kan eksosommengden produsert i denne studien ikke tilfredsstille kommersielle behov. Derfor må strategier for en enorm mengde eksosomproduksjon utvikles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Nøkkelprogram for naturvitenskapsstiftelsen i Guangdong-provinsen (nr. 2018B0303110003); Guangdong internasjonale samarbeidsprosjekt (nr.2021A0505030011); Shenzhen vitenskaps- og teknologiprosjekter (nr. GJHZ20200731095606019, nr. JCYJ20170817172023838, nr. JCYJ20170306092215436, nr. JCYJ20170413161649437); Kina Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr.2021A1515010985); Sanming Prosjekt for medisin i Shenzhen (SZSM201612079); Spesielle midler til bygging av sykehus på høyt nivå i Guangdong-provinsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
