Une méthode pour préserver les racines et les rhizosphères des zones humides pour l’imagerie élémentaire
Summary
Nous décrivons un protocole pour échantillonner, préserver et sectionner les racines intactes et le sol de la rhizosphère environnante dans les milieux humides en utilisant le riz(Oryza sativa L.) comme espèce modèle. Une fois conservé, l’échantillon peut être analysé à l’aide de techniques d’imagerie élémentaire, telles que l’imagerie par spéciation chimique par fluorescence X synchrotron (XRF).
Abstract
Les racines interagissent beaucoup avec leur environnement de sol, mais il est difficile de visualiser de telles interactions entre les racines et la rhizosphère environnante. La chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides est particulièrement difficile à capturer en raison des gradients d’oxygène abrupts des racines au sol en vrac. Ici, un protocole est décrit qui préserve efficacement la structure racinaire et la chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides grâce à la congélation et à la lyophilisation. La congélation slam, où l’échantillon est congelé entre des blocs de cuivre pré-refroidis avec de l’azote liquide, minimise les dommages aux racines et la distorsion de l’échantillon qui peuvent se produire avec la congélation éclair tout en minimisant les changements de spéciation chimique. Bien que la distorsion de l’échantillon soit encore possible, la possibilité d’obtenir plusieurs échantillons rapidement et à un coût minimal augmente le potentiel d’obtenir des échantillons satisfaisants et optimise le temps d’imagerie. Les données montrent que cette méthode réussit à préserver les espèces d’arsenic réduites dans les racines de riz et les rhizosphères associées aux plaques de fer. Cette méthode peut être adoptée pour l’étude des relations plantes-sol dans une grande variété d’environnements de zones humides qui couvrent des plages de concentration allant du cycle des oligo-éléments aux applications de phytoremédiation.
Introduction
Les racines et leurs rhizosphères sont dynamiques, hétérogènes et d’une importance cruciale pour comprendre comment les plantes obtiennent des nutriments minéraux et des contaminants1,2,3. Les racines sont la principale voie par laquelle les nutriments (p. ex., le phosphore) et les contaminants (p. ex., l’arsenic) se déplacent du sol aux plantes et, par conséquent, la compréhension de ce processus a des répercussions sur la quantité et la qualité des aliments, le fonctionnement de l’écosystème et la phytoremédiation. Cependant, les racines sont dynamiques dans l’espace et le temps en croissance en réponse aux besoins d’acquisition de nutriments et elles varient souvent en fonction, en diamètre et en structure (par exemple, racines latérales, racines adventices, poils racinaires)2. L’hétérogénéité des systèmes racinaires peut être étudiée à l’échelle spatiale, du niveau cellulaire au niveau de l’écosystème et à l’échelle temporelle, de l’heure au décennal. Ainsi, la nature dynamique et hétérogène des racines et de leur sol environnant, ou rhizosphère, pose des défis pour capturer la chimie de la rhizosphère au fil du temps. Malgré ce défi, il est impératif d’étudier les racines dans leur environnement de sol pour caractériser cette relation critique plante-sol.
La chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides est particulièrement difficile à étudier en raison des gradients d’oxygène abrupts qui existent du sol en vrac aux racines, qui changent dans l’espace et le temps. Parce que les racines ont besoin d’oxygène pour respirer, les plantes des zones humides se sont adaptées aux conditions de faible teneur en oxygène des sols des zones humides en créant un aerenchyma4,5. Les aéréchymes sont des tissus corticaux évidés qui s’étendent des pousses aux racines, permettant la diffusion de l’air à travers la plante dans les racines. Cependant, une partie de cet air s’échappe dans la rhizosphère dans les parties moins subérisées des racines, en particulier près des jonctions latérales des racines, des extrémités des racines moins matures et des zones d’allongement6,7,8,9. Cette perte radiale d’oxygène crée une zone oxydée dans la rhizosphère des plantes des zones humides qui affecte la rhizosphère (bio-géo)chimie et est distincte du sol en vrac réduit10,11,12. Pour comprendre le devenir et le transport des nutriments et des contaminants dans les rhizosphères et les racines des zones humides, il est essentiel de préserver le sol en vrac chimiquement réduit, la rhizosphère oxydée et les racines des plantes des zones humides pour analyse. Cependant, comme le sol en vrac contient des constituants réduits du sol qui sont sensibles à l’oxygène, les méthodes de préservation des racines et du sol doivent préserver les structures racinaires et minimiser les réactions sensibles à l’oxygène.
Il existe des méthodes pour fixer les tissus végétaux et préserver l’ultrastructure pour l’imagerie, mais ces méthodes ne peuvent pas être appliquées pour préserver chimiquement les racines qui poussent dans le sol des zones humides. Pour les études où seule la distribution élémentaire dans les cellules végétales est souhaitée, les plantes sont généralement cultivées en hydroponie et les racines peuvent être facilement retirées de la solution, fixées sous congélation à haute pression et substitution par congélation et sectionnées pour une variété d’applications d’imagerie, y compris la spectrométrie de masse ionique secondaire à haute résolution (nanoSIMS), la microscopie électronique et l’analyse synchrotron par fluorescence X (S-XRF)13, 14,15. Pour étudier la plaque de Fe à l’extérieur des racines des zones humides, ces études hydroponiques doivent induire artificiellement la formation de plaque de Fe dans la solution16, qui ne représente pas avec précision l’hétérogénéité de la distribution et de la composition minérale de la formation de plaque de Fe et des éléments associés in situ17,18,19,20. Des méthodes existent pour préserver le sol des zones humides et les micro-organismes associés au carottage par congélation21, mais il est difficile d’obtenir des racines avec cette technique. Les méthodes actuelles pour visualiser les racines qui poussent dans le sol et leur chimie rhizosphérique se composent de deux types de mesure primaires: les flux élémentaires et la concentration élémentaire totale (et la spéciation). Le premier est généralement mesuré à l’aide de gradients diffusifs dans des couches minces (DGT)22,23,24, dans lesquelles le sol est placé dans des rhizoboxes pour soutenir la croissance des plantes en laboratoire et les éléments labiles dans le sol diffusent à travers un gel dans une couche de liaison. Cette couche de liaison peut ensuite être imagée pour quantifier les éléments labiles d’intérêt. Cette technique peut illustrer avec succès les relations entre les racines et la rhizosphère24,25,26,27, mais des artefacts provenant de la délimitation des racines peuvent exister en cultivant des plantes dans des rhizoboxes, et les informations sur l’intérieur des racines ne sont pas capturées avec DGT. Ce dernier implique l’échantillonnage des racines et de la rhizosphère, la préservation de l’échantillon et l’analyse directe de la distribution élémentaire sur une section d’échantillon. Pour cet échantillonnage environnemental des racines des plantes des zones humides et de leur rhizosphère environnante, une manipulation minutieuse des échantillons est nécessaire pour éviter les artefacts provenant de la préparation des échantillons.
Ici, un protocole est décrit qui préserve efficacement les structures racinaires et la chimie de la rhizosphère des plantes des zones humides par congélation et lyophilisation. La congélation éclair peut ralentir considérablement les transformations des solutés sensibles à l’oxygène, mais peut endommager les racines et provoquer une mobilisation lorsque les échantillons se dessèchent. Cependant, la congélation par claquement où l’échantillon est congelé entre des blocs de cuivre pré-refroidis avec de l’azote liquide minimise les dommages aux racines et la distorsion de l’échantillon28. Les échantillons conservés sont ensuite incorporés dans une résine époxy qui préserve la spéciationAs 20,29 et peut être coupée et polie pour l’imagerie des racines dans leur sol de rhizosphère. Les échantillons de ce rapport ont été analysés par imagerie de spéciation chimique S-XRF après sectionnement mince. Cependant, d’autres techniques d’imagerie pourraient également être utilisées, notamment la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif par ablation laser (LA-ICP-MS), l’émission de rayons X induite par particules (PIXE), la spectrométrie de masse ionique secondaire (SIMS) et l’imagerie par spectroscopie de dégradation induite par laser (LIBS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit un protocole pour obtenir un sol en vrac préservé + rhizosphères de racines de plantes de zones humides en utilisant une technique de congélation slam qui peut être utilisée pour l’imagerie élémentaire et / ou la cartographie de la spéciation chimique.
Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes. Tout d’abord, cette méthode permet l’étude simultanée des racines et des rhizosphères environnantes. Il existe actuellement…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent une subvention de démarrage conjointe à Seyfferth et Tappero pour soutenir la collaboration entre l’Université du Delaware et le Brookhaven National Laboratory. Certaines parties de cette recherche ont utilisé la ligne de faisceau XFM (4-BM) de la National Synchrotron Light Source II, une installation d’utilisateurs du Bureau des sciences du département de l’Énergie des États-Unis (DOE) exploitée pour le Bureau des sciences du DOE par le Brookhaven National Laboratory en vertu du contrat no. DE-SC0012704.
Materials
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
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