Un método para preservar las raíces y rizosferas de los humedales para imágenes elementales
Summary
Describimos un protocolo para muestrear, preservar y seccionar raíces intactas y el suelo de la rizosfera circundante de ambientes de humedales utilizando arroz(Oryza sativa L.) como especie modelo. Una vez conservada, la muestra se puede analizar utilizando técnicas de imagen elemental, como la imagen de especiación química de fluorescencia de rayos X sincrotrón (XRF).
Abstract
Las raíces interactúan ampliamente con su entorno de suelo, pero visualizar tales interacciones entre las raíces y la rizosfera circundante es un desafío. La química de la rizosfera de las plantas de humedales es particularmente difícil de capturar debido a los gradientes de oxígeno pronunciados desde las raíces hasta el suelo a granel. Aquí se describe un protocolo que preserva eficazmente la estructura radicular y la química de la rizosfera de las plantas de los humedales a través de la congelación y la liofilización. La congelación por golpe, donde la muestra se congela entre bloques de cobre preenfriados con nitrógeno líquido, minimiza el daño a la raíz y la distorsión de la muestra que puede ocurrir con la congelación instantánea al tiempo que minimiza los cambios de especiación química. Si bien la distorsión de la muestra sigue siendo posible, la capacidad de obtener múltiples muestras rápidamente y con un costo mínimo aumenta el potencial para obtener muestras satisfactorias y optimiza el tiempo de obtención de imágenes. Los datos muestran que este método tiene éxito en la preservación de especies reducidas de arsénico en raíces de arroz y rizosferas asociadas con placas de hierro. Este método se puede adoptar para estudios de relaciones planta-suelo en una amplia variedad de ambientes de humedales que abarcan rangos de concentración desde el ciclo de oligoelementos hasta aplicaciones de fitorremediación.
Introduction
Las raíces y sus rizosferas son dinámicas, heterogéneas y de importancia crítica para comprender cómo las plantas obtienen nutrientes minerales y contaminantes1,2,3. Las raíces son la vía principal por la cual los nutrientes (por ejemplo, fósforo) y los contaminantes (por ejemplo, arsénico) se mueven del suelo a las plantas y, por lo tanto, comprender este proceso tiene implicaciones para la cantidad y calidad de los alimentos, el funcionamiento del ecosistema y la fitorremediación. Sin embargo, las raíces son dinámicas en el espacio y el tiempo creciendo en respuesta a las necesidades de adquisición de nutrientes y a menudo varían en función, diámetro y estructura (por ejemplo, raíces laterales, raíces adventicias, pelos de raíz)2. La heterogeneidad de los sistemas radiculares se puede estudiar en escalas espaciales desde el nivel celular hasta el ecosistema y en escalas temporales desde el horario hasta el decenal. Por lo tanto, la naturaleza dinámica y heterogénea de las raíces y su suelo circundante, o rizosfera, plantea desafíos para capturar la química de la rizosfera a lo largo del tiempo. A pesar de este desafío, es imperativo estudiar las raíces en su entorno de suelo para caracterizar esta relación crítica planta-suelo.
La química de la rizosfera de las plantas de humedales es particularmente difícil de investigar debido a los gradientes de oxígeno empinados que existen desde el suelo a granel hasta las raíces, que cambian en el espacio y el tiempo. Debido a que las raíces necesitan oxígeno para respirar, las plantas de los humedales se han adaptado a las condiciones de bajo oxígeno de los suelos de los humedales mediante la creación de aerénquima4,5. Los aerénquimas son tejidos corticales ahuecados que se extienden desde los brotes hasta las raíces, permitiendo la difusión del aire a través de la planta hacia las raíces. Sin embargo, parte de este aire se filtra en la rizosfera en partes menos suberizadas de las raíces, particularmente cerca de las uniones laterales de las raíces, las puntas de las raíces menos maduras y las zonas de elongación6,7,8,9. Esta pérdida radial de oxígeno crea una zona oxidada en la rizosfera de las plantas de humedales que afecta la rizosfera (bio-geo)química y es distinta del suelo a granel reducido10,11,12. Para comprender el destino y el transporte de nutrientes y contaminantes en las rizosferas y raíces de los humedales, es fundamental preservar el suelo a granel químicamente reducido, la rizosfera oxidada y las raíces de las plantas de los humedales para su análisis. Sin embargo, debido a que el suelo a granel contiene componentes reducidos del suelo que son sensibles al oxígeno, los métodos de preservación de raíces y suelos deben preservar las estructuras radiculares y minimizar las reacciones sensibles al oxígeno.
Existen métodos para fijar los tejidos de las plantas y preservar la ultraestructura para la obtención de imágenes, pero esos métodos no se pueden aplicar para preservar químicamente las raíces que crecen en el suelo de los humedales. Para las investigaciones en las que solo se desea la distribución elemental dentro de las células vegetales, las plantas generalmente se cultivan hidropónicamente y las raíces se pueden eliminar fácilmente de la solución, fijarse bajo congelación a alta presión y sustitución por congelación y seccionarse para una variedad de aplicaciones de imágenes, incluida la espectrometría de masas de iones secundarios de alta resolución (nanoSIMS), la microscopía electrónica y el análisis de fluorescencia de rayos X sincrotrón (S-XRF)13, 14,15. Para investigar la placa de Fe en el exterior de las raíces de los humedales, estos estudios hidropónicos deben inducir artificialmente la formación de placa de Fe en la solución16,que no representa con precisión la heterogeneidad de la distribución y composición mineral de la formación de placa de Fe y los elementos asociados in situ17,18,19,20. Existen métodos para preservar el suelo de los humedales y los microorganismos asociados con la congelación21,pero es difícil obtener raíces con esta técnica. Los métodos actuales para visualizar las raíces que crecen en el suelo y su química rizosférica consisten en dos tipos de medición principales: flujos elementales y concentración elemental total (y especiación). El primero se mide típicamente utilizando gradientes difusivos en películas delgadas (DGT)22 , 23,24, en las que el suelo se coloca en rizoboxes para apoyar el crecimiento de las plantas en un entorno de laboratorio y los elementos lábiles en el suelo se difunden a través de un gel en una capa de unión. Esta capa de unión se puede obtener imágenes para cuantificar los elementos lábiles de interés. Esta técnica puede ilustrar con éxito las relaciones entre las raíces y larizosfera 24,25,26,27,pero los artefactos de la delimitación radicular pueden existir al cultivar plantas en rizoboxes, y la información sobre el interior de la raíz no se captura con DGT. Este último implica el muestreo de las raíces y la rizosfera, la preservación de la muestra y el análisis directo de la distribución elemental en una sección de muestra. Para este muestreo ambiental de las raíces de las plantas de los humedales y su rizosfera circundante, se requiere un manejo cuidadoso de la muestra para evitar los artefactos de la preparación de la muestra.
Aquí se describe un protocolo que preserva eficazmente las estructuras radiculares y la química de la rizosfera de las plantas de los humedales mediante la congelación por golpe y la liofilización. La congelación repentina puede ralentizar drásticamente las transformaciones de solutos sensibles al oxígeno, pero puede dañar las raíces y causar movilización cuando las muestras se secan. Sin embargo, la congelación por golpe donde la muestra se congela entre bloques de cobre preenfriados con nitrógeno líquido minimiza el daño a la raíz y la distorsión de la muestra28. Las muestras conservadas se incrustan en una resina epoxi que conserva As speciation20,29 y se pueden cortar y pulir para obtener imágenes de raíces dentro de su suelo de rizosfera. Las muestras en este informe fueron analizadas por imágenes de especiación química S-XRF después de la sección delgada. Sin embargo, también se podrían utilizar otras técnicas de imagen, incluida la espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente a la ablación con láser (LA-ICP-MS), la emisión de rayos X inducida por partículas (PIXE), la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS) y la espectroscopia de ruptura inducida por láser (LIBS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe un protocolo para obtener suelo a granel preservado + rizosferas de raíces de plantas de humedales utilizando una técnica de congelación por golpe que se puede utilizar para imágenes elementales y / o mapeo de especiación química.
Hay varios beneficios de este método sobre los métodos existentes. En primer lugar, este método permite la investigación simultánea de las raíces y las rizosferas circundantes. Actualmente existen métodos para preservar e imagen q…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen una subvención conjunta de semillas a Seyfferth y Tappero para apoyar la colaboración entre la Universidad de Delaware y el Laboratorio Nacional de Brookhaven. Partes de esta investigación utilizaron la línea de haz XFM (4-BM) de la Fuente Nacional de Luz Sincrotrón II, una Instalación de Usuario de la Oficina de Ciencias del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE) operada para la Oficina de Ciencia del DOE por el Laboratorio Nacional Brookhaven bajo el Contrato No. DE-SC0012704.
Materials
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
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