元素イメージングのための湿地根と根層圏を保存する方法
Summary
我々は、米(Oryza sativa L.)をモデル種として使用して湿地環境から無傷の根と周囲の根球土壌をサンプリング、保存、および切除するためのプロトコルを記述する。保存後、このサンプルは、放射光蛍光X線(XRF)化学種分イメージングなどの元素イメージング技術を使用して分析することができます。
Abstract
根は土壌環境と幅広く相互作用しますが、根と周囲の根層の相互作用を視覚化することは困難です。湿地植物の根圏化学は、根からバルク土壌への急激な酸素勾配のために捕獲することが特に困難である。ここでは、スラム凍結と凍結乾燥を通じて湿地植物の根構造と根圏化学を効果的に保存するプロトコルが記載されています。液体窒素であらかじめ冷却された銅ブロック間でサンプルを凍結するスラム凍結は、化学種分化の変化を最小限に抑えながら、フラッシュフリーズで発生する可能性のある根の損傷とサンプル歪みを最小限に抑えます。サンプルの歪みは引き続き可能ですが、複数のサンプルを迅速かつ最小限のコストで取得できるため、満足のいくサンプルを得ることができ、イメージング時間が最適化されます。このデータは、この方法が鉄のプラークに関連する米の根および根層圏の減少ヒ素種を保存することに成功したことを示している。この方法は、微量元素循環から植物修復用途まで、濃度範囲に及ぶ広範囲の湿地環境における植物と土壌の関係の研究に採用することができます。
Introduction
根とそれらの根球は、植物がミネラル栄養素と汚染物質を得る方法を理解するために、動的、異種、および非常に重要です1,2,3.根は、栄養素(例えば、リン)と汚染物質(例えば、ヒ素)が土壌から植物に移動し、このプロセスを理解することは、食品の量と質、生態系機能、植物修復に影響を与える一次経路です。しかし、根は栄養摂取のニーズに応じて空間および時間が成長する動きであり、それらはしばしば機能、直径、および構造(例えば、横根、外見的な根、根毛)2で変化する。根系の異質性は、細胞から生態系レベルまでの空間スケールと、時間単位から10年までの時間スケールで研究することができます。したがって、根とその周囲の土壌、または根圏のダイナミックで不均一な性質は、時間の経過とともに根圏化学を捕捉するための課題を提起する。この課題にもかかわらず、この重要な植物と土壌の関係を特徴付けるために、土壌環境の根を研究することが不可欠です。
湿地植物の根圏化学は、バルク土壌から根まで存在する急激な酸素勾配が存在し、空間と時間が変化するため、特に調査が困難です。根は酸素を吸い込む必要があるため、湿地植物は、アエレンチマ4,5を作り出すことで湿地土壌の低酸素状態に適応している。アエレンチマは、芽から根まで広がる空洞化皮質組織であり、植物を通して根に空気を拡散させる。しかし、この空気の一部は、根の根のあまり茎に漏れ、特に根の根の接合部の近くで、成熟した根の先端と伸び帯6、7、8、9が少ない。この放射状酸素損失は、根層圏(生物ジオ)化学に影響を与える湿地植物の根層に酸化されたゾーンを作り出し、還元バルク土壌10、11、12とは異なる。湿地の根球や根の栄養成分や汚染物質の運送と輸送を理解するためには、化学的に還元されたバルク土壌、酸化された根球、湿地植物の根を分析するために保存することが重要です。しかし、バルク土壌には酸素感受性の還元土壌成分が含まれているため、根および土壌の保存方法は根構造を維持し、酸素感受性反応を最小限に抑える必要があります。
植物組織を固定し、イメージングのための超構造を維持する方法が存在しますが、これらの方法は、湿地土壌に成長している根を化学的に保存するために適用することはできません。植物細胞内の元素分布のみが望まれる調査では、植物は一般的に水耕的に成長し、根を溶液から容易に除去し、高圧凍結および凍結置換下で固定し、高解像度二次イオン質量分析(nanoSIMS)、電子顕微鏡、シンクロトロンX線蛍光(S-XRF)分析を含む様々なイメージングアプリケーションに切除することができる。 14、15.湿地根の外側にあるFeプラークを調査するために、これらの水耕栽培研究は、溶液16においてFeプラーク形成を人工的に誘導しなければならないが、これは、Feプラーク形成および関連元素の分布および鉱物組成の不均一性を正確に表さない。凍結採点21で湿地土および関連微生物を保存する方法が存在するが、この技術では根を得ることは困難である。土壌中に生育する根を可視化する現在の方法とその根茎圏化学は、元素束と全元素濃度(および種分化)の2つの主要な測定タイプで構成されています。前者は、通常、薄膜(DGT)22、23、24の拡散勾配を使用して測定され、土壌は実験室での植物の成長を支えるために根茎に入れられ、土壌中の不安定な元素はゲルを介して結合層に拡散する。この結合層は、その後、対象の陰唇要素を定量化するために画像化することができます。この技術は根と根茎24、25、26、27との関係をうまく示すことができますが、根の境界からのアーティファクトは根茎の植物を育てることによって存在し、根内部の情報はDGTでは捕捉されません。後者は、根と根圏のサンプリング、サンプルを保存し、サンプルセクション上の元素分布を直接分析することを含みます。湿地植物の根とその周囲の根層のこの環境サンプリングのために、サンプル調製からアーティファクトを避けるために慎重なサンプル処理が必要です。
ここでは、スラム凍結と凍結乾燥によって湿地植物の根構造と根圏化学を効果的に保存するプロトコルが記載されています。フラッシュフリーズは酸素感受性の溶質の変換を劇的に遅くすることができますが、根を損傷し、サンプルが乾燥すると動員を引き起こす可能性があります。しかしながら、液体窒素であらかじめ冷却された銅ブロック間で試料が凍結されたスラム凍結は、根の損傷およびサンプル歪みを最小限に抑える28。保存されたサンプルは、その後、種分化20、29を保存するエポキシ樹脂に埋め込まれ、根茎の土壌内の根のイメージングのために切断および研磨することができます。このレポートのサンプルは、薄い断面化後のS-XRF化学種分イメージングによって分析された。しかし、レーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析(LA-ICP-MS)、粒子誘導X線放出(PIXE)、二次イオン質量分析(SIMS)、レーザー誘導分解分光法(LIBS)イメージングなど、他のイメージング技術も使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、元素イメージングや化学種分マッピングに使用できるスラム凍結技術を用いて、湿地植物根の保存バルク土壌+根球を得るためのプロトコルについて説明する。
既存の方法よりも、この方法のいくつかの利点があります。まず、この方法により、根と周囲の根層圏を同時に調査することが可能となる。土壌を洗い流し</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、デラウェア大学とブルックヘブン国立研究所との共同研究を支援するシーファースとタペロへの共同シード交付金を認めている。この研究の一部は、ブルックヘブン国立研究所が契約No.1のDOE科学局のために運営する米国エネルギー省(DOE)科学ユーザー施設である国立シンクロトロン光源IIのXFM(4-BM)ビームラインを使用しました。DE-SC0012704.
Materials
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
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