Метод сохранения корней водно-болотных угодий и ризосфер для элементной визуализации
Summary
Мы описываем протокол отбора проб, сохранения и секционного истечения неповрежденных корней и окружающей ризосферной почвы из водно-болотных угодий с использованиемриса (Oryza sativa L.) в качестве модельного вида. После сохранения образец может быть проанализирован с использованием методов элементной визуализации, таких как синхротронная рентгеновская флуоресцентная (XRF) химическая визуализация видообразования.
Abstract
Корни широко взаимодействуют со своей почвенной средой, но визуализация таких взаимодействий между корнями и окружающей ризосферой является сложной задачей. Химию ризосферы водно-болотных растений особенно сложно уловить из-за крутых градиентов кислорода от корней до объемной почвы. Здесь описан протокол, который эффективно сохраняет корневую структуру и химию ризосферы водно-болотных растений путем замораживания и сублимационной сушки. Слэм-замораживание, когда образец замораживается между медными блоками, предварительно охлажденными жидким азотом, сводит к минимуму повреждение корней и искажение образца, которые могут произойти при мгновенном замораживании, в то же время сводя к минимуму изменения химического видообразования. Хотя искажение образца все еще возможно, возможность получения нескольких образцов быстро и с минимальными затратами увеличивает потенциал для получения удовлетворительных образцов и оптимизирует время визуализации. Данные показывают, что этот метод является успешным в сохранении восстановленных видов мышьяка в корнях риса и ризосферах, связанных с железными бляшками. Этот метод может быть использован для исследований отношений между растениями и почвой в широком спектре водно-болотных сред, которые охватывают диапазон концентраций от круговорота микроэлементов до фиторемедиации.
Introduction
Корни и их ризосферы динамичны, неоднородны и критически важны для понимания того, как растения получают минеральные питательные вещества и загрязняющие вещества1,2,3. Корни являются основным путем, по которому питательные вещества (например, фосфор) и загрязняющие вещества (например, мышьяк) перемещаются из почвы в растения, и, таким образом, понимание этого процесса имеет последствия для количества и качества пищи, функционирования экосистем и фиторемедиации. Тем не менее, корни динамичны в пространстве и времени, растущие в ответ на потребности в приобретении питательных веществ, и они часто различаются по функции, диаметру и структуре (например, боковые корни, адвентивные корни, корневые волоски)2. Гетерогенность корневых систем может быть изучена в пространственных масштабах от клеточного до экосистемного уровня и во временных масштабах от ежечасного до десятилетнего. Таким образом, динамическая и гетерогенная природа корней и окружающей их почвы, или ризосферы, создает проблемы для захвата химии ризосферы с течением времени. Несмотря на эту проблему, крайне важно изучить корни в их почвенной среде, чтобы охарактеризовать эту критическую связь между растениями и почвой.
Химию ризосферы водно-болотных растений особенно сложно исследовать из-за крутых градиентов кислорода, которые существуют от объемной почвы до корней, которые изменяются в пространстве и времени. Поскольку корни нуждаются в кислороде для вдыхания, водно-болотные растения адаптировались к условиям низкого содержания кислорода в водно-болотных почвах, создав аэренхиму4,5. Аэренхимы представляют собой полые корковые ткани, которые простираются от побегов до корней, позволяя диффузии воздуха через растение в корни. Однако часть этого воздуха просачивается в ризосферу в менее суберизированных частях корней, особенно вблизи боковых корневых соединений, менее зрелых кончиков корней и зон удлинения6,7,8,9. Эта радиальная потеря кислорода создает окисленную зону в ризосфере водно-болотных растений, которая влияет на химию ризосферы (био-гео) и отличается от восстановленной объемной почвы10,11,12. Чтобы понять судьбу и перенос питательных веществ и загрязняющих веществ в водно-болотных ризосферах и корнях, крайне важно сохранить химически восстановленную объемную почву, окисленную ризосферу и корни водно-болотных растений для анализа. Однако, поскольку объемная почва содержит восстановленные компоненты почвы, чувствительные к кислороду, методы сохранения корней и почвы должны сохранять корневые структуры и сводить к минимуму чувствительные к кислороду реакции.
Существуют методы фиксации растительных тканей и сохранения ультраструктуры для визуализации, но эти методы не могут быть применены для химического сохранения корней, растущих в водно-болотной почве. Для исследований, где желательно только элементарное распределение внутри растительных клеток, растения обычно выращиваются гидропонно, а корни могут быть легко извлечены из раствора, зафиксированы под высоким давлением замораживания и замораживания и разделены для различных приложений визуализации, включая масс-спектрометрию вторичных ионов высокого разрешения (nanoSIMS), электронную микроскопию и синхротронную рентгеновскую флуоресценцию (S-XRF) анализ13, 14,15. Чтобы исследовать Fe-бляшки на внешней стороне водно-болотных корней, эти гидропонные исследования должны искусственно индуцировать образование Fe-бляшек в растворе16,который не точно представляет неоднородность распределения и минерального состава образования Fe-бляшек и связанных с ними элементов in situ17,18,19,20. Существуют методы сохранения водно-болотных угодий и связанных с ними микроорганизмов с замораживанием21,но трудно получить корни с помощью этой техники. Современные методы визуализации корней, растущих в почве, и их химии ризосферы состоят из двух основных типов измерения: элементарных потоков и общей концентрации элементов (и видообразования). Первый обычно измеряют с использованием диффузных градиентов в тонких пленках (DGT)22,23,24,в которых почва помещается в ризобоксы для поддержки роста растений в лабораторных условиях, а лабильные элементы в почве диффундирует через гель в связующий слой. Затем этот связующий слой может быть визуанирован для количественной оценки лабильных элементов, представляющих интерес. Этот метод может успешно проиллюстрировать отношения между корнями и ризосферой24,25,26,27,но артефакты из корневой границы могут существовать при выращивании растений в ризобоксах, а информация о внутренней части корня не захватывается с помощью DGT. Последнее включает в себя отбор проб корней и ризосферы, сохранение образца и непосредственный анализ элементного распределения на участке образца. Для этого экологического отбора проб корней водно-болотных растений и окружающей их ризосферы требуется тщательная обработка образцов, чтобы избежать артефактов от подготовки образцов.
Здесь описан протокол, который эффективно сохраняет корневые структуры и химию ризосферы водно-болотных растений путем замораживания и сублимационной сушки. Мгновенное замораживание может резко замедлить превращение чувствительных к кислороду растворений, но может повредить корни и может вызвать мобилизацию, когда образцы высыхают. Однако захлопывание, когда образец заморожен между медными блоками, предварительно охлажденными жидким азотом, сводит к минимуму повреждение корней и искажение образца28. Сохраненные образцы затем встраиваются в эпоксидную смолу, которая сохраняет as speciation20,29 и может быть разрезана и отполирована для визуализации корней в их ризосферной почве. Образцы в этом отчете были проанализированы с помощью химического видообразования S-XRF после тонкого сечения. Тем не менее, также могут быть использованы другие методы визуализации, включая масс-спектрометрию плазмы с лазерной абляцией индуктивно связанной (LA-ICP-MS), рентгеновское излучение, индуцированное частицами (PIXE), масс-спектрометрию вторичных ионов (SIMS) и лазерную спектроскопию пробоя (LIBS).
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается протокол получения сохраненной объемной почвы + ризосферы корней водно-болотных растений с использованием метода замораживания шлема, который может быть использован для элементной визуализации и/или картирования химического видообразования.
<p class="jove_content"…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают совместный грант на семена Сейфферта и Тапперо для поддержки сотрудничества между Университетом штата Делавэр и Брукхейвенской национальной лабораторией. В рамках этого исследования использовалась лучевая линия XFM (4-BM) Национального синхротронного источника света II, пользовательского объекта Управления науки Министерства энергетики США (DOE), управляемого для Управления науки Министерства энергетики США Брукхейвенской национальной лабораторией по контракту No. DE-SC0012704.
Materials
| Copper blocks | McMaster Carr | 89275K42 | |
| Diamond blade | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | operation speed: 225 rpm |
| Epoxy forms | Struers | 40300085 | FixiForm |
| Epoxy | Epotek | 301-2FL | |
| Superglue | Loctite | 404 | |
| Thin sectioning machine | Buehler | PetroThin | |
| Wet saw | Buehler | IsoMet 1000 |
Referências
- Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
- McNear, D. H. The rhizosphere – roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
- Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
- Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
- Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
- Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
- Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
- Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
- Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
- Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
- Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
- vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
- Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
- Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
- Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
- Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
- Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
- Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
- Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
- Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
- Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
- Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
- Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
- Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
- Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
- Voegelin, A., Weber, F. -. A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
- Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
- Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
- Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
- Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
- Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
- Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
- Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).
