Summary
Protein arginin (R) -methylering er en udbredt posttranslationel modifikation, der regulerer flere biologiske veje. Massespektrometri er den bedste teknologi til globalt at profilere R-methylproteomet, når det kobles til biokemiske tilgange til modificeret peptidberigelse. Arbejdsgangen designet til identifikation med høj tillid til global R-methylering i humane celler er beskrevet her.
Abstract
Protein arginin (R) -methylering er en udbredt protein posttranslationel modifikation (PTM) involveret i reguleringen af flere cellulære veje, herunder RNA-behandling, signaltransduktion, DNA-skaderespons, miRNA-biogenese og translation.
I de senere år har massespektrometri (MS) baseret proteomics takket være biokemiske og analytiske udviklinger vist sig som den mest effektive strategi til at karakterisere det cellulære methyl-proteom med single-site opløsning. Identifikation og profilering in vivo protein R-methylering af MS er imidlertid fortsat udfordrende og fejlbehæftet, hovedsagelig på grund af den substoichiometriske karakter af denne ændring og tilstedeværelsen af forskellige aminosyresubstitutioner og kemisk methylesterificering af sure rester, der er isobariske til methylering. Således kræves berigelsesmetoder til forbedring af identifikationen af R-methylpeptider og ortogonale valideringsstrategier for at reducere falske opdagelseshastigheder (FDR) i methylproteomics-undersøgelser.
Her beskrives en protokol specielt designet til identifikation og kvantificering af R-methylpeptider med høj tillid fra cellulære prøver, som kobler metabolisk mærkning af celler med tung isotopkodet methionin (hmSILAC) og dobbelt proteasefordøjelse i opløsning af helcelleekstrakt efterfulgt af off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) kromatografifraktionering og affinitetsberigelse af R-methylpeptider ved anvendelse af anti-pan-R-methylantistoffer. Efter MS-analyse i høj opløsning behandles rådata først med MaxQuant-softwarepakken, og resultaterne analyseres derefter af hmSEEKER, en software designet til dybdegående søgning af MS-toppar svarende til let og tungt methylpeptid i MaxQuant-outputfilerne.
Introduction
Arginin (R)-methylering er en posttranslationel modifikation (PTM), der dekorerer omkring 1% af pattedyrproteomet1. Protein argininmethyltransferaser (PRMT'er) er enzymerne, der katalyserer R-methyleringsreaktion ved aflejring af en eller to methylgrupper til nitrogenatomerne (N) i guanidino-gruppen i sidekæden af R på en symmetrisk eller asymmetrisk måde. Hos pattedyr kan PRMT'er grupperes i tre klasser - type I, type II og type III - afhængigt af deres evne til at deponere både monomethylering (MMA) og asymmetrisk di-methylering (ADMA), MMA og symmetrisk di-methylering (SDMA) eller kun MMA, henholdsvis 2,3. PRMT'er er hovedsageligt rettet mod R-rester placeret i glycin- og argininrige regioner, kendt som GAR-motiver, men nogle PRMT'er, såsom PRMT5 og CARM1, kan methylatprolin-glycin-methioninrige (PGM) motiver4. R-methylering er opstået som en proteinmodulator af flere biologiske processer, såsom RNA-splejsning5, DNA-reparation6, miRNA-biogenese7 og translation2, hvilket fremmer forskningen på denne PTM.
Massespektrometri (MS) er anerkendt som den mest effektive teknologi til systematisk at studere global R-methylering ved protein-, peptid- og stedopløsning. Denne PTM kræver dog nogle særlige forholdsregler for at kunne identificere den med høj tillid fra medlemsstaterne. For det første er R-methylering substoichiometrisk, idet den umodificerede form af peptiderne er meget mere rigelig end de modificerede, således at massespektrometre, der opererer i DDA-tilstand (Data Dependent Acquisition), vil fragmentere højintensive umodificerede peptider oftere end deres methylerede modstykker med lavere intensitet8. Desuden lider de fleste MS-baserede arbejdsgange til identifikation af R-methylerede steder af begrænsninger på bioinformatisk analyseniveau. Faktisk er beregningsidentifikationen af methylpeptider tilbøjelig til høje falske opdagelseshastigheder (FDR), fordi denne PTM er isobarisk for forskellige aminosyresubstitutioner (f.eks. Glycin til alanin) og kemisk modifikation, såsom methylesterificering af aspartat og glutamat9. Derfor er metoder baseret på isotopmærkning af methylgrupper, såsom tung methylstabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur (hmSILAC), blevet implementeret som ortogonale strategier til sikker MS-identifikation af in vivo-methyleringer , hvilket signifikant reducerer antallet af falske positive annoteringer10.
For nylig er forskellige proteom-dækkende protokoller til undersøgelse af R-methylerede proteiner blevet optimeret. Udviklingen af antistofbaserede strategier for immun-affinitetsberigelse af R-methylpeptider har ført til annotering af flere hundrede R-methylerede steder i humane celler11,12. Desuden rapporterede mange undersøgelser 3,13, at kobling af antistofbaseret berigelse med peptidseparationsteknikker såsom HpH-RP-kromatografifraktionering kan øge det samlede antal identificerede methylpeptider.
Denne artikel beskriver en eksperimentel strategi designet til systematisk og høj tillid identifikation af R-methylerede steder i humane celler baseret på forskellige biokemiske og analytiske trin: proteinekstraktion fra hmSILAC-mærkede celler, parallel dobbelt enzymatisk fordøjelse med Trypsin og LysargiNase proteaser, efterfulgt af HpH-RP kromatografisk fraktionering af fordøjede peptider kombineret med antistofbaseret immuno-affinitetsberigelse af MMA-, SDMA-, og ADMA-holdige peptider. Alle affinitetsberigede peptider analyseres derefter ved højopløsnings væskekromatografi (LC)-MS/MS i DDA-tilstand, og rå MS-data behandles af MaxQuant-algoritmen til identifikation af R-methyl-peptider. Endelig behandles MaxQuant-outputresultaterne med hmSEEKER, et internt udviklet bioinformatikværktøj til at søge par tunge og lette methylpeptider. Kort fortalt læser og filtrerer hmSEEKER methylpeptididentifikationer fra msms-filen, matcher derefter hvert methylpeptid med dets tilsvarende MS1-top i allPeptides-filen og søger endelig toppen af den tunge / lette peptid-modstykke. For hvert formodet tungt lyspar beregnes parametrene Log2 H/L-forhold (LogRatio), retentionstidsforskel (dRT) og Mass Error (ME), og dubletter, der er placeret inden for brugerdefinerede afskæringer, mærkes som sande positive. Arbejdsgangen for den biokemiske protokol er beskrevet i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celledyrkning og proteinekstraktion (tid: 3 - 4 uger påkrævet)
- Dyrk HeLa-celler parallelt i medier, der leveres med henholdsvis let (L) eller tung (H) methionin (se tabel 1 for mediesammensætning). Ved mindst otte celledelinger indsamles en aliquot af celler fra hver SILAC-kanal, og inkorporeringstesten udføres.
BEMÆRK: For at kontrollere inkorporeringseffektiviteten testes ved LC-MS / MS-analyse, at procentdelen af tung methionin (Met-4) i Heavy-kanalen er så tæt som muligt på 100%. Analyser en alikvote af tunge mærkede celler med LC-MS/MS (for indstillinger se tabel 2), og behandl derefter MS-dataene med MaxQuant ved hjælp af de parametre, der er angivet i tabel 3. For at kontrollere for Met-4-inkorporeringen er et internt udviklet script tilgængeligt på https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. - Overvej tung methioninin-inkorporering som komplet, når den når >97%. Når hver kanal når et samlet antal på ca. 60 x 106 celler (svarende til ca. 40 retter på 15 cm hver ved 85% sammenløb for HeLa-celler, med variationer afhængigt af celletypen) høstes dem. Tæl dem forsigtigt, bland i 1:1 andel og pellet ved centrifugering ved 335 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: For at vurdere den korrekte 1: 1 L / H-blanding skal du holde en aliquot og køre den på en skive af en gel, der vides at indeholde en høj overflod og stærkt R-methyleret protein (f.eks. Fibrillarin). Hvis mærkningen har været vellykket, og der er opnået 1:1-blanding, skal der være et 1:1-forhold mellem lette og tunge versioner af de R-methylerede peptider, der er til stede i prøven. Alternativt kan du opbevare en aliquot af blandet prøve, der skal analyseres af LC-MS/MS, derefter behandle MS-dataene med MaxQuant ved hjælp af parametrene angivet i tabel 3 og plotte fordelingen af Log2 H/L-forholdet som vist i figur 2C. Protokollen kan stoppes her ved at snap-fryse pelleten og opbevare den ved -80 °C. - Re-suspend cellepellet i fire volumener af Lysis Buffer (se tabel 1 for Lysis Buffer sammensætning) med hensyn til cellepelletvolumen. Brug for eksempel 6 ml lysisbuffer til en pille fra 120 x 10 6 Hela-celler (60 x 10 6 Light + 60x 106 Heavy) svarende til 1,5 ml volumen.
BEMÆRK: Proteinekstraktion skal udføres ved stuetemperatur (RT), fordi Lysis Buffer indeholder det kaotiske middel 9 M urinstof, der udfældes ved istemperatur; derfor er tilsætningen af et bredt spektrum af serin- og cysteinproteasehæmmere vigtig såvel som fosfatasehæmmer for samtidig at beskytte proteiner mod proteolytisk nedbrydning og dephosphorylering, cocktail af protease og fosfatasehæmmere er kommercielt tilgængelige som små tabletter, se tabel 1 og materialetabel. - Soniker prøven med en mikrotip celleforstyrrende sonikator i mindst fem cyklusser på 15 s ON og 30 s OFF for at sikre effektiv brud på cellemembraner og DNA-frigivelse og klipning. Ekstraktets viskositet kontrolleres ved at pipettere opløsningen op og ned. Hvis det er for tyktflydende på grund af ufuldstændig DNA-klipning og membranopløsning, gentag sonikeringscyklusserne.
BEMÆRK: Sørg for, at prøven ikke overophedes under sonikering, fordi høj temperatur kan beskadige proteiner. Det er imidlertid ikke muligt at lægge prøven på is mellem sonikeringscyklusser på grund af tilstedeværelsen af 9M urinstof; derfor er det tilrådeligt at holde pause i 60 s OFF mellem forskellige sonikeringscyklusser. Desuden undgå dannelsen af luftbobler under sonikering, fordi de reducerer sonikeringseffektiviteten. - Centrifuger ekstraktet ved 3.000 x g i 10 minutter ved RT for at pelletere affaldet og overføre supernatanten i et nyt 15 ml rør.
- Ekstraktets proteinindhold måles med et kolorimetrisk assay, såsom Bradford eller bicinchoninsyre (BCA)14,15. En optimal startmængde proteinekstrakt til denne protokol er mellem 20-30 mg.
BEMÆRK: Lysisbuffere indeholdende urinstof med høj koncentration er kompatible både med Bradford- og BCA-kvantificeringsassay; andre typer lysisbuffere, såsom dem, der inkluderer høj koncentration af natriumdodecylsulfat (SDS), er ikke kompatible med Bradford.
2.Lysat fordøjelse (vejledende tid kræves 2 timer)
- Udfør reduktion af thiolgruppe (-SH) af proteiner ved hjælp af en stamopløsning af dithiothreitol (DTT) opløst i ultrarent vand i en slutkoncentration på 4,5 mM, og lad reaktionen gå i 30 minutter ved 55 °C.
BEMÆRK: Det er muligt at fremstille 1 M DTT-stamopløsning og opbevare den ved -20 °C i op til 1 måned og kun optø de aliquoter, der er nødvendige for hvert forsøg. Alternativt kan sulfhydrylreduktant tris-(2-carboxyethyl)-phosphin (TCEP) anvendes til at udføre reduktion af -SH-grupper; især til langtidsopbevaring af proteiner er TCEP signifikant mere stabil end DTT uden metalchelater såsom EGTA i bufferen, mens DTT er mere stabil, hvis metalchelater er til stede16. - Udfør alkylering af thiolgruppe (-SH) af proteiner ved tilsætning af iodoacetamid (IAA) i en koncentration på 10 mM og inkuberes i 15 minutter ved RT i mørke. Udfør inkubation af ekstraherede proteiner med IAA-opløsning i mørke, fordi IAS er lysfølsom.
BEMÆRK: IAA-stamopløsningen ved 100 mM skal fremstilles frisk før hvert forsøg. Alternativt kan chloracetamid anvendes til at udføre alkylering af -SH-grupper, især hvis målet med eksperimentet er at analysere krydstale mellem methylering og ubiquitination, fordi IAA-induceret artefakt efterligner ubiquitination17. - Før du fortsætter med proteinfordøjelsestrinnet, skal du gemme en aliquot af proteinekstrakt (1/1.000 af start ufordøjet lysat) til efterfølgende analyse på SDS-PAGE Coomassie-farvet gel og sammenligning med en tilsvarende mængde prøve ved fordøjelsen; Denne test tjener til at kontrollere proteolyseeffektiviteten (se punkt 4).
- Fortynd det resterende proteinekstrakt med fire volumener af 20 mM HEPES pH 8,0 for at nå en endelig urinstofkoncentration på 2 M (hvilket er den koncentration, der er kompatibel med proteasernes enzymatiske aktivitet). Prøven opdeles i to dele: I den første tilsættes sekventering af modificeret trypsin, og i den anden tilsættes LysargiNase-protease (se materialetabel) ved forholdet 1:100 (w/w) i forhold til mg udgangsmateriale. Lad natten over ved 37 °C stå i en termomixer ved 600 o / min for at tillade enzymatisk fordøjelse.
BEMÆRK: Trypsin, det mest almindelige fordøjelsesenzym i proteomics, spaltes ved C-terminalen af R og lysin (K), der genererer peptider med en ladningsfordeling, der resulterer i fragmenteringsspektre domineret af y-type ioner ved kollisionsinduceret dissociation (CID). LysargiNase spalter ved N-terminalen af R og K, hvilket afspejler Trypsin-spaltningsspecificiteten og genererer peptider, der hovedsageligt frigiver b-type ioner ved CID-fragmentering. Denne kombinerede analyse fører til meget øget peptidsekvensdækning og større tillid til stedsspecifik identifikation af R-methyleringer18.
3. Peptidrensning (vejledende tid kræves 1 time)
- Hold en aliquot af fordøjede peptider fra begge reaktioner, og opsamling de samme mængder som i punkt 2.3 til sammenligning på SDS-PAGE Coomassie-farvet gel for at vurdere proteasefordøjelseseffektiviteten (se punkt 4).
- Stop fordøjelsen ved at syrne prøverne med tilsætning af trifluoreddikesyre (TFA) til en endelig koncentration på 5%. Bland godt og mål prøvernes pH med et lakmuspapir (pH skal være omkring 3). Hvirvel kort og spin ned de forsurede prøver, før de overføres til nye 15 ml rør.
- Prøverne renses gennem to C18 vac-patroner (sorbentvægt 1 g, se Materialetabel), den ene til prøven fordøjet med Trypsin og den anden til prøven fordøjet med LysargiNase. Forbered opløsningsmiddel A, opløsningsmiddel B og vaskebuffer (se tabel 1 for buffersammensætning).
- Brug glaspipetter til at rehydrere hver patron med 6 ml ACN 100% i 3 gange. Derefter ækvilibreres hver patron sekventielt med 3-9-18 ml opløsningsmiddel A. Indlæs prøverne (harpikserne skal blive gule). Vask igen sekventielt med 3-9-18 ml opløsningsmiddel A, og tilsæt derefter 6 ml vaskebuffer. Hver kolonne overføres til rene 15 ml rør, og prøverne elueres med 7 ml opløsningsmiddel B. Elueringstrinnet gentages med 7 ml opløsningsmiddel B for et endeligt volumen på 14 ml.
BEMÆRK: Udfør alle disse trin ved at lade buffere og opløsning passere gennem kolonnerne efter tyngdekraften. For at favorisere strømmen af buffere gennem søjlen skal du skubbe hver opløsning langsomt med en sprøjte for at efterligne vakuum. - Der gemmes 50 μL eluerede peptider, 50 μL gennemstrømning (FT), 50 μL vask med opløsningsmiddel A og 50 μL af den sidste vask til SDS-PAGES efterfølgende peptidvurdering (se punkt 4).
4. Coomassie-farvet SDS-PAGE gel (vejledende tid kræves 2 timer)
- Kør de indsamlede aliquoter på en 17,5% SDS-PAGE gel og plet med Instant-Blu Coomassie farvning (se Materialetabel). Det forventede resultat fremgår af figur 2A.
5. Peptidlyofilisering (vejledende tid 2 dage)
- Dæk de 15 ml rør, der indeholder de eluerede peptider, med paraffinfilm, som derefter stanses med en 20 G nål for at skabe 3-5 huller. Sæt rørene i tøris i mindst 30 min, indtil prøverne er helt frosne.
- Lyofiliser de frosne fraktioner i 48 timer, et tidsinterval, der typisk er tilstrækkeligt til at sikre en fuldstændig lyofilisering af prøverne, selvom der kan forekomme en vis variation på grund af frysetørrerens ydeevne.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her og opbevare de frysetørrede prøver ved -80 °C.
6. Off-line HpH-RP kromatografisk fraktionering af peptider (vejledende tid 4 dage)
- For at fraktionere peptiderne i 60 fraktioner skal du bruge HpH-RP-væskekromatografi ved hjælp af HPLC-system udstyret med C12-RP HPLC-søjle (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
- Før kørslen skal du forberede frisk buffer A og buffer B (sammensætningen af bufferne er beskrevet i tabel 1).
- Filtrer al opløsning med 0,22 μm filter og afgass i et sonikatorbad i mindst 30 min.
- Opløs de frysetørrede peptider i 1 ml buffer A. Filtrer peptiderne gennem et polytetrafluorethylen (PTFE) 0,45 μm filter ved hjælp af en sprøjte.
- Indstil fraktioneringshastigheden ved 1 ml / min flow og opsaml 1 ml fraktioner ved hjælp af følgende kromatografiske gradient: 5% B til 30% B på 60 min; 30% B til 60% på 2 min; 70% B i 3 min.
- Indstil HPLC'en, så fraktionsopsamlingen på dette tidspunkt stoppes, og gradienten holdes ved 70% buffer B i 5 minutter før en omfattende vask af søjlen med en hurtig gradient op til 100% buffer B efterfulgt af en endelig vask (100% buffer B i 10 min).
BEMÆRK: I slutningen af hver kromatografisk kørsel skal kolonnen altid balanceres med 100% buffer A i 20 minutter. - Begge prøver, der fordøjes separat, med Trypsin og LysargiNase fraktioneres af off-line HpH RP-kromatografiske gradienter som beskrevet i punkt 6.5.
- For hver kromatografisk gradient samles alle fraktionerne i en dyb 96 brøndplade.
- Saml de fraktioner, der er indsamlet før gradienten, i en enkelt brøk ved navn PRE. De 60 fraktioner fra HpH-RP-væskekromatografisk (LC) gradient sammenkædes ved at samle dem på en ikke-sammenhængende måde i 14 endelige fraktioner. For at opnå en sådan ikke-sammenhængende sammenkædning skal du samle HpH-RP-fraktionerne i henhold til følgende skema.
- Brøk 1 (slutbind 5 ml): Pulje 1-15-29-43-57
- Brøkdel 2 (slutvolumen 5 ml): Pulje 2-16-30-44-58
- Brøkdel 3 (slutbind 5 ml): Pulje 3-17-31-45-59
- Fraktion 4 (slutvolumen 5 ml): Pulje 4-18-32-46-60
- Brøk 5 (sidste volumen 4 ml): Pulje 5-19-33-47
- Fraktion 6 (sidste bind 4 ml): Pulje 6-20-34-48
- Brøk 7 (sidste bind 4 ml): Pulje 7-21-35-49
- Fraktion 8 (sidste volumen 4 ml): Pulje 8-22-36-50
- Brøkdel 9 (sidste bind 4 ml): Pulje 9-23-37-51
- Fraktion 10 (sidste volumen 4 ml): Pulje 10-24-38-52
- Fraktion 11 (sidste bind 4 ml): Pulje 11-25-39-53
- Fraktion 12 (sidste volumen 4 ml): Pulje 12-26-40-54
- Fraktion 13 (sidste volumen 4 ml): Pulje 13-27-41-55
- Fraktion 14 (sidste volumen 4 ml): Pulje 14-28-42-56
BEMÆRK: Den ikke-sammenhængende sammenkædning består i at kombinere tidlige, midterste og sene elueringsfraktioner, hvilket gør det muligt at øge heterogeniteten i peptidsammensætningen inden for de samlede fraktioner. Følgelig adskilles peptidblandingen af hver poolet fraktion effektivt med begrænset co-elution i den efterfølgende nano-flow lav pH-RP-LC-kromatografi direkte koblet til massespektrometeret.
- Saml de fraktioner, der er indsamlet efter gradienten, i en unik brøk, der hedder POST.
BEMÆRK: Ved at inkludere fraktionerne PRE og POST-gradient opnås i alt 16 fraktioner i 15 ml rør (se figur 3A). - Dæk 15 ml rørene med paraffinfilm og stans det med en 20 G nål for at generere 3-5 huller. Frys dem ved at inkubere centrifugerørene i tøris, indtil hver fraktion er helt frossen.
- Lyofiliser fraktionerne i ca. 48 timer. Sørg for, at hver prøve er helt tørret, før frysetørreren stoppes.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her og opbevare de frysetørrede prøver ved -80 °C.
7. R-methyleret peptid immun-affinitetsberigelse (vejledende tid 2 dage)
- Udfør den sekventielle immuno-affinitetsberigelse af modificeret peptid med anti-pan-R-methyleringsantistoffer parallelt, men separat for de to prøver fra henholdsvis Trypsin- og LysargiNase-fordøjelser. Immuno-Affinity Purification (IAP) Buffer leveres af virksomheden, der køber anti-pan-R-methylantistoffer til modificeret peptidaffinitetsberigelse (detaljer findes i tabelmateriale og reagenser). IAP-bufferen koncentreres 10x og skal fortyndes 10 gange før brug.
BEMÆRK: IAP Buffer 1x kan opbevares ved -20 °C til op til 1 år. - Centrifuge de frysetørrede peptider ved 2.000 x g i 5 minutter ved RT for at dreje peptiderne ned til bunden af 15 ml røret. Suspender de frysetørrede peptider igen med 250 μL 1x IAP-buffer pr. 15 ml rør og overføres i et 1,5 ml lavbindende rør. Kontroller ved hjælp af lakmuspapir, om pH er >6.
- Opbevar en lille aliquot (ca. 5% af volumenet) af hver fraktion som input til den efterfølgende MS-analyse.
- Hver fraktion opdeles i to aliquoter for at udføre immunberigelsen af asymmetrisk di-methylerede (ADMA) og symmetrisk di-methylerede (SDMA) peptider parallelt.
- Brug tre hætteglas med de udvalgte anti-pan-R-methylerede antistoffer konjugeret til protein A agaroseperler pr. 10 mg af det oprindelige proteinekstrakt.
- Forbered den korrekte mængde antistof konjugeret til agaroseperler ved at centrifugere hvert hætteglas ved 2.000 x g i 30 s og fjerne bufferen fra perlerne. Vask perlerne tre gange med 1 ml 1x PBS altid ved at centrifugere dem ved 2.000 x g i 30 s.
- Efter den sidste vask suspenderes perlerne igen i 40 μL 1x PBS for hvert hætteglas; saml dem og del dem til sidst ligeligt i 16 fraktioner (således at der tilsættes 2,5 μL antistofperler til hver fraktion).
- Der tilsættes 250 μL 1x IAP-buffer til hvert rør, blandes ved at invertere og lade det inkubere på et roterende hjul i 2 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: Bland prøverne ved at vende 1,5 ml rørene i stedet for ved at pipettere dem med mikrospidser, hvilket kan beskadige perlerne eller resultere i at miste dem. - Ved 2 timers inkubation centrifugeres de 1,5 ml rør, der indeholder peptider og pan-R-methyl-antistofkonjugerede perler, ved 2.000 x g i 30 s for at pelletere perlerne; overfør FT fra hver fraktion til rene 1,5 ml lavbindende rør.
- Tilsæt perlerne konjugeret til antistoffer mod R-mono-methylering (MMA) til FT'erne og gentag trinene 7.7 til 7.9.
- Under inkubationen af peptidprøverne med MMA-perlerne vaskes to gange de fraktioner, der tidligere var immunudfældet med anti-ADMA og SDMA med 250 μL IAP Buffer (inverterende og ikke pipetting), og supernatanten kasseres ved hver vask.
- Gentag vasken med LC-MS klasse H2O tre gange.
- Elute de affinitetsberigede symmetrisk og asymmetrisk R-di-methylerede peptider fra agaroseperlerne ved at tilsætte 50 μL 0,15% TFA til hvert rør (stærke syreforhold denaturerer faktisk epitopen, der fører til frigivelse af antigenerne fra antistofferne). Lad denne opløsning stå 10 minutter ved RT, og vend rørene hvert 2.-3. minut.
- Overfør den første elution til rene 1,5 ml lavbindende rør, og gentag elutionen med 50 μL 0,15% TFA; Saml de 2 fraktioner i et rør.
- Gentag trin fra 7.11 til 7.14 for de R-mono-methylerede peptider, der blev inkuberet med anti-MMA-antistofperlerne.
8. Afsaltning og koncentration af affinitetsberigede methylpeptider med C18-mikrokolonner (vejledende tid krævede 30 minutter)
- Ækvilibrer med methanol C18-RP-mikrokolonnerne fremstillet med 3M fastfaseekstraktionspatroner til peptidafsaltning og koncentration inden MS-analyse19.
- Prøverne (svarende til de separate immunaffinitetsberigede fraktioner og inputfraktioner) indlæses på C18-mikrokolonnerne i to trin (50 μL + 50 μL på hver C18-mikrokolonne) ved centrifugering ved 600 x g i 6 min.
- Mikrokolonnerne vaskes med 55 μL buffer A (se tabel 1 for buffersammensætning), altid ved centrifugering ved ca. 900 x g i 5 min.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her, så C18-RP-mikrokolonnerne forbliver ved 4 °C, hvor de kan opbevares i op til 2 uger.
9. Anden enzymatisk fordøjelse (vejledende tid kræves 3 timer)
- C18-RP-mikrokolonnerne vaskes med 55 μL buffer A (se tabel 1 for buffersammensætning) i to gange ved centrifugering ved ca. 850 x g i 5 min.
- Peptiderne udjævnes to gange med 20 μL buffer B (se tabel 1 for buffersammensætning), og de to fraktioner samles i puljen.
- Tør de eluerede peptider i en vakuumkoncentrator (se tabelmateriale og reagenser for detaljer). I mellemtiden fremstilles fordøjelsesopløsningen, der består af 50 mM ammoniumbicarbonat, der fortyndes fra en frisklavet 1 M stamopløsning (se tabel 1).
- Trypsin eller LysargiNase tilsættes til de respektive prøver til en slutkoncentration på 25 ng/μL. Hver prøve inkuberes ved 37 °C i 2 timer.
- Tilsæt 1 μL 5% TFA for at stoppe fordøjelsen; hvirvel og spin ned prøverne.
BEMÆRK: Enzymatisk spaltning af Trypsin kan hæmmes ved C-terminalen af methyleret R og K, hvilket forårsager ubesvarede spaltninger, der øger peptidlængden og ladningen, hvilket igen producerer komplekse og ufuldstændige fragmenteringsspektre, der forhindrer peptididentifikation og stedsspecifik tilskrivning af methyleringssteder. Det har vist sig, at en anden enzymatisk fordøjelse kan reducere hyppigheden af sådanne ubesvarede spaltninger med forbedret sekvensdækning og stedtilskrivning20.
10. Afsaltning af peptider (vejledende tid krævede 30 minutter)
- De forsurede peptidopløsninger indlæses i nye C18-RP-mikrokolonner, der tidligere er blevet ligestillet efter de samme trin, som er beskrevet i punkt 8.
- Peptidet på C18-RP-mikrokolonnerne kan opbevares ved 4 °C indtil eluering til LC-MS/MS-analyse.
11. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) analyse (vejledende tid 5 dage)
- Elute peptiderne fra C18-RP-mikrokolonnerne ved at passere 10 μL buffer B, centrifugere ved 615 x g i 5 minutter ved RT. Gentag dette trin to gange og kombiner eluitterne.
- Reducer mængden af eluater i en vakuumkoncentrator, indtil de er næsten tørre, og undgå overtørring.
- Peptiderne suspenderes igen i 10 μL buffer A til LC-MS/MS-analyse.
- Analyser hver fraktion af R-methylpeptider ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) i et højopløsnings massespektrometer (se Materialetabel), koblet til et nano-flow ultra-højtydende væskekromatografi (UHPLC) system. Instrumentparametrene indstilles som beskrevet i tabel 2.
- 2 μL af hver prøve indlæses på en nanoanalytisk søjle (let sprøjtekolonne 75 μm indvendig diameter, 25 cm længde), pakket med C18-RP-harpiks (2 μm partikelstørrelse).
- Prøver føres gennem C18 RP nanokolonnen med en strømningshastighed på 300 nL / min med følgende lineære gradient: 3% -30% B i 89 min, 30% -60% B i 5 min, 60% -95% B i 1 min og 95% B i 5 min.
- Massespektrometeret fungerer i dataafhængig erhvervelsestilstand (DDA) for automatisk at skifte mellem MS med fuld scanning og MS / MS-erhvervelse. Indstil undersøgelsen fuld scanning MS til at blive analyseret i spektrometerdetektoren med opløsning R = 70.000. De femten mest intense peptidioner isoleres sekventielt til en målværdi på 3 x 106 og fragmenteres af en relativ kollisionsenergi på 28%. Indstil de maksimalt tilladte ionakkumuleringstider til 20 ms for fulde scanninger og 50 ms for MS/MS, og fastgør målværdien for MSMS til 1 x 106. Den dynamiske udelukkelsestid er indstillet til 20 s.
12. Kørsel af MaxQuant og hmSEEKER dataanalyse
- Når LC-MS/MS-kørslerne er afsluttet, importeres MS-rådata til en peptidsøgemaskine for at identificere methylpeptiderne ved hjælp af sandsynlighedsbaseret tilgang i forhold til referencedatabasen. I denne protokol blev MaxQuant version 1.6.2.10 brugt til vores analyse. MaxQuant kræver mindst 2 GB RAM for at køre, samt nok diskplads til at gemme alle rådata og alle outputfiler.
BEMÆRK: Se den officielle dokumentation på https://www.maxquant.org for alle detaljer om installationen og hardware- og softwarekravene. - Dupliker hver rå datafil. Omdøb originalerne ved at tilføje "_light" til deres navn, og omdøb derefter kopierne ved at tilføje "_heavy".
BEMÆRK: hmSEEKER, scriptet til downstream-analyse, skelner mellem store og små bogstaver. - Start MaxQuant/Andromeda-søgning efter peptididentifikation med de indstillinger, der er angivet i tabel 3. Af de mange outputdata, der produceres af MaxQuant, kræves kun allPeptides.txt- og msms.txt-filerne (placeret i den kombinerede / txt-undermappe) til efterbehandlingstrinnet.
- Efterbehandlingen af MaxQuant-outputdata udføres af algoritmen hmSEEKER. Download hmSEEKER fra: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Scriptet er tilgængeligt som en Jupyter-notesbog skrevet i Python 3.7 og leveres med et eksempeldatasæt til testformål. For nye brugere anbefales det at downloade og installere Anaconda-platformen (https://www.anaconda.com/products/individual). Den seneste udgivelse inkluderer som standard Python 3.8, Jupyter og alle de pakker, der kræves for at køre hmSEEKER (f.eks. Scikit-learn 0.23.1).
- Opret en mappe og gem filerne allPeptides.txt og msms.txt fra MaxQuant output ind i den.
- Start Jupyter (fra kommandolinjen eller fra Anaconda-navigatoren).
- Naviger til mappen hmSEEKER, og åbn hmSEEKER.ipynb.
- I afsnittet Inputparametre i notesbogen skal du angive stierne til FASTA-databasen og til den eller de mapper, der indeholder MaxQuant-tekstfilerne.
- Kør koden inde i hver celle ved at vælge cellen og klikke på knappen Afspil oven på Jupyter-grænsefladen.
- Scriptet producerer en kommasepareret outputfil for hvert datasæt, der blev analyseret, plus en kombineret fil. Den endelige doubletsliste kan findes i filen med navnet "[date]-[time]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
(Tabel 4 indeholder en kort beskrivelse af kolonnerne i outputtabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Artiklen beskriver en arbejdsgang til højkonfidensidentifikation af global protein R-methylering, som er baseret på kombinationen af den enzymatiske fordøjelse af proteinekstraktet med to forskellige proteaser parallelt efterfulgt af HpH-RP væskekromatografifraktionering af proteolytiske peptider og immuno-affinitetsberigelse af R-methyl-peptider med anti-pan-R-methylantistoffer (figur 1).
Cellerne blev dyrket i nærværelse af methionin, enten naturligt (lys, L, Met-0) eller isotopisk mærket (tung, H, Met-4). Ved fuld isotopmærkning, som blev testet ved MS-analyse på en lille aliquot af Met-4-ekstrakt, blev de tunge og lette celler høstet og blandet 1: 1 L / H andel, som illustreret i figur 1A. Ved 13CD 3-methionin metabolisk mærkning tilsættes methylgrupperne til proteinets rygrad fra methyldonoren S-adenosyl-methionin (SAM) og vil være til stede i enten den lette eller den tunge isotopform21. Figur 1B beskriver argininmethyleringsreaktionen udført af familien proteinargininmethyltransferaser (PRMT'er), der katalyserer overførslen af en methylgruppe fra S-adenosylmethionin (SAM) til guanidinonitrogen af arginin. Hvis en enkelt methylgruppe placeres på et af de terminale nitrogenatomer af arginin, opnås monomethyleret arginin (MMA). Hvis to methylgrupper tilsættes på det samme nitrogenatom i guanidino-gruppen, genereres asymmetrisk di-methyleret arginin (ADMA), mens hvis to methylgrupper placeres på to forskellige nitrogenatomer, produceres symmetrisk di-methyleret arginin (SDMA).
Efter blanding i 1: 1-forhold lette og tunge mærkede celler blev proteiner ekstraheret og udsat for fordøjelse af Trypsin og LysargiNase parallelt. Som vist i figur 2 blev den SDS-PAGE Coomassie-farvede gel brugt til at verificere effektiv enzymatisk fordøjelse af totale proteiner i peptider (sammenlign bane I og II). Desuden blev effektiviteten af rensningstrin udført af C18 Sep-Pak-søjlen evalueret, hvilket bekræftede fraværet af peptider i gennemstrømningen af C18-søjlen (figur 2, bane III) og i den første og anden vask (henholdsvis figur 2 bane IV og V) med deres forventede tilstedeværelse i eluatet (figur 2, bane VI). Korrekt Met-4-inkorporering i den tunge kanal (figur 2B) og korrekt 1: 1 H / L-blanding (figur 2C) blev evalueret.
Figur 3 viser kromatogrammet fra off-line HpH-RP væskekromatografifraktionering af peptider og den efterfølgende ikke-sammenhængende sammenkædning af fraktioner. Peptider blev påvist ved 215 nm UV, mens ufordøjede proteiner, der potentielt var tilbage, blev evalueret med 280 nm UV. Under kromatogrammet skematiseres fraktionssammenkædningsstrategien for at reducere de 70 startfraktioner til de endelige 16, inklusive PRE- og POST-gradientfraktionerne.
Anti-pan-R-methylantistoffer blev anvendt til berigelse af R-methylpeptider. Disse antistoffer genkender de tre typer R-methylering (MMA, SDMA og ADMA), og de er kommercielt tilgængelige som direkte konjugeret til agaroseperler (se tabelmateriale og reagenser for detaljer). Tabel 1 viser alle buffere og opløsninger, der anvendes i denne protokol.
Efter erhvervelsen blev hver MS-rådata analyseret to gange med MaxQuant for at identificere lette og tunge methyleringer i forskellige søgegrupper med den begrundelse, at methylpeptider (tunge og lette) kun vil blive identificeret i en bestemt gruppe. Søgning af tunge og lette methyleringer separat forbedrer analysen ved at reducere antallet af variable modifikationer, der introduceres, og ved at reducere risikoen for falske positive blandede mærkede peptider. Når MaxQuant har tildelt methyl-sites, analyserer hmSEEKER sin outputtabel for at rekonstruere mulige par af tunge lette toppe13.
Figur 4 og 5 illustrerer hele MS-spektre af peptider FELTGIPPAPR(me) (4) og NPPGFAFVEFEDPR(me) (5), som repræsenterer henholdsvis en sand positiv og en falsk positiv methylpeptidannotering. I figur 4 er de observerede m/z-forskelle mellem de tre toppe i overensstemmelse med tilstedeværelsen af en enzymatisk methyleret rest (7.0082 Th mellem den umodificerede og lysmethylerede; 2.0102 Th mellem de lette og tunge former af methylpeptidet). De resulterende hmSILAC-dubletter har en ME på 0,40 ppm, en dRT på 0,00 min og et LogRatio på -0,41; disse værdier ligger under de standardtærskler, som hmSEEKER anvender til at skelne mellem sande og falske dubletter, som tidligere blev anslået til at være som følger: | MIG| < 2 sider/min, |dRT| < 0,5 min., og | LogRatio| < 1. I det andet tilfælde, der er illustreret i figur 5, afviger den observerede m/z-forskel mellem det letmethylerede peptid og dets formodede tunge modstykke fra den forventede værdi med 0,0312 Th (ME = -37,28 ppm). Desuden har denne dublet et LogRatio på 2,50, hvilket er uden for standard LogRatio-forudsigelsesintervallet (disse afskæringsværdier er defineret og diskuteret i13). I MS/MS-spektret resulterede sekvensen af peptidet NPPGFAFVEFEDPR(me) faktisk ikke fuldt dækket, og den tildelte R-methylering kunne også fortolkes som en methylesterificering på glutamatet eller aspartatet tæt på R.
hmSEEKER-arbejdsgangen er skematiseret i figur 6, mens tabel 4 giver en beskrivelse af outputtabellen produceret af dette værktøj for at hjælpe fortolkningen af resultaterne: peptider, der bærer flere ændringer, vises flere gange, hver post svarer til en anden methyleringshændelse på et givet peptid; endelig er topdubletterne opdelt i tre klasser: Matchede dubletter er de mest sikre, da peptidet blev fragmenteret og identificeret i både den tunge og den lette form.
Figur 1: Skema for den eksperimentelle arbejdsgang og for enzymatiske protein-R-methyleringsreaktioner. (A) Arbejdsgangsdiagram over biokemisk protokol. Celler dyrkes i let (Met-0) og tung (Met-4) methioninholdig medium i mindst 8 fordoblinger, og lette og tunge kanaler blandes 1: 1 andel. Proteiner ekstraheres og udsættes for fordøjelse med Trypsin eller LysargiNase parallelt og fraktioneres ved off-line HpH-RP væskekromatografi ved at samle 70 fraktioner, endelig kombineret til 16 fraktioner. R-methyl-peptider beriges med anti-pan-R-methylantistoffer konjugeret til agaroseperler, der gennemgik anden enzymatisk fordøjelse (henholdsvis Trypsin eller LysargiNase) og analyseres af LC-MS / MS. Rå MS-data behandles af MaxQuant-algoritme til identifikation af peptid og PTM. MaxQuant outputdata indsendes derefter til analyse af hmSEEKER bioinformatisk værktøj, udviklet internt til tung og let methylpeptidforening. (B) Ordning for R-methyleringsreaktion. Guanidino-gruppen af arginin kan modificeres ved tilsætning af en methylgruppe, der producerer monomethyleret arginin (MMA) eller ved tilsætning af to methylgrupper, der producerer enten symmetrisk (SDMA) eller asymmetrisk (ADMA) di-methyleret arginin. Reaktionen katalyseres af enzymer af familien Protein Arginin Methyltransferases (PRMT'er), der overfører disse methylgrupper fra S-Adenosyl-Methionine (SAM). Efter methylgruppeoverførslen reduceres SAM til S-adenosylhomocystein (SAH). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kontrol af protokolkritiske trin. A) SDS-PAGE Coomassie-farvet gel til evaluering af proteolytisk fordøjelseseffektivitet. MW: markører for molekylvægt. I) 20 μg totalt H/L-proteinekstrakt inden fordøjelsen kvantificeret ved BCA II) fordøjede peptider i samme forhold som i I III) gennemstrømning af C18-patron lastet i samme forhold som bane I; IV-V) første og anden vask af C18-patronen med buffer A, lastet i samme forhold som I; VI) udgår fra C18-patronen, der er ilagt i samme forhold som I. (B) Met-4 inkorporeringshastighedsanalyse. Met-4-inkorporeringen i den tunge kanal evalueres af internt udviklet script (tilgængelig på https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/); hastighed = 1 angiver fuld inkorporering (C) Gaussisk fordeling af H / L-forhold til 1: 1 blandingsvurdering. En normalfordeling af Log2 H/L-forholdet er plottet i betragtning af ±2σ. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: HpH-fraktionssammenkædningsskema og repræsentativ vurdering af berigelse af R-methylerede peptider . (A) Kromatogram med høj pH-omvendt fasefraktionering og skema for den ikke-sammenhængende fraktionssammenkædning. Kromatogrammet repræsenterer HpH-RP-separationsprofilen for peptider detekteret ved 215 nm UV (blå linje), mens tilstedeværelsen af ufordøjede proteiner blev sporet i 280 nm UV-kanalen (rød linje). Den lysegrønne linje repræsenterer koncentrationen af buffer B langs den kromatografiske kørsel. Brøkpuljeordningen rapporteres, der viser strategien for ikke-sammenhængende sammenkædning af tidlige, midterste og sene elueringsfraktioner fra 70 til 16, inklusive PRE- og POST-gradientfraktioner. (B) Repræsentativ tabel, der opsummerer berigelsen af R-methylerede peptider. Tabellen rekapitulerer det samlede antal peptider og den relative procentdel af R-methyleringsberigelse, der sammenligner hver IP på dens input. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempel på ægte hmSILAC-dublet. Massespektrum af en ægte positiv dublet. De viste toppe svarer til peptid FELTGIPPAPR i de umodificerede, lette monomethylerede (CH3) og tunge monomethylerede (13CD3) former med ladning 2+. De m / z-forskelle, der observeres mellem de tre toppe, er i overensstemmelse med tilstedeværelsen af en enzymatisk methyleret rest. Tabellen under massespektret repræsenterer hmSEEKER-output og indeholder parametrene LogRatio, ME og dRT for dubletten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksempel på falsk hmSILAC-dublet. Massespektrum af en negativ in vivo methyl-peptid tildeling. Toppene ved 811,3849 m/z og 818,3927 m/z svarer til de umodificerede og lette monomethylerede former for peptid NPPGFAFVEFEDPR med ladning 2+. Den tredje top kunne tildeles som det tunge methyl-modstykke til det lette methylerede peptid, men det observerede m/z-skift adskiller sig fra det forventede skift med 0,0312 Th, hvilket udelukker denne mulighed. Tabellen under massespektret repræsenterer hmSEEKER-output og indeholder parametrene LogRatio, ME og dRT for dubletten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Skematisk repræsentation af arbejdsgangen for dataanalyse . (A) MaxQuant registrerer MS1-toppe i rådataene. (B) Toppe med et tilknyttet MS2-spektrum behandles af databasesøgemaskinen Andromeda for at opnå en peptididentifikation. (C) hmSEEKER læser MaxQuant-peptididentifikationer og ekstraherer methylpeptider med Andromeda Score > 25, Delta Score > 12 og modifikationer med en lokaliseringssandsynlighed > 0,75. (D) For hvert methylpeptid, der passerer kvalitetsfiltreringen, finder hmSEEKER sin tilsvarende MS1-top i MaxQuant allPeptides-tabellen og søger derefter efter sin modstykke i samme tabel. (E) En dublet af toppe defineres ved forskellen i deres retentionstid (RT), deres intensitetsforhold (LogRatio) og afvigelsen mellem forventet og observeret deltamasse (ME); disse tre parametre bruges af hmSEEKER til at skelne sande positive fra falske positive, som diskuteret13. (F) Endelig udarbejder hmSEEKER lister over overflødige og ikke-overflødige dubletter; Den første inkluderer forudsigelser for alle methylpeptider, mens den anden filtreres, så når et peptid identificeres flere gange, rapporteres kun den bedste scorende dublet. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Buffer | Lydstyrke | Sammensætning |
| L-methionin (L) opløsning | 10 ml | 30 mg / ml let-methionin i ultrarent vand |
| L-methionin (H) opløsning | 10 ml | 30 mg / ml tung-methionin i ultrarent vand |
| Medium til cellekultur | 500 ml | DMEM med stabil glutamin og uden methionin, 10% (v/v) dialyseret FBS, 1% (v/v) P/S, 1:1000 (v/v) L-methioninopløsning |
| Lysis Buffer | 50 ml | 9M urinstof, 20mM HEPES pH 8,0;1% (v/v) proteasehæmmer; 1% (v/v) fosfatasehæmmer i ultrarent vand |
| Ammoniumbicarbonat (AMBIC) opløsning | 50 ml | 1M (NH4)2CO3 i ultrarent vand |
| DTT-løsning | 10 ml | 1,25 mio. DTT i ultrarent vand |
| IAA-løsning | 5 ml | 109mM i ultrarent vand |
| Opløsningsmiddel A til Sep-Pak C18 | 50 ml | 0,1% TFA i ultrarent vand |
| Opløsningsmiddel B til Sep-Pak C18 | 50 ml | 0,1 % TFA + 40 % ACN i ultrarent vand |
| Vaskeopløsning til Sep-Pak C18 | 50 ml | 0,1 % TFA + 5 % ACN i ultrarent vand |
| Buffer A til HpH-fraktionering | 500 ml | 25 mM NH4OH i ultrarent vand |
| Buffer B til HpH-fraktionering | 500 ml | 25 mM NH4OH+ 90 % ACN i ultrarent vand |
| IP-bindende buffer 1x | 5 ml | Fortynd 1:10 (V/V) i ultrarent vand fra 10x kommercielt lageropløsning til rådighed |
| IP-elueringsbuffer | 50 ml | 0,15% TFA i ultrarent vand |
| Buffer A til trin-tip | 50 ml | 0,1% TFA i ultrarent vand |
| Buffer B til trin-tip | 50 ml | 0,1 % TFA + 40 % ACN i ultrarent vand |
| Buffer C til trin-tip | 50 ml | 0,1 % TFA + 50 % ACN i ultrarent vand |
| MS opløsningsmiddel A | 250 ml | 0,1% FA i ultrarent vand |
| MS opløsningsmiddel B | 250 ml | 0,1% FA + 80% ACN i ultrarent vand |
| Protease hæmmere cocktail | 5 ml | cOmplete, EDTA-fri proteasehæmmertabletter (ROCHE) opløst i ultrarent vand i henhold til fremstillingsinstruktionen |
| Fosfatasehæmmere cocktail | 5 ml | PhosSTOP-tabletter (ROCHE) opløst i ultrarent vand i henhold til fremstillingsinstruktionen |
Tabel 1: Buffere og opløsningers sammensætning. Lister over buffere og opløsninger, der anvendes i denne protokol.
| Parametre | Værdi |
| Prøveindlæsning (uL) | 2 |
| Indlæsning flowhastighed (uL/min) | 10 |
| Gradient strømningshastighed (nL / min) | 300 |
| Lineær gradient | 3 - 30% være i 89 minutter, 30 - 60% være i 5 minutter, 60 - 95% være i 1 minut, 95% være i 5 minutter |
| Fuld scanningsopløsning | 70,000 |
| Antal mest intense ioner valgt | 15 |
| Relativ kollisionsenergi (%) (CID) | 28 |
| Dynamisk udelukkelse(r) | 20.0 |
Tabel 2: LC-MS/MS-indstilling. Parametre anvendt til LC-MS/MS-analyse af R-methylpeptider på et højopløseligt quadrupole-orbitrap massespektrometer, koblet til et nano-flow ultra-højtydende væskekromatografi (UHPLC) system.
| MQ-parametre Indstillinger (ver 1.6.2.10) | |||
| Indstilling | Handling | ||
| Konfiguration | |||
| Ændringer | Met4 | Tilføj ny ændring. Indstil Komposition til H(-3) Hx(3) Cx C(-1), og vælg M som specificitet. | |
| Methyl4 (KR) | Dupliker "Methyl (KR)", omdøb det og skift sammensætning til Cx H(-1) Hx(3) | ||
| Dimethyl4 (KR) | Dupliker "Dimethyl (KR)", omdøb det og skift sammensætning til H(-2) Hx(6) Cx(2) | ||
| Trimethyl4 (K) | Dupliker "Trimethyl (K)", omdøb det og skift sammensætning til Cx(3) H(-3) Hx(9) | ||
| OxMet4 | Dupliker "Oxidation (M)" og omdøb den. | ||
| Proteaser | Lysarginase | Tilføj ny protease. Vælg kolonnerne 'R' og 'K'. | |
| Når du opretter en ny PTM eller protease, skal du klikke på "Rediger tabel" for at ændre MaxQuant-indstillingerne og derefter "Gem ændringer" for at bekræfte ændringerne. Genstart MaxQuant, og de nye muligheder vil være synlige. | |||
| Fanen Raw-filer | |||
| Gruppen Parametre | Opdel raw-filerne i 2 grupper (0 og 1) | ||
| Gruppespecifikke parametre | |||
| Slags | Slags | Norm | |
| Mangfoldighed | 1 | ||
| Fordøjelse | Enzym | Trypsin eller Lysarginase | |
| Maks. Savnede kavalergange | Indstil til 3 | ||
| Ændringer | Variable ændringer | Gruppe 0 | Oxidation (M), methyl (KR), dimethyl (KR), trimethyl (K) |
| Gruppe 1 | OxMet4, methyl4 (KR), dimethyl4 (KR), trimethyl4 (K) | ||
| Faste ændringer | Gruppe 0 | Carbamidomethylering | |
| Gruppe 1 | Carbamidomethylering og Met4 | ||
| Globale parametre | |||
| Sekvenser | Fasta-filer | Indlæs FASTA-fil | |
| Identifikation | Psm-FDR | Indstil til 0,01 | |
| Min. Score for modificerede peptider | Indstil til 1 | ||
| Min. Delta score for modificerede peptider | Indstil til 1 | ||
| Avanceret identifikation | Anden peptidsøgning | Afkryds | |
| Tabeller | Skriv allPeptides tabel | Kontrollere | |
| Avanceret | Beregn topegenskaber | Kontrollere | |
| Hvis det ikke er angivet, skal du forlade standardparameteren. | |||
| MQ-parameterindstillinger til inkorporeringstest | |||
| Gruppespecifikke parametre | |||
| Slags | Slags | Norm | |
| Mangfoldighed | 2 | ||
| Max mærket | 5 | ||
| Tung etiket | Vælg Met4 | ||
| Fordøjelse | Enzym | Trypsin eller Lysarginase | |
| Maks. Savnede kavalergange | Indstil til 3 | ||
| Ændringer | Variable ændringer | Oxidation (M) | |
| Faste ændringer | Carbamidomethylering | ||
| Hvis det ikke er angivet, skal du forlade standardparameteren. | |||
Tabel 3: MaxQuant-behandlingsparametre. Gruppespecifikke og globale parametre tilpasset det specifikke eksperiment, der er beskrevet, er angivet. Alle andre parametre er indstillet som standard, afhængigt af den anvendte programversion.
| Kolonnenavn | Beskrivelse: __________ |
| Rawfile | Rå datafil, hvor dubletten blev identificeret |
| H-scanning | Scanningsnummer på den tunge modstykke |
| L-Scanning | Scanningsnummer på lysmodstykket |
| .CLASS | Kan have 3 værdier: |
| Matched = Tunge og lette peptider identificeres med samme sekvens | |
| Mismatched = Tunge og lette peptider har samme aa-sekvens, men der er en uoverensstemmelse i lokaliseringen af det methylerede sted | |
| Reddet = Kun et peptid i dubletten er identificeret; dens modstykke er en uidentificeret top. | |
| PEPTID | Peptid sekvens |
| SCORE | Peptid Andromeda score |
| RES | Modificeret restkoncentration |
| POS | Den modificerede restkoncentrations placering |
| MOD | Modificering |
| BLYPROTEIN | Protein peptidet tilhører |
| GEN | Gennavn svarende til proteinet |
| PROBABILITY_TRUE | Sandsynligheden for, at dubletten er en ægte hmSILAC-dublet, beregnet ved hjælp af den logistiske regressionsmodel |
| PROGNOSE | 1 hvis dubletten er formodet sand, 0 hvis den er falsk |
| H/L LOGRATIO | Log2 af forholdet mellem tung og let intensitet |
| MIG | Afvigelse mellem forventet og observeret masseforskel |
| DRT | Forskel i opbevaringstid |
Tabel 4: beskrivelse af hmSEEKER-outputresultater. Liste over kolonneposterne i hmSEEKER-outputtabellen med en kort beskrivelse af deres indhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den høje konfidensidentifikation af in vivo-protein /peptidmethylering ved global MS-baseret proteomics er udfordrende på grund af risikoen for høj FDR med flere aminosyresubstitutioner og methylesterificering, der forekommer under prøveforberedelse, der er isobariske til methylering og kan forårsage forkerte opgaver i fravær af ortogonale MS-valideringsstrategier. Den substoichiometriske karakter af denne PTM komplicerer yderligere opgaven med global methyl-proteomics, men kan overvindes med selektiv berigelse af modificerede peptider10.
Her præsenteres en biokemisk og analytisk arbejdsgang, som er designet til at øge effektiviteten og pålideligheden af global MS-analyse af R-methylpeptider gennem anvendelse af hmSILAC-strategi koblet til HpH-RP-kromatografipeptidfraktionering og affinitetsberigelse med anti-pan-R-methyl-peptider antistofsæt. Den førstnævnte strategi tillader ortogonal validering af methylpeptider og reducerer i høj grad identifikationens FDR, mens sidstnævnte protokol øger deres detekterbarhed fra baggrunden af umodificerede peptider22. En begrænsning af denne protokol er imidlertid kravet om meget stor mængde startproteinekstrakt (i området 20-40 mg) som input til den efterfølgende peptidfraktionering og affinitetsberigelse, hvilket begrænser anvendelsen af metoden til udødeliggjorte, hurtigt voksende cellelinjer, som kan udvides i vid udstrækning. I stedet gælder den nuværende opsætning ikke for patientafledte primære celler eller væv. Fremtidige undersøgelser bør rettes mod at forbedre protokollen i denne retning: Yderligere strategier for biokemisk berigelse af methyleret peptid frem for umodificerede kan gøre det muligt at omgå brugen af antistoffer, hvilket gør det muligt at nedskalere forsøgene. En anden interessant udvikling kunne være repræsenteret ved kombinationen af de nuværende metoder med kemisk modifikation af proteolytiske peptider med isobariske eller tandemmassemærker med to gange potentielle fordele: på den ene side muligheden for at kombinere flere betingelser i et enkelt eksperiment og dermed multiplexere den relative kvantificering af methylproteomiske ændringer ved forskellige forstyrrelser; På den anden side kan sammenlægning af forskellige prøver i én forud for kromatografisk fraktionering og berigelse af affinitet gøre det muligt at reducere omfanget af individuelle forsøg.
Denne protokol er afhængig af to separate fordøjelser af hele celleekstraktet parallelt med Trypsin og LysargiNase. Trypsin spalter peptidbindingen ved C-terminalsiden af K- og R-rester og genererer peptider, der præsenterer en positivt ladet rest ved C-terminalen, ud over den N-terminale positive ladning fra α-amin23. LysargiNase-enzymet hydrolyserer selektivt peptidyl-K- og -R-bindinger og genererer peptider, der bærer en K eller R på N-terminalstedet, som kan omfatte K-methylerede former. Brugen af begge proteaser øger den samlede proteomdækning i storskala MS-analyse, hvilket fører til identifikation af peptider, der til sidst savnes ved en enkelt tryptisk fordøjelse18. Den dobbelte enzymatiske fordøjelse udføres i stedet for at reducere antallet af mulige savnede enzymatiske spaltninger. Faktisk reducerer methylering af K og R stærkt effektiviteten af proteinspaltning ved trypsin. På trods af denne forholdsregel er det stadig almindeligt, at methylerede peptider er længere og indeholder ubesvarede spaltninger, hvilket fører til dårlig CID-fragmentering.
Brugen af en anden type fragmentering, såsom Electron Transfer Dissociation (ETD), kunne løse dette problem. Faktisk fragmenterer ETD normalt ikke dobbeltladede peptidioner effektivt som CID gør, men det giver ret ensartet spaltning af peptidprækursorer med højere ladningstilstande (≥3). Dette kan være en fordel i tilfælde af R-methylering, da det ofte forekommer i argininrige domæner, der indeholder flere og tilstødende R-rester. ETD har imidlertid en lavere scanningshastighed end CID, så det samlede antal peptididentifikationer reduceres24,25,26.
For nylig er flere protokoller, der involverer berigelse af posttranslationelt modificerede peptider, blevet kombineret med forskellige kromatografiseparationsstrategier, der hjælper med at reducere peptidblandingens kompleksitet og dermed øge den samlede effektivitet af modificeret peptiddetektion i MS. Her anvendes HpH-RP kromatografisk fraktionering kombineret med ikke-sammenhængende sammenkædning af fraktionerne. Off-line peptidfraktionering baseret på en høj pH-omvendt fasekromatografi viser en høj opløsningseffektseparation, der er ortogonal til den online lave pH RP-adskillelse, der udføres nedstrøms under LC-MS / MS-kørslen27. Desuden har den ikke-sammenhængende sammenkædningsstrategi to hovedfordele: For det første øger den proteindækningen ved at samle tidlige, midterste og sene elueringsfraktioner i individuelle sammenkædede fraktioner, hvilket bevarer heterogeniteten af peptidblanding. For det andet reducerer sammenkædningen den efterfølgende MS-kørselstidsanalyse ved at erhverve et lavere antal prøvefraktioner28.
På grund af R-methyleringens substoichiometriske karakter er det nødvendigt med et berigelsestrin for at lette påvisning af methylpeptider i global MS-analyse af modifikationsproteomer. I denne protokol beriges methylpeptiderne med immuno-affinitetsudfældning (IAP) ved anvendelse af antistofferne anti-SDMA og anti-ADMA parallelt, mens immunoudfældning af mono-methylpeptider ved anvendelse af anti-MMA-antistof udføres på FT'erne fra de tidligere IAP-eksperimenter. Denne rækkefølge afspejler den forskellige effektivitet af disse antistoffer: anti-SDMA og anti-ADMA antistoffer har lavere bindingseffektivitet sammenlignet med anti-MMA antistof. Bemærkelsesværdigt kan denne forskellige effektivitet også forårsage forstyrrelser i repræsentationen af de forskellige grader af R-methyleringer i modifikationsproteomer eksperimentelt kommenteret29.
Før den kommercielle tilgængelighed af anti-pan-R-methyleringsantistoffer blev andre separationsstrategier anvendt til at øge R-methyleret peptiddetektion ved MS, såsom stærk kationudveksling (SCX) og hydrofil interaktion (HILIC) kromatografi. På trods af at disse teknikker kunne reducere kompleksiteten af peptidblandingen analyseret i MS, forbedrede de ikke signifikant identifikationen af methylpeptider30,31,32,33.
På trods af alle disse tekniske og analytiske løsninger, der sigter mod at øge methylpeptidseparationen, detektionen, fragmenteringen og sekvensannotationen, er methylproteomdækningen stadig begrænset og forudindtaget mod de mere rigelige methylerede proteiner, såsom ribonukleoprotein, RNA-bindende helicaser, mens flere kendte lavabundant modificerede proteiner (f.eks. TP53BP1, CHTF8, MCM2) kun detekteres serendipitøst og ikke pålideligt over flere globale eksperimenter34 . Subcellulær fraktionering anvendt før den nuværende arbejdsgang kunne forbedre detektionen af sådanne proteiner; Den nuværende krævede eksperimentelle skala gør imidlertid ikke dette til et levedygtigt alternativ.
Ved MS analyseres rådata gennem MaxQuant-algoritmen til peptid- og PTM-identifikation. Analysen af data fra hmSILAC-eksperimenter er dog ikke ligetil med standard søgealgoritmer. For eksempel, mens MaxQuant effektivt kan analysere standard SILAC-eksperimenter baseret på den metaboliske mærkning med isotopisk kodet K og R, fungerer det ikke effektivt, når isotopmærkningen er kodet til en variabel PTM, som i tilfælde af tung methylmærkning, der fører til kraftig methylering. Derfor består den strategi, der er vedtaget her, i først at analysere hmSILAC-dataene med MaxQuant uden at bruge dens indbyggede dubletsøgningsfunktionalitet, så de lette og tunge peptider kan identificeres uafhængigt; Derefter matches de med en efterbehandlingssoftware. Denne bioinformatiske arbejdsgang har også sine egne faldgruber, da man skal specificere methyleringer i både tunge og lette former i panelet Variable Modifikationer i MaxQuant, hvilket ender med i alt otte variable modifikationer, når methioninoxidation (tung og let) også er inkluderet. At søge for mange PTM'er med en databasesøgemaskine som MaxQuant / Andromeda er upraktisk, fordi det fører til en eksponentiel stigning i de teoretiske peptider, algoritmen skal teste: vores løsning var at analysere hver MS rådata to gange med forskellige sæt variable PTM'er (gennem parametergruppefunktionen i MaxQuant). Efter peptidsøgning anvendes det internt udviklede værktøj hmSEEKER til at understøtte tildelingen af tunge lette peptidpar fra outputtabellerne produceret af MaxQuant. Den første udgivelse af hmSEEKER-algoritmen er for nylig blevet offentliggjort13, hvor det blev vist, at hmSEEKER kan identificere hmSILAC-dubletter med FDR < 1%. Falske positiver kan stadig opstå fra par af toppe, der tilfældigt har en masseforskel multipel på 4,02 Da, men dette er meget usandsynligt for dubletterne klassificeret som matchede eller uoverensstemmende, i lyset af følgende fakta: for at en matchet eller mismatchet dublet skal være falsk, skal Andromeda forkert bestemme sekvensen af både den tunge og den lette modstykke. Forudsat at søgemaskinen er blevet kørt med sine standardparametre, har hver identifikation en 1% sandsynlighed for at være forkert. Således er sandsynligheden for, at hmSILAC-modstykket også er forkert, 0,01%.
En faldgrube ved hmSILAC er, at peptider indeholdende methionin i deres rygrad også genererer dubletter, der ikke kan skelnes fra dem, der genereres af methylpeptider. Ikke desto mindre bør dette ud fra vores erfaring ikke udgøre et stort problem, for det første fordi peptider uden methyleringer simpelthen kan kasseres fra MaxQuant-outputtet, og for det andet fordi hmSEEKER automatisk tager højde for enhver methioninrest i et methylpeptid ved beregning af den forventede masseforskel; Endelig er denne risiko også udelukket ved, at de tunge og lette modifikationer søges i separate parametergrupper, således at søgemaskinen ikke kan opdele en tung monomethylering (+18,03 Da) i en let monomethylering plus en tung methionin (14,01 + 4,02 Da).
En mere formel og eksperimentel løsning på dette problem blev foreslået af Oreste Acuto og hans samarbejdspartnere, der udviklede en variant af hmSILAC, kaldet isomethioninmethyl-SILAC (iMethyl-SILAC)22. I denne alternative metaboliske mærkningsprotokol erstattes naturligt lys methionin med [13 C 4]-methionin, som har samme masse som [13CD3]-methionin (Met-4), men det producerer ikke stabile isotopkodede methylgrupper på grund af den forskellige fordeling af de tunge isotoper inden for molekylærmærket. I iMethyl-SILAC-eksperimenter genererer umodificerede methioninholdige peptider således ikke dubletter. Det skal dog bemærkes, at når Acuto og kolleger sammenlignede ydeevnen af iMethyl-SILAC og traditionel hmSILAC, viste de to metoder stadig meget ens FDR'er.
En mulig begrænsning af hmSEEKER er, at den er designet til at arbejde direkte på MaxQuant-outputtabeller, så dens kildekode ikke er kompatibel med andre søgemaskiner, hvis outputfiler er struktureret forskelligt; i denne forstand giver MethylQuant35 et godt alternativt bioinformatisk værktøj, der er skræddersyet ad hoc til direkte analyse af MS-rådata fra hmSILAC-type eksperimenter og er mere fleksibel med hensyn til de leverede inputfiler. En maskinlæringsmodel er under udvikling for at skelne mellem sande og falske methylpeptid H / L-dubletter uden at stole på brugerdefinerede tærskler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
MM og EM er ph.d.-studerende inden for European School of Molecular Medicine (SEMM). EM er modtager af et 3-årigt FIRC-AIRC-stipendium (projektkode: 22506). Globale analyser af R-methylproteomer i TB-gruppen understøttes af AIRC IG Grant (projektkode: 21834).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al.
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
