Controle van celgeometrie door infrarood laserondersteunde micropatterning
Summary
Het hier gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde fabricage van micropatterns mogelijk die de celvorm standaardiseert om cytoskeletstructuren in zoogdiercellen te bestuderen. Deze gebruiksvriendelijke techniek kan worden opgezet met in de handel verkrijgbaar beeldvormingssystemen en vereist geen gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk is voor standaard celbiologielaboratoria.
Abstract
Micropatterning is een gevestigde techniek in de celbiologiegemeenschap die wordt gebruikt om verbanden tussen de morfologie en de functie van cellulaire compartimenten te bestuderen en tegelijkertijd complicaties als gevolg van natuurlijke cel-tot-celvariaties te omzeilen. Om de celvorm te standaardiseren, worden cellen ofwel opgesloten in 3D-mallen of gecontroleerd voor lijmgeometrie via kleefeilanden. Traditionele micropatterningtechnieken op basis van fotolithografie en diepe UV-etsen zijn echter sterk afhankelijk van cleanrooms of gespecialiseerde apparatuur. Hier presenteren we een infrarood laser assisted micropatterning techniek (microphotopatterning) aangepast van Doyle et al. die gemakkelijk kan worden opgezet met commercieel beschikbare beeldvormingssystemen. In dit protocol gebruiken we een Nikon A1R MP+ beeldvormingssysteem om micropatterns met micronprecisie te genereren via een infrarood (IR) laser die vooraf ingestelde gebieden op poly-vinyl alcohol gecoate coverslips in brand slaagt. We gebruiken een aangepast script om geautomatiseerde patroonfabricage met hoge efficiëntie en nauwkeurigheid mogelijk te maken in systemen die niet zijn uitgerust met een hardware autofocus. We laten zien dat dit IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol resulteert in gedefinieerde patronen waaraan cellen zich uitsluitend hechten en de gewenste vorm aannemen. Bovendien kunnen gegevens van een groot aantal cellen worden gemiddeld vanwege de standaardisatie van de celvorm. Patronen gegenereerd met dit protocol, gecombineerd met hoge resolutie beeldvorming en kwantitatieve analyse, kunnen worden gebruikt voor schermen met een relatief hoge doorvoersnelheid om moleculaire spelers te identificeren die de link tussen vorm en functie bemiddelen.
Introduction
Celvorm is een belangrijke determinant van fundamentele biologische processen zoals weefselmorfogenese1, celmigratie2, celproliferatie3en genexpressie4. Veranderingen in celvorm worden gedreven door een ingewikkelde balans tussen dynamische herschikkingen van het cytoskelet dat het plasmamembraan vervormt en extrinsieke factoren zoals externe krachten die op de cel worden uitgeoefend en de geometrie van celcel- en celmatrixadhesie5. Migrerende mesenchymale cellen polymeriseren bijvoorbeeld een dicht actinenetwerk aan de voorrand dat het plasmamembraan naar voren duwt en een brede lamellipodia6creëert , terwijl actomyosinecontractiliteit de smalle achterrand van de cel intrekt om de cel los te maken van zijn huidige positie7,8. Verstoren van signaleringsgebeurtenissen die aanleiding geven tot dergelijke gespecialiseerde cytoskeletstructuren verstoren vorm en polariteit en vertragen celmigratie9. Bovendien vereist epitheelbladbuiging tijdens gastrulatie op actomyosine gebaseerde apicale vernauwing die ervoor zorgt dat cellen en hun buren wigvormig worden10. Hoewel deze studies het belang van celvorm benadrukken, heeft de inherente heterogeniteit in celvorm de inspanningen bezwaard om mechanismen te identificeren die morfologie verbinden met functie.
Hiertoe zijn in de afgelopen drie decennia talrijke benaderingen ontwikkeld om de celvorm te manipuleren. Deze benaderingen bereiken hun doel door ofwel de cel te beperken met een driedimensionale mal of de cellulaire adhesiegeometrie te controleren door patroondepositie van extracellulaire matrix (ECM) eiwitten op een antifouling oppervlak, een techniek die micropatterning11wordt genoemd . Hier zullen we een aantal technieken bekijken die door de jaren heen aan populariteit hebben gewonnen.
Oorspronkelijk geïntroduceerd als een benadering voor micro-elektronische toepassingen, is op zachte lithografie gebaseerde microcontactdruk ondubbelzinnig een cultfavoriet geworden12. Een master wafer wordt eerst vervaardigd door gebieden van een met fotoresistent bedekt siliciumsubstraat selectief bloot te stellen aan fotoirradiatie, waardoor een patroonoppervlak achterblijft13. Een elastomeer, zoals PDMS, wordt vervolgens op de hoofdwafel gegoten om een zachte “stempel” te genereren die ECM-eiwitten overbrengt naar een gewenst substraat11,14. Eenmaal vervaardigd, kan een master wafer worden gebruikt om veel PDMS-stempels te gieten die aanleiding geven tot zeer reproduceerbare micropatterns12. De patronen kunnen echter niet gemakkelijk worden aangepast vanwege het lange fotolithografieproces. Dit proces vereist ook zeer gespecialiseerde apparatuur en cleanrooms die meestal niet beschikbaar zijn op biologieafdelingen.
Meer recentelijk is gemeld dat direct printen met diepe UV beperkingen van traditionele lithografie-gebaseerde benaderingen omzeilt. Diep UV-licht wordt door een fotomasker geleid naar selectieve delen van een glazen hoes bedekt met poly-L-lysine-geënt-polyethyleenglycol. Chemische groepen die aan diepe UV worden blootgesteld, worden gefotoconverteerd zonder het gebruik van lichtgevoelige linkers om binding van ECM-eiwitten mogelijk te maken15. Het ontbreken van lichtgevoelige linkers maakt het mogelijk patroonafdekkingslips gedurende meer dan zeven maanden stabiel te houden bijkamertemperatuur 15. Deze methode vermijdt het gebruik van cleanrooms en fotolithografieapparatuur en vereist minder gespecialiseerde training. De eis voor fotomaskers vormt echter nog steeds een aanzienlijke hindernis voor experimenten die direct beschikbare veranderingen in patronen vereisen.
Naast methoden die celgeometrie manipuleren door gecontroleerde afzetting van ECM-eiwitten op een 2D-oppervlak, proberen anderen de celvorm te controleren door cellen in 3D-microstructuren te beperken. Veel studies hebben de hierboven beschreven zachte lithografie-gebaseerde benadering aangepast om 3D- in plaats van 2D PDMS-kamers te genereren om vormafhankelijke biologische processen in embryo’s, bacteriën, gist en planten te onderzoeken16,17,18,19. Twee-foton polymerisatie (2PP) heeft ook het voortouw genomen als een microfabrication techniek die complexe 3D hydrogel steigers met nanometer resolutie20kan creëren. 2PP baseert zich op de principes van adsorptie met twee fotonen, waarbij twee fotonen die in femtoseconde pulsen worden geleverd tegelijkertijd worden geabsorbeerd door een molecuul – in dit geval foto-initiator – dat lokale polymerisatie van fotopolymeren mogelijk maakt21. Deze techniek is zwaar gebruikt om 3D-steigers te printen die de inheemse ECM-structuren van menselijk weefsel nabootsen en waarvan is aangetoond dat ze lage fotochemische schade aan cellenveroorzaken 22.
Het debuut van microphotopatterning 10 jaar geleden gaf onderzoekers de mogelijkheid om micropatterns te fabriceren terwijl ontoegankelijke en gespecialiseerde apparatuur werd vermeden. Microfotopatterning creëert patronen op micronschaal door selectieve gebieden van poly-vinylalcohol (PVA) die op geactiveerde glasoppervlakken zijn gecoat thermisch te verwijderen met behulp van een infraroodlaser23,24. ECM-eiwitten die alleen het onderliggende glasoppervlak hechten en niet PVA dienen dan als biochemische signalen om gecontroleerde verspreidingsdynamiek en celvorm mogelijk te maken. Deze methode biedt ook superieure flexibiliteit omdat patronen gemakkelijk in realtime kunnen worden gewijzigd. Hier bieden we een stapsgewijs protocol van microfotopatterning met behulp van een commercieel multi-foton beeldvormingssysteem. Het beschreven protocol is ontworpen voor snelle en geautomatiseerde fabricage van grote patronen. We hebben aangetoond dat deze patronen de celvorm efficiënt regelen door de geometrie van cel-ECM-adhesie te beperken. Ten slotte tonen we aan dat de beschreven patroontechniek de organisatie en dynamiek van het actinecytoskelet moduleert.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bovenstaande resultaten tonen aan dat het beschreven IR-laserondersteunde micropatterning (microfotopatterning) protocol reproduceerbare aanhangpatronen van verschillende vormen biedt die de manipulatie van celvorm en cytoskeletarchitectuur mogelijk maken. Hoewel er zowel voor als na het debuut van microphotopatterning tal van micropatterningmethoden zijn ontwikkeld, heeft deze methode verschillende voordelen. Ten eerste vereist het geen gespecialiseerde apparatuur en cleanrooms die meestal alleen binnen engineeringaf…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Connaught Fund New Investigator Award aan S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (subsidies RGPIN-2015-05114 en RGPIN-2020-05881), University of Manchester en University of Toronto Joint Research Fund en University of Toronto XSeed Program. C.T. werd ondersteund door NSERC USRA fellowship.
Materials
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
Referências
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
- Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
- Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
- Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
- Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
- Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
- Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
- Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
- Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
- Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
- Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
- Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
- Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
- Inoué, S., Spring, K. R. . Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).
- Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
- Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).
