Controllo della geometria cellulare attraverso il micropatterning laser assistito a infrarossi
Summary
Il protocollo qui presentato consente la fabbricazione automatizzata di micropattern che standardizzano la forma cellulare per studiare le strutture citoscheletriche all’interno delle cellule di mammifero. Questa tecnica di facile utilizzo può essere impostata con sistemi di imaging disponibili in commercio e non richiede apparecchiature specializzate inaccessibili ai laboratori standard di biologia cellulare.
Abstract
Il micropatterning è una tecnica consolidata nella comunità della biologia cellulare utilizzata per studiare le connessioni tra la morfologia e la funzione dei compartimenti cellulari, aggirando al contempo le complicazioni derivanti dalle variazioni naturali da cellula a cellula. Per standardizzare la forma delle celle, le celle sono confinate in stampi 3D o controllate per la geometria adesiva attraverso isole adesive. Tuttavia, le tradizionali tecniche di micropatterning basate sulla fotolitografia e sull’incisione UV profonda dipendono fortemente da camere pulite o attrezzature specializzate. Qui presentiamo una tecnica di micropatterning assistita da laser a infrarossi (microfotomodellazione) modificata da Doyle et al. In questo protocollo, utilizziamo un sistema di imaging Nikon A1R MP+ per generare micropattern con precisione micron attraverso un laser a infrarossi (IR) che abla regioni preimpostate su coverlip rivestite in poli vinile alcool. Utilizziamo uno script personalizzato per consentire la fabbricazione automatizzata di pattern con alta efficienza e precisione in sistemi non dotati di autofocus hardware. Mostriamo che questo protocollo di micropatterning assistito da laser IR (microfotomodellazione) si traduce in modelli definiti a cui le cellule si attaccano esclusivamente e prendono la forma desiderata. Inoltre, i dati provenienti da un gran numero di celle possono essere mediati a causa della standardizzazione della forma cellulare. I modelli generati con questo protocollo, combinati con l’imaging ad alta risoluzione e l’analisi quantitativa, possono essere utilizzati per schermi di velocità effettiva relativamente elevati per identificare i lettori molecolari che mediano il legame tra forma e funzione.
Introduction
La forma cellulare è un fattore determinante dei processi biologici fondamentali come la morfogenesi tissutale1,la migrazionecellulare 2,la proliferazionecellulare 3e l’espressione genica4. I cambiamenti nella forma cellulare sono guidati da un intricato equilibrio tra riarrangiamenti dinamici del citoscheletro che deforma la membrana plasmatica e fattori estrinseci come le forze esterne esercitate sulla cellula e la geometria delle aderenze cellulare-cella e matrice cellulare5. La migrazione delle cellule mesenchimali, ad esempio, polimerizza una fitta rete di actina sul bordo anteriore che spinge la membrana plasmatica in avanti e crea un’ampia lamellipodia 6 ,mentrela contrattilità dell’actomiosina ritrae lo stretto bordo finale della cellula per staccare la cellula dalla sua posizioneattuale 7,8. Interrompere gli eventi di segnalazione che danno origine a strutture citoscheletriche così specializzate perturbano forma e polarità e rallenta la migrazione cellulare9. Inoltre, la flessione epiteliale del foglio durante la gastrulazione richiede una costrizione apicale a base di actomiosina che fa sì che le cellule e i loro vicini diventino a forma dicuneo 10. Sebbene questi studi evidenzino l’importanza della forma cellulare, l’eterogeneità intrinseca nella forma cellulare ha gravato sugli sforzi per identificare meccanismi che collegano la morfologia al funzionamento.
A tal fine, negli ultimi trent’anni sono stati sviluppati numerosi approcci per manipolare la forma cellulare. Questi approcci raggiungono il loro obiettivo vincolando la cellula con uno stampo tridimensionale o controllando la geometria dell’adesione cellulare attraverso la deposizione modellata di proteine a matrice extracellulare (ECM) su una superficie antivegetativa, una tecnica chiamata micropatterning11. Qui 60 riesamineremo una serie di tecniche che hanno guadagnato popolarità nel corso degli anni.
Originariamente pioniere come approccio per applicazioni microelettroniche, la stampa di microcontatti a base di litografia morbida è diventata inequivocabilmente unadelle 12 preferite diculto. Un wafer principale viene prima fabbricato esponendo selettivamente le aree di un substrato di silicio rivestito di fotoresiste alla fotoirradiazione, lasciando dietro di sé una superficie modellata13. Un elastomero, come il PDMS, viene quindi versato sul wafer principale per generare un “timbro” morbido che trasferisce le proteine ECM a un substratodesiderato 11,14. Una volta fabbricato, un wafer master può essere utilizzato per lanciare molti francobolli PDMS che danno origine a micropattern altamente riproducibili12. Tuttavia, i modelli non possono essere facilmente regolati a causa del lungo processo di fotolitografia. Questo processo richiede anche attrezzature altamente specializzate e camere pulite che in genere non sono disponibili nei dipartimenti di biologia.
Più recentemente, è stato riferito che la stampa diretta con raggi UV profondi elude le limitazioni poste dai tradizionali approcci basati sulla litografia. La luce UV profonda viene diretta attraverso una maschera fotografica verso aree selettive di un copripicchieri rivestito con poli-L-lisina-innestato-polietilene glicole. I gruppi chimici esposti ai raggi UV profondi vengono fotoconvertiti senza l’uso di linker fotosensibili per consentire il legame delle proteine ECM15. La mancanza di linker fotosensibili consente ai coprispavimenti modellati di rimanere stabili a temperatura ambiente per oltre settemesi 15. Questo metodo evita l’uso di camere pulite e attrezzature fotolitografiche e richiede una formazione meno specializzata. Tuttavia, il requisito delle maschere fotografiche pone ancora un ostacolo sostanziale per gli esperimenti che richiedono cambiamenti prontamente disponibili nei modelli.
Oltre ai metodi che manipolano la geometria cellulare attraverso la deposizione controllata di proteine ECM su una superficie 2D, altri cercano di controllare la forma cellulare confinando le cellule in microstrutture 3D. Molti studi hanno adattato l’approccio morbido basato sulla litografia sopra descritto per generare camere 3D, piuttosto che 2D, PDMS per indagare i processi biologici dipendenti dalla forma in embrioni, batteri, lieviti e piante16,17,18,19. La polimerizzazione a due fotoni (2PP) ha anche preso il comando come tecnica di microfabbricazione in grado di creare complesse impalcature idrogel 3D con risoluzione nanometrica20. 2PP si basa sui principi dell’adsorbimento a due fotoni, in cui due fotoni consegnati in impulsi di femtosecondo vengono assorbiti simultaneamente da una molecola – fotoiniziatore in questo caso – che consente la polimerizzazione locale dei fotopolimeri21. Questa tecnica è stata fortemente utilizzata per stampare impalcature 3D che imitano le strutture native ECM del tessuto umano ed è stato dimostrato che inducono bassi danni fotochimicialle cellule 22.
Il debutto della microfotofoto 10 anni fa ha dato ai ricercatori l’opportunità di fabbricare micropattern evitando attrezzature inaccessibili e specializzate. La microfotofoto crea modelli sulla scala micron rimuovendo termicamente le regioni selettive di alcol poli vinilico (PVA) rivestite su superfici di vetro attivate utilizzando un laser ainfrarossi 23,24. Le proteine ECM che attaccano solo la superficie di vetro sottostante e non la PVA servono quindi come segnali biochimici per consentire dinamiche di diffusione controllate e forma cellulare. Questo metodo offre anche una flessibilità superiore poiché i modelli possono essere facilmente modificati in tempo reale. Qui, forniamo un protocollo passo-passo di microfotomodello utilizzando un sistema di imaging multi-fotone commerciale. Il protocollo descritto è progettato per la fabbricazione rapida e automatizzata di modelli di grandi dimensioni. Abbiamo dimostrato che questi modelli controllano in modo efficiente la forma delle celle vincolando la geometria delle aderenze cell-ECM. Infine, dimostriamo che la tecnica di patterning descritta modula l’organizzazione e la dinamica del citoscheletro actina.
Protocol
Representative Results
Discussion
I risultati di cui sopra dimostrano che il protocollo di micropatterning assistito da laser a infrarossi (microfotopatterning) descritto fornisce modelli aderenti riproducibili di varie forme che consentono la manipolazione della forma cellulare e dell’architettura citoscheletricha. Sebbene siano stati sviluppati numerosi metodi di micropatterning sia prima che dopo il debutto del microfotomodello, questo metodo possiede diversi vantaggi. In primo luogo, non richiede attrezzature specializzate e camere pulite che di soli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Connaught Fund New Investigator Award a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (sovvenzioni RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program. C.T. è stato supportato dalla borsa di studio NSERC USRA.
Materials
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
Referências
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