Kızılötesi Lazer Destekli Mikropatterning ile Hücre Geometrisinin Kontrolü
Summary
Burada sunulan protokol, memeli hücrelerindeki sitoskeletal yapıları incelemek için hücre şeklini standartlaştıran mikropatternlerin otomatik olarak üretilmesini sağlar. Bu kullanıcı dostu teknik, piyasada bulunan görüntüleme sistemleri ile kurulabilir ve standart hücre biyolojisi laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipman gerektirmez.
Abstract
Mikropatterning, hücre biyolojisi topluluğunda, hücresel hücreden hücreye varyasyonlardan kaynaklanan komplikasyonları atlatırken hücresel bölmelerin morfolojisi ve işlevi arasındaki bağlantıları incelemek için kullanılan yerleşik bir tekniktir. Hücre şeklini standartlaştırmak için hücreler ya 3D kalıplara hapsedilir ya da yapışkan adalar aracılığıyla yapışkan geometri için kontrol edilir. Bununla birlikte, fotolithografiye ve derin UV gravürlerine dayanan geleneksel mikropatterning teknikleri büyük ölçüde temiz odalara veya özel ekipmanlara bağlıdır. Burada, piyasada bulunan görüntüleme sistemleriyle kolayca kurulabilen Doyle ve ark. Bu protokolde, poli-vinil alkol kaplı kapaklar üzerinde önceden ayarlanmış bölgeleri ablates bir kızılötesi (IR) lazer aracılığıyla mikron hassasiyeti ile mikropatterns üretmek için bir Nikon A1R MP + görüntüleme sistemi kullanıyoruz. Donanım otomatik odaklama ile donatılmış olmayan sistemlerde yüksek verimlilik ve doğrulukla otomatik desen üretimi sağlamak için özel bir komut dosyası kullanmaktadır. Bu IR lazer destekli mikropatterning (mikrofotofopatterning) protokolünün, hücrelerin özel olarak bağlandığı ve istenen şekli aldığı tanımlanmış desenlerle sonuçlandığını gösteriyoruz. Ayrıca, hücre şeklinin standardizasyonu nedeniyle çok sayıda hücreden elde edilen verilerin ortalaması alınabilir. Bu protokolle oluşturulan desenler, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve nicel analiz ile birlikte, form ve işlev arasındaki bağlantıya aracılık eden moleküler oyuncuları tanımlamak için nispeten yüksek aktarım hızı ekranları için kullanılabilir.
Introduction
Hücre şekli doku morfogenez1,hücre göçü2,hücre çoğalması3ve gen ekspresyasyonu4gibi temel biyolojik süreçlerin önemli bir belirleyicisidir. Hücre şeklindeki değişiklikler, plazma zarını deforme eden sitoskeletonun dinamik yeniden düzenlenmesi ile hücreye uygulanan dış kuvvetler ve hücre-hücre ve hücre matrisi yapışıklıklarının geometrisi gibi dış etkenler arasındaki karmaşık bir denge tarafından yönlendirilir5. Örneğin, mezenkimal hücrelerin geçirilmesi, plazma zarını ileri iten ve geniş bir lamellipodia6oluşturan öncü kenarda yoğun bir aksin ağını polimerize eder, aktomiyosin kontraktilitesi hücreyi mevcut konumundan ayırmak için hücrenin dar sondaki kenarını geri alır7,8. Bu tür özel sitoskeletal yapılara yol açan sinyalizasyon olaylarını bozmak şekil ve polariteyi perturbs ve hücre göçunu yavaşlatır9. Ek olarak, gastrülasyon sırasında epitel tabaka bükme, hücrelerin ve komşularının kama şeklinde olmasına neden olan aktomiyosin bazlı apikal daralma gerektirir10. Bu çalışmalar hücre şeklinin önemini vurgulasa da, hücre şeklindeki doğal heterojenlik, morfolojiyi işleve bağlayan mekanizmaları belirleme çabalarını sonafettir.
Bu amaçla, son otuz yılda hücre şeklini manipüle etmek için çok sayıda yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar, hücreyi üç boyutlu bir kalıpla kısıtlayarak veya hücre dışı matris (ECM) proteinlerinin birtifasyon yüzeyine desenli birikmesi yoluyla hücresel yapışma geometrisini kontrol ederek amaçlarına ulaşır, mikropatterning11olarak adlandırılan bir teknik. Burada, yıllar boyunca popülerlik kazanan bir dizi tekniği gözden geçireceğiz.
Başlangıçta mikroelektronik uygulamalar için bir yaklaşım olarak öncü olan yumuşak litografi tabanlı mikrokontact baskı, kesin olarak kült bir favori haline gelmiştir12. Bir ana gofret ilk olarak fotoresist kaplı silikon substratın alanlarını fotoirradiasyona seçici olarak maruz bırakarak, desenli bir yüzey bırakarak imal edilir13. PDMS gibi bir elastomer, ECM proteinlerini istenen bir substrat11,14’eaktaran yumuşak bir “damga” oluşturmak için ana gofrete dökülür. Üretildikten sonra, yüksek oranda tekrarlanabilir mikropatterns12’yeyol açan birçok PDMS damgası dökmek için bir ana gofret kullanılabilir. Ancak uzun fotolitografi süreci nedeniyle desenler kolayca ayarlanamamaktadır. Bu işlem ayrıca biyoloji bölümlerinde tipik olarak bulunmayan son derece özel ekipman ve temiz odalar gerektirir.
Daha yakın zamanda, derin UV kullanarak doğrudan baskının geleneksel litografi tabanlı yaklaşımların getirdiği sınırlamaları atlattıği bildirilmiştir. Derin UV ışığı, bir fotomask aracılığıyla poli-L-lizinaşılı-polietilen glikol ile kaplanmış bir cam örtünün seçici alanlarına yönlendirilir. Derin UV’ye maruz kalan kimyasal gruplar, ECM proteinlerinin bağlanmasını sağlamak için ışığa duyarlı bağlayıcılar kullanılmadan fotokonverte edilir15. Işığa duyarlı bağlayıcıların olmaması, desenli kapak altlıkların yedi aydan fazla oda sıcaklığında sabit kalmasını sağlar15. Bu yöntem temiz odaların ve fotolithografi ekipmanlarının kullanılmasını önler ve daha az özel eğitim gerektirir. Bununla birlikte, foto maskeler gereksinimi, desenlerde kolayca kullanılabilir değişiklikler gerektiren deneyler için hala önemli bir engel teşkil etmektedir.
ECM proteinlerinin 2B yüzeyde kontrollü birikmesi yoluyla hücre geometrisini manipüle eden yöntemlere ek olarak, diğerleri hücreleri 3D mikroyapılara hapsederek hücre şeklini kontrol etmeye çalışır. Birçok çalışma, yukarıda açıklanan yumuşak litografi tabanlı yaklaşımı embriyolarda, bakterilerde, mayalarda ve bitkilerde şekle bağlı biyolojik süreçleri araştırmak için 2D, PDMS odaları yerine 3D üretmek için uyarlamıştır16,17,18,19. İki fotonlu polimerizasyon (2PP), nanometre çözünürlüğü20olan karmaşık 3D hidrojel iskeleler oluşturabilen bir mikrofabrikasyon tekniği olarak da öne geçti. 2PP, femtosaniye darbelerde verilen iki fotonun aynı anda bir molekül tarafından emildiği iki foton adsorpsiyon ilkelerine dayanır – bu durumda fotokilatör – fotopolimerlerin yerel polimerizasyonunu sağlayan21. Bu teknik, insan dokusunun yerel ECM yapılarını taklit eden 3D iskeleleri yazdırmak için yoğun olarak almıştır ve hücrelere düşük fotokimyasal hasar verdiği gösterilmiştir22.
10 yıl önce mikrofotoğrafçılığın piyasaya çıkışı, araştırmacılara erişilemeyen ve özel ekipmanlardan kaçınırken mikropatternler uydurma fırsatı verdi. Mikrofotopatterning, kızılötesi lazer23,24kullanarak aktif cam yüzeylere kaplanmış poli-vinil alkolün (PVA) seçici bölgelerini termal olarak kaldırarak mikron ölçeğinde desenler oluşturur. PVA’yı değil, sadece alttaki cam yüzeyi bağlayan ECM proteinleri, kontrollü yayılma dinamiklerini ve hücre şeklini etkinleştirmek için biyokimyasal ipuçları olarak hizmet eder. Desenler gerçek zamanlı olarak kolayca değiştirilebildiğinden, bu yöntem aynı zamanda üstün esneklik sunar. Burada, ticari bir çoklu foton görüntüleme sistemi kullanarak mikrofotoğrafterning’in adım adım protokolünü sağlıyoruz. Açıklanan protokol, büyük desenlerin hızlı ve otomatik bir şekilde imal edilmesi için tasarlanmıştır. Hücre-ECM yapışıklıklarının geometrisini kısıtlayarak bu desenlerin hücre şeklini verimli bir şekilde kontrol ettiğini gösterdik. Son olarak, açıklanan desenleme tekniğinin aktin sitoskeletonunun organizasyonuna ve dinamiklerine göre modüle ettiğini gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki sonuçlar, tanımlanan IR lazer destekli mikropatterning (mikrofotofopatterning) protokolünün, hücre şeklinin ve sitoskeletal mimarinin manipülasyonu sağlayan çeşitli şekillerde tekrarlanabilir yapışık desenler sağladığını göstermektedir. Mikrofotoğrafçılığın hem öncesinde hem de sonrasında çok sayıda mikropatterning yöntemi geliştirilmiş olsa da, bu yöntem çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, genellikle sadece Mühendislik bölümlerinde bulunan özel ekipman ve temiz …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (RGPIN-2015-05114 ve RGPIN-2020-05881), Manchester Üniversitesi ve Toronto Üniversitesi Ortak Araştırma Fonu ve Toronto Üniversitesi XSeed Programı tarafından desteklenmiştir. C.T. NSERC USRA bursu ile desteklendi.
Materials
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
Referências
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
- Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
- Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
- Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
- Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
- Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
- Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
- Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
- Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
- Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
- Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
- Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
- Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
- Inoué, S., Spring, K. R. . Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).
- Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
- Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).
