שליטה בגיאומטריית התא באמצעות מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום
Summary
הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ייצור אוטומטי של מיקרופטרנים המתקננים את צורת התא כדי לחקור מבנים ציטוסקלטליים בתוך תאי יונקים. טכניקה ידידותית למשתמש זו ניתנת להגדרה עם מערכות הדמיה זמינות מסחרית ואינה דורשת ציוד מיוחד שאינו נגיש למעבדות סטנדרטיות לביולוגיה של התא.
Abstract
Micropatterning היא טכניקה מבוססת בקהילת הביולוגיה של התא המשמשת לחקר קשרים בין המורפולוגיה והתפקוד של תאים תאיים תוך עקיפת סיבוכים הנובעים מווריאציות טבעיות של תא לתא. כדי לתקנן את צורת התא, התאים מוגבלים בתבניות תלת-ממדיות או נשלטים עבור גיאומטריה דביקה דרך איים דביקים. עם זאת, טכניקות micropatterning מסורתיות המבוססות על פוטוליטוגרפיה ותחיריט UV עמוק תלויות במידה רבה בחדרים נקיים או בציוד מיוחד. כאן אנו מציגים טכניקת מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום (microphotopatterning) שונה דויל ואח ‘. שניתן להגדיר בנוחות עם מערכות הדמיה זמין מסחרית. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במערכת הדמיה ניקון A1R MP+ כדי ליצור micropatterns עם דיוק מיקרון באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) כי ablates אזורים קבועים מראש על כיסויים מצופים אלכוהול פולי ויניל. אנו משתמשים בסקריפט מותאם אישית כדי לאפשר ייצור דפוסים אוטומטי ביעילות ובדיוק גבוהים במערכות שאינן מצוידות בפוקוס אוטומטי של חומרה. אנו מראים כי זה לייזר IR סייע micropatterning (microphotopatterning) הפרוטוקול תוצאות דפוסים מוגדרים אשר תאים לצרף באופן בלעדי ולקחת על הצורה הרצויה. יתר על כן, נתונים ממספר גדול של תאים ניתן ממוצע עקב סטנדרטיזציה של צורת התא. דפוסים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה, בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח כמותי, יכולים לשמש למסכי תפוקה גבוהים יחסית לזיהוי שחקנים מולקולריים המתווכים את הקשר בין צורה לתפקוד.
Introduction
צורת התא היא דטרמיננטה מרכזית של תהליכים ביולוגיים בסיסיים כגון מורפוגנזהשל רקמות 1, נדידת תאים2, התפשטות תאים3, וביטויגנים 4. שינויים בצורת התא מונעים על ידי איזון מורכב בין סידורים מחדש דינמיים של הציטוסקלטון המעוותים את קרום הפלזמה וגורמים חיצוניים כגון כוחות חיצוניים המופעלים על התא לבין הגיאומטריה של הידבקויות תאים ומטריצת תאים5. תאים mesenchymal נודדים, למשל, polymerize רשת actin צפוף בקצה המוביל שדוחף את קרום הפלזמה קדימה ויוצר lamellipodia רחב6, בעוד התכווצות actomyosin נסוגה הקצה הנגרר הצר של התא כדי לנתק את התא ממיקומו הנוכחי7,8. שיבוש אירועי איתות שמעוררים מבנים ציטוסקלים מיוחדים כאלה מפריעים לצורה ולקוטביות ומאטים את נדידת התאים9. בנוסף, כיפוף גיליון אפיתל במהלך gastrulation דורש התכווצות apical מבוסס actomyosin שגורם לתאים ושכניהם להיות טריז בצורת10. למרות שמחקרים אלה מדגישים את החשיבות של צורת התא, ההטרוגניות הטבועה בצורת התא הכבידה על המאמצים לזהות מנגנונים המחברים מורפולוגיה לתפקוד.
למטרה זו, גישות רבות כדי לתפעל את צורת התא פותחו בשלושת העשורים האחרונים. גישות אלה להשיג את מטרתם על ידי הגבלת התא עם עובש תלת מימדי או שליטה גיאומטריה הידבקות הסלולר באמצעות תצהיר בדוגמת של חלבונים מטריצה חוץ תאית (ECM) על משטח antifouling, טכניקה הנקראת micropatterning11. כאן נסקור מספר טכניקות שצברו פופולריות לאורך השנים.
במקור היה חלוץ כגישה ליישומים מיקרואלקטרוניקה, הדפסת מיקרו-טכנולוגיה רכה המבוססת על ליתוגרפיה הפכה באופן חד משמעי לפולחן מועדף12. רקיק מאסטר מפוברק תחילה על ידי חשיפה סלקטיבית של אזורים של מצע סיליקון מצופה פוטורסיסטי לצילום, ומשאיר אחריו משטח בדוגמת13. אלסטומר, כגון PDMS, נשפך לאחר מכן על הוופל הראשי כדי ליצור “חותמת” רכה המעבירה חלבוני ECM למצע הרצוי11,14. לאחר ייצור, רקיק הורים יכול לשמש כדי להטיל בולים רבים PDMS כי להוליד micropatterns לשחזור מאוד12. עם זאת, לא ניתן להתאים את הדפוסים בקלות בשל תהליך הפוטוליטוגרפיה הממושך. תהליך זה דורש גם ציוד וחדרים נקיים מיוחדים מאוד שאינם זמינים בדרך כלל במחלקות ביולוגיה.
לאחרונה, הדפסה ישירה באמצעות UV עמוק דווח לעקוף מגבלות שהוצגו על ידי גישות מבוססות ליתוגרפיה מסורתית. אור UV עמוק מופנה דרך פוטומסק לאזורים סלקטיביים של כיסוי זכוכית מצופה פולי-L-ליצין-מושתל– פוליאתילן גליקול. קבוצות כימיות החשופות ל- UV עמוק מומרות ללא שימוש במקשרים רגישים לאור כדי לאפשר איגוד של חלבוני ECM15. היעדר קישורים רגישים לאור מאפשר לכיסויים בדוגמאות להישאר יציבים בטמפרטורת החדר במשך יותר משבעה חודשים15. שיטה זו נמנעת משימוש בחדרים נקיים ובציוד פוטוליטוגרפיה ודורשת הכשרה פחות מיוחדת. עם זאת, הדרישה לפוטומסקים עדיין מהווה משוכה משמעותית לניסויים הדורשים שינויים זמינים בדפוסים.
בנוסף לשיטות לתפעל גיאומטריה של תאים באמצעות תצהיר מבוקר של חלבוני ECM על משטח דו-ממדי, אחרים מבקשים לשלוט בצורת התא על ידי הגבלת תאים במיקרו-מבנים תלת-ממדיים. מחקרים רבים התאימו את הגישה הרכה המבוססת על ליתוגרפיה המתוארת לעיל כדי ליצור תלת מימד, ולא דו מימדי, תאי PDMS כדי לחקור תהליכים ביולוגיים תלויי צורה בעוברים, חיידקים, שמרים וצמחים16,17,18,19. פולמור דו פוטון (2PP) לקח גם את ההובלה כטכניקת microfabrication שיכול ליצור פיגומים הידרוג’ל 3D מורכבים עם רזולוציה ננומטר20. 2PP מסתמך על העקרונות של ספיחה של שני פוטון, שבו שני פוטונים המועברים בפולסים femtosecond נספגים בו זמנית על ידי מולקולה – photoinitiator במקרה זה – המאפשר פולמור מקומי של פוטופולימרים21. טכניקה זו שימשה בכבדות כדי להדפיס פיגומים 3D המחקים את המבנים המקומיים ECM של רקמה אנושית הוכח לגרום נזק פוטוכימי נמוך לתאים22.
הופעת הבכורה של microphotopatterning לפני 10 שנים נתן לחוקרים את ההזדמנות לפברק micropatterns תוך הימנעות ציוד נגיש ומתמחה. Microphotopatterning יוצר דפוסים בסולם מיקרון על ידי הסרה תרמית אזורים סלקטיביים של פולי ויניל אלכוהול (PVA) מצופה על משטחי זכוכית פעילים באמצעות לייזר אינפרא אדום23,24. חלבוני ECM המחברים רק את משטח הזכוכית המשמש כבסיס ולא PVA משמשים כרמזים ביוכימיים כדי לאפשר דינמיקה של התפשטות מבוקרת וצורת תא. שיטה זו מציעה גם גמישות מעולה שכן דפוסים ניתן לשנות בקלות בזמן אמת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד של microphotopatterning באמצעות מערכת הדמיה רב פוטון מסחרית. הפרוטוקול המתואר מיועד לייצור מהיר ואוטומטי של דפוסים גדולים. הוכחנו כי דפוסים אלה שולטים ביעילות בצורת התא על ידי הגבלת הגיאומטריה של הידבקויות תאים-ECM. לבסוף, אנו מראים כי טכניקת דפוס המתוארת מווסתת את הארגון ואת הדינמיקה של ציטוסקלטון actin.
Protocol
Representative Results
Discussion
התוצאות לעיל מראות כי פרוטוקול micropatterning בסיוע לייזר IR המתואר (microphotopatterning) מספק דפוסים חסידים לשחזור של צורות שונות המאפשר מניפולציה של צורת התא וארכיטקטורה cytoskeletal. למרות ששיטות micropatterning רבות פותחו הן לפני ואחרי הופעת הבכורה של microphotopatterning, שיטה זו בעלת מספר יתרונות. ראשית, היא אינה דורשת צי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן קונוט פרס חוקר חדש S.P., קנדה קרן לחדשנות, NSERC דיסקברי גרנט התוכנית (מענקים RGPIN-2015-05114 ו RGPIN-2020-05881), אוניברסיטת מנצ’סטר ואוניברסיטת טורונטו קרן המחקר המשותף, ואוניברסיטת טורונטו XSeed תוכנית. C.T. נתמך על ידי מלגת USRA NSERC.
Materials
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
Referências
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
- Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
- Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
- Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
- Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
- Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
- Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
- Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
- Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
- Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
- Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
- Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
- Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
- Inoué, S., Spring, K. R. . Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).
- Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
- Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).
