Summary
Dette assay anvender embryonale stamceller fra mus, der er differentieret i embryoide kroppe dyrket i 3D-kollagengel, til at analysere de biologiske processer, der styrer spirende angiogenese in vitro. Teknikken kan anvendes til test af lægemidler, modellering af sygdomme og til at studere specifikke gener i forbindelse med deletioner, der er embryonalt dødelige.
Abstract
Nylige fremskridt inden for inducerede pluripotente stamceller (iPSC) og genredigeringsteknologier muliggør udvikling af nye humane cellebaserede sygdomsmodeller til fænotypiske lægemiddelopdagelsesprogrammer (PDD). Selv om dette nye udstyr kunne forudsige forsøgslægemidlers sikkerhed og virkning hos mennesker mere præcist, er deres udvikling til klinikken stadig stærkt afhængig af pattedyrsdata, navnlig brugen af modeller for sygdomme hos mus. Parallelt med humane organoid- eller organ-on-chip-sygdomsmodeller er udviklingen af relevante in vitro-musemodeller derfor et uopfyldt behov for at evaluere direkte lægemiddeleffektivitets- og sikkerhedssammenligninger mellem arter og in vivo- og in vitro-tilstande. Her beskrives et vaskulært spiringsassay, der udnytter museembryonale stamceller differentieret til embryoidlegemer (EB'er). Vaskulariserede EB'er dyrket på 3D-kollagen gel udvikler nye blodkar, der udvides, en proces kaldet spirende angiogenese. Denne model rekapitulerer nøglefunktioner i in vivo spirende angiogenesedannelse af blodkar fra et allerede eksisterende vaskulært netværk - herunder valg af endotelspidscelle, endotelcellemigration og proliferation, cellevejledning, rørdannelse og rekruttering af vægmalericeller. Det er egnet til screening for lægemidler og gener, modulerende angiogenese og viser ligheder med nyligt beskrevne tredimensionelle (3D) vaskulære assays baseret på humane iPSC-teknologier.
Introduction
I de sidste tre årtier har målbaseret lægemiddelopdagelse (TDD) været bredt anvendt i lægemiddelopdagelse af medicinalindustrien. TDD inkorporerer et defineret molekylært mål, der spiller en vigtig rolle i en sygdom og er afhængig af udviklingen af relativt enkle cellekultursystemer og aflæsninger til lægemiddelscreening1. De fleste typiske sygdomsmodeller, der anvendes i TDD-programmer, omfatter traditionelle cellekulturmetoder såsom kræftceller eller udødeliggjorte cellelinjer dyrket i kunstige miljøer og ikke-fysiologiske substrater. Selv om mange af disse modeller har givet levedygtige værktøjer til at identificere vellykkede lægemiddelkandidater, kan brugen af sådanne systemer være tvivlsom på grund af deres ringe sygdomsrelevans2.
For de fleste sygdomme er de underliggende mekanismer faktisk komplekse, og forskellige celletyper, uafhængige signalveje og flere sæt gener viser sig ofte at bidrage til en bestemt sygdomsfænotype. Dette gælder også for arvelige sygdomme, hvor den primære årsag er en mutation i et enkelt gen. Med den nylige fremkomst af humant inducerede pluripotente stamcelleteknologier (iPSC) og genredigeringsværktøjer er det nu muligt at generere 3D-organoider og organ-on-chip-sygdomsmodeller, der bedre kan rekapitulere in vivo-menneskelig kompleksitet 3,4. Udviklingen af sådanne teknologier er forbundet med en genopblussen i interessen for fænotypiske lægemiddelopdagelsesprogrammer (PDD)1. PDD kan sammenlignes med empirisk screening, da de ikke er afhængige af viden om identiteten af et specifikt lægemiddelmål eller en hypotese om dets rolle i sygdom. PDD-tilgangen anerkendes nu i stigende grad for at bidrage stærkt til opdagelsen af førsteklasses lægemidler5. Da udviklingen af humane organoid- og organ-on-chip-teknologier stadig er i sin vorden, forventes det, at iPSC-modeller (suppleret med innovative billeddannelses- og maskinlæringsværktøjer 6,7) i den nærmeste fremtid vil tilvejebringe flere nye komplekse cellebaserede sygdomsmodeller til lægemiddelscreening og tilhørende PDD-programmer for at overvinde TDD-metodens ringe produktivitet8 — 9.
Mens humane organoid- og organ-on-chip-modeller kan give vigtig indsigt i sygdomskompleksitet og identifikation af nye lægemidler, er det også stærkt afhængigt af data fra dyremodeller at bringe lægemidler ind i ny klinisk praksis for at vurdere deres effektivitet og sikkerhed. Blandt dem er genetisk modificerede mus bestemt de mest foretrukne pattedyrmodeller. De har mange fordele, da de har en relativt kort generationstid for pattedyr, har mange lignende fænotyper som menneskelige sygdomme og let kan genmanipuleres. De anvendes derfor i vid udstrækning i narkotikaforskningsprogrammer10. Det er dog fortsat en vigtig udfordring at bygge bro over kløften mellem mus og mennesker11. Udviklingen af in vitro-musemodeller svarende til humane organoid- og organ-on-chip-modeller vil i det mindste delvis kunne udfylde dette hul, da det vil muliggøre direkte lægemiddeleffektivitets- og sikkerhedssammenligninger mellem in vivo-data fra mus og in vitro-data fra mennesker.
Her beskrives et vaskulært spiringsassay i museembryoidlegemer (EB'er). Blodkar består af endotelceller (indre foring af karvægge), vægmalerier (vaskulære glatte muskelceller og pericytter)12. Denne protokol er baseret på differentieringen af embryonale stamceller fra mus (mESC'er) i vaskulariserede EB'er ved hjælp af hængende dråber, der rekapitulerer de novo-endotelcelle- og vægmalericelledifferentiering13,14. Muse-ESC'er kan let etableres i kultur fra isolerede dag 3.5 museblastocyster med forskellig genetisk baggrund15. De giver også muligheder for klonanalyse, afstamningssporing og kan let genetisk manipuleres til at generere sygdomsmodeller13,16.
Da blodkar nærer alle organer, er det ikke overraskende, at mange sygdomme, hvis ikke alle, er forbundet med ændringer i mikrovaskulaturen. Under patologiske tilstande kan endotelceller vedtage en aktiveret tilstand eller kan blive dysfunktionelle, hvilket resulterer i vægmaleridød eller migration væk fra blodkar. Disse kan resultere i overdreven angiogenese eller i karsjældenhed, kan fremkalde unormal blodgennemstrømning og defekt blodkarbarriere, der fører til ekstravasation af immunceller og betændelse12,17,18,19. Forskning til udvikling af lægemidler, der modulerer blodkar, er derfor høj, og flere molekylære aktører og koncepter er allerede blevet identificeret til terapeutisk målretning. I denne sammenhæng er den beskrevne protokol særligt velegnet til opbygning af sygdomsmodeller og til lægemiddeltestning, da den rekapitulerer nøglefunktioner i in vivo-spirende angiogenese, herunder valg af endotelspids og stilkcelle, endotelcellemigration og -proliferation, endotelcellevejledning, rørdannelse og rekruttering af vægmalericeller. Det viser også ligheder med nyligt beskrevne 3D vaskulære assays baseret på humane iPSC-teknologier20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medieforberedelse og kultur af mESC
- Forbered konditioneret medium +/- (CM+/-) ved hjælp af tilskuddet 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medium med 10% (vol/vol) varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 0,05 mM β-mercaptoethanol, 1x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA 1x), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat.
- Forbered konditioneret medium +/+ (CM+/+) ved hjælp af tilskuddet CM+/- medium med leukæmihæmmende faktor (LIF) (1.500 U / ml) og 0,1 mM β-mercaptoethanol.
- Der fremstilles konditioneret medium +/+ i nærvær af to inhibitorer (CM+/+ 2i) ved hjælp af tilskuddet CM+/+ substrat med 1 μM PD0325901 og 3 μM CHIR99021.
- Forbered 0,1% gelatineopløsning ved at blande 25 ml forvarmet 2% gelatineopløsning i 500 ml fosfatbufret saltvand uden calcium og magnesium (DPBS).
- Forbered 10x Trypsin Versene Phosphate (TVP 10x) buffer ved at blande Trypsin (2,5%) med TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% kyllingeserum, 0,01% Trypsin (2,5%) i H2O) (1:10 forhold, vol / vol).
BEMÆRK: Filtrer alle opløsningerne gennem et 0,22 μm porefilter. Opbevar dyrkningsmediet ved -20 °C i lang tid, og opbevar andre reagenser ved 4 °C i op til 3 uger (se materialetabellen). - Overtræk to 12-brønds cellekulturplader med 0,1% gelatineopløsning (500 μL pr. Hul) og inkuber dem i 30 minutter i en CO 2 -inkubator (37 ° C, 5% CO2, fugtig atmosfære).
- De gelatinebelagte plader vaskes med PBS, og der tilsættes 500 μL CM+/- medium.
- To hætteglas med 1 x 106 kryopræserverede embryonale fibroblaster (MEF'er fra mus) ved 37 °C optøs, og cellesuspensionen overføres til et konisk rør med 5 ml CM+/- medium.
- Centrifuger cellerne ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Opsug mediet og resuspender forsigtigt cellepillen i 12 ml CM+/- medium i en koncentration på 1,67 x 105 celler pr. ml.
- Der udledes 500 μL MEF-suspension i en cellekulturplade med 12 huller (2,4 x 105 celler pr.cm2), og pladen inkuberes natten over (o/n) i en CO2 -inkubator.
- Optø et hætteglas med kryopræserverede mESC'er (1 x 106) i CM+/+ 2i-medium.
- mESC-suspensionen sås på en forvasket plade med 12 brønde med MEF'er i 1 ml CM+/+ 2i-medium, og pladen overføres til en CO2 -inkubator. Opdater mediet dagligt.
- Ved 70% sammenløb vaskes mESC-kolonierne med DPBS. Der tilsættes 150 μL varm 10x TVP-buffer og inkuberes ved RT i 30 s for at initiere enzymatisk dissociation.
- Fjern forsigtigt TVP-bufferen, resuspender cellerne i 1 ml CM+/+ 2i-medium og dissocier kolonierne i enkeltceller ved forsigtig pipettering.
- Passage cellerne ved at overføre dem til en ny 12-brønds cellekulturplade med MEF'er (opdelingsforhold: 1: 3-1: 5). Bland forsigtigt for at fordele cellerne og inkubere i en CO2 inkubator.
- Opfrisk dyrkningsmediet (2-3 ml) og observer cellevæksten/morfologien dagligt. Gentag seriel passaging ved 70% sammenløb hver 2. dag. Skift til CM + / + medium i to passager, før celledifferentiering påbegyndes.
2. EB-dannelse i hængende dråbe
- Forbered frisk mesodermdifferentieringsmedium ved at supplere CM + / - medium med basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) (50 ng · ml-1) og med knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP-4) (5 ng · ml-1) og hold det ved 4 ° C indtil brug.
- Overtræk en brønd af 6-brønds cellekulturpladen med 500 μL 0,1% gelatineopløsning og læg den i en CO2 -inkubator i 30 minutter.
- De gelatinebelagte plader vaskes med PBS, og der tilsættes 500 μL CM+/- medium.
- For at opnå en ren population af mESC'er trypsiniseres cellekulturpladen med 10x TVP-buffer i 30 s ved RT, resuspenderes cellerne i 1 ml mesodermdifferentieringsmedium og overføres derefter til den gelatinebelagte 6-brøndsplade i 30 minutter, så MEF'erne kan fastgøres, mens mESC'erne forbliver i suspension.
- Opsaml cellesuspensionen i et 50 ml konisk rør og tæl cellerne ved hjælp af et Neubauer-hæmocytometer og trypanblåt farvestof til udelukkelse af levende / døde celler.
- Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved RT. Supernatanten fjernes, og cellepelletten resuspenderes i mesodermdifferentieringsmediet, så den når op på 4,55 x 104 celler pr. ml.
- Fyld bunden af 94 mm polystyrenskåle med lav fastgørelse med 15 ml sterilt vand.
BEMÆRK: Fire skåle indeholdende hængende dråber (1,6 x 105 celler i 3,52 ml medium) vil være påkrævet for at teste en bestemt tilstand ved hjælp af 3D-spirende angiogeneseassay. - Overfør cellesuspensionen til en steril plastbeholder, og fyld fire positioner af en multikanalpipette med 22 μL cellesuspension pr. kanal (1 x 103 celler pr. 22 μL dråbe).
- Løft og vend låget på 94 mm skålen, og placer det på flowskabets rene overflade med indersiden opad.
- Afsæt 40 dråber af cellesuspensionen på indersiden af hvert låg. Vend forsigtigt låget uden forstyrrelse og læg det tilbage på fadet, så dråberne vender mod vandet.
- Inkuber opvasken i en CO2 inkubator. Betragt dette som differentieringsdag 0. Vedligehold pladerne i 4 dage for at danne EB'er.
3. Konkurrenceanalyse for spidscellepositionen
- Dyrkning af en fluorescerende og en ikke-fluorescerende mESC-linje som tidligere beskrevet13. Som et eksempel anvendes 7ACS/EYFP mESC'er mærket med gult og R1 mESC'er.
- Forbered mosaik EB'er ved at blande lige store mængder af de to mESC-linjer (1: 1-forhold) og inkuber de hængende dråbeskåle i en CO 2 -inkubator som beskrevet i trin2 .
4. Flydende EBs-kultur til vaskulær differentiering
- Før du samler EB'er fra de hængende dråber, skal du forberede følgende.
- Der fremstilles 5% agaropløsning i H2O, og den steriliseres ved autoklavering (20 minutter ved120°C).
- Brug den varme 5% agaropløsning til at forberede G-MEM BHK-21 medium indeholdende 1% agar og hæld hurtigt 3 ml i en af de 60 mm polystyrenskåle. Lad agaren størkne i 1 time ved RT. Opbevar opvasken ved 4 °C indtil brug.
- Forbered frisk 2x vaskulært differentieringsmedium ved at supplere CM + / - medium med bFGF (100 ng · ml-1) og VEGF-A (50 ng · ml-1). Opbevar mediet ved 4 °C indtil brug.
- De hængende dråber samles i et 15 ml konisk rør ved hjælp af en P1000-pipette, og supernatanten fjernes efter nogle få minutters EB-sedimentering.
- EB'erne resuspenderes i 3 ml 2x vaskulært differentieringsmedium, EB-suspensionen overføres til en agarovertrukket skål, og EB'erne fordeles homogent for at undgå aggregering.
- Inkuber skålene i CO 2 inkubator og opfrisk mediet hver2. dag indtil dag 9 ved hjælp af 1x vaskulært differentieringsmedium i nærvær af bFGF (50 ng · ml-1) og VEGF-A (25 ng · ml-1).
- Alternativt tilsættes trombocytafledt vækstfaktor-BB (PDGF-BB) (10 ng · ml-1 på dag 4 og 5 ng · ml-1 på dag 6 og dag 8) til det vaskulære differentieringsmedium for at fremme vægmalericelledifferentiering.
5. Analyse af flowcytometri
- De 9 dage gamle EB'er samles i et 15 ml konisk rør ved hjælp af en P1000-pipette og vaskes én gang med varm PBS.
- Der tilsættes 1 ml G-MEM BHK-21 medium indeholdende 0,2 mg·ml-1 kollagenase A og inkuberes cellerne i en CO2 inkubator i 5 min.
- Afbryd EB'erne ved forsigtigt at pipettere op og ned med en P1000-pipette.
- Stop kollagenaseaktiviteten ved at tilføje 1 ml koldt G-MEM BHK-21-medium med 10% FBS.
- Centrifuger cellerne ved 200 x g i 5 minutter ved RT.
- Resuspender cellerne i 500 μL PBS med 2% FBS.
- Tæl cellerne ved hjælp af et Neubauer hæmocytometer.
- Resuspender 400.000 celler i 100 μL PBS med 2% FBS pr. farvningstilstand.
- Cellerne inkuberes i 45 minutter ved 4 °C med følgende antistoffer: APC-konjugeret PECAM-1-antistof mod mus med rotter (klon MEC13.3) og FITC-konjugerede rotteantimus CD45 (klon 30-F11) eller isotypekontrolantistoffer.
- Cellerne vaskes to gange med 1 ml PBS indeholdende 2% FBS.
- Resuspender cellerne for at nå en endelig koncentration på 5 x 106 celler pr. ml.
- Filtrer cellerne ved hjælp af et rundbundet polystyrenreagensglas med en cellesi-snaphætte.
- Analyser 20.000 PECAM-1 (+) hændelser efter flowcytometri.
6.3D spirende angiogeneseanalyse og immunofluorescensfarvning
- På dag 9 fremstilles et spiremedium ved tilsætning af 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·ml-1), VEGF-A (25 ng·ml-1), humant rekombinant erythropoietin (hEPO) (20 ng·ml-1), humant interleukin-6 (IL-6) (10 ng·ml-1), 0,05 mM β-mercaptoethanol, NEAA (1x), L-glutamin (1x), natriumpyruvat (1x), type I rottehalekollagen (1,25 mg·ml-1), og NaOH (3,1 mM) til GMEM BHK-1 medium.
- For at undgå kollagengelering skal du holde spiremediet på is indtil brug.
- For at evaluere effekten af pro/antiangiogene molekyler tilsættes det valgte lægemiddel eller vehikel til spiremediet ved den valgte koncentration.
- 9 dage gamle EB'er opsamles fra en 60 mm agarskål i et 15 ml konisk rør (svarende til én tilstand), og supernatanten fjernes efter nogle få minutters sedimentering.
- Bunden af en 35 mm kulturskål dækkes med 1 ml spiresubstrat og inkuberes ved 37 °C i 5 minutter for at fremkalde gelering.
- EB'erne resuspenderes i 2 ml koldspirende medium.
- Opslæmningen overføres til 35 mm kulturskålen, der er belagt med det første lag spiremedium.
- Fordel EB'erne over hele pladen og sørg for, at de er i lige stor afstand fra hinanden. Inkuber skålen i en CO2 inkubator. Den første spiredannelse sker inden for 24-48 timer.
- På dag 12 overføres kollagengelen indeholdende EB'er omhyggeligt til et glasglas (75 x 26 mm) ved hjælp af en spatel.
- Fjern den overskydende væske med en pipette (P1000) og dehydrer gelen ved at placere et gazeark nylonlinned og absorberende filterkort (gelblottingpapir) oven på gelen. Tryk på ved at placere en vægt (250 g) i 2 min. Fjern forsigtigt nylon-/filterpapiret, og lad gliderne lufttørre i 30 minutter ved RT.
- Vask lysbillederne tre gange med PBS i 5 min ved RT.
- EB'erne fastgøres med zinkopløsning (se materialetabellen) o/n ved 4 °C. Alternativt fastgøres mosaikfluorescerende EB'er med paraformaldehyd (PFA) (4%) o/n ved 4 °C i mørke.
- Fjern fikseringsmidlet. Vask lysbillederne fem gange med PBS i 5 min ved RT.
- Permeabilisere EB'erne i PBS indeholdende 0,1% Triton-X100 i 15 minutter ved RT.
- Fjern permeabiliseringsopløsningen. Vask lysbillederne fem gange med PBS i 5 min.
- EB'erne inkuberes i blokeringsbufferen (PBS med 2 % bovin serumalbumin, BSA) i 1 time ved RT.
- For at plette endotelspirerne anvendes et primært antistof mod mus fra rotter (1:100 fortynding) til blokering af buffer o/n ved 4 °C.
- Vask lysbillederne fem gange med PBS i 5 min.
- Inkuber diasene med gedeanti-rotte Alexa 555 sekundært antistof i blokerende buffer (1:250 fortynding) og om nødvendigt med FITC-konjugeret anti-α-SMA-antistof i blokerende buffer (1:250 fortynding) for at plette vægmalericeller i 2 timer ved RT i mørke.
- Vask lysbillederne tre gange med PBS i 5 min og én gang med H20, før du monterer dem.
7. Konfokal billeddannelse, morfometrisk og kvantitativ analyse af EB-endotelspirer
- Få billeder i høj opløsning af de immunfarvede EB'er ved fokkalplansammensmeltning (z-stabling) ved hjælp af et konfokalmikroskop. Brug 10x forstørrelsesmål til at afbilde hele EB'er.
- Analyser de billeder, der er erhvervet ved hjælp af ImageJ for at evaluere morfologien og kvantificere egenskaberne ved PECAM-1-positive endotelspirer i henhold til etablerede kvantificeringsmetoder13,14,21.
- Beregn det gennemsnitlige antal endotelspirer pr. EB ved manuelt at tælle det samlede spireantal pr. individ EB'er.
- Mål de enkelte spirelængder ved hjælp af tegneværktøjet ImageJ. Definer bunden af endotelspiren startende ved EB-kerneområdet, og tegn manuelt en linje, indtil spirespidsens ende.
- Beregn det gennemsnitlige antal tipceller pr. spire ved manuelt at tælle antallet af tipceller pr. individuel spire, og beregn derefter gennemsnittet pr. EB.
- Beregn filopodia-retningen ved manuelt at bestemme forældrespirens akse, og mål den spidse vinkel mellem dem ved hjælp af ImageJ-softwarevinkelværktøjet. Beregn antallet af spirer med en orientering >50° og divider det med det samlede antal spirer af EB af interesse.
BEMÆRK: Vinklerne varierede altid fra 0° til 90°.
- Få billeder i høj opløsning af de immunfarvede EB'er ved hjælp af et konfokalmikroskop. Brug 40x forstørrelsesmål til at realisere billeder i høj opløsning af enkeltendotelspirer.
- Kvantificer beholderdækningen af PECAM-1-positive EF-spirer omgivet af α-SMA-positive MC'er ved hjælp af ImageJ-softwaren.
- Opdel de flettede billeder i separate røde og grønne kanaler.
- Konverter billederne til sin binære form.
- Mål det samlede cellulære areal af spiren, der optages separat af PECAM-1 (endotelceller mærket med rødt) og af α-SMA (vægmalericeller mærket med grønt) positive celler.
- Generer det flettede billede ved hjælp af billedberegnerfunktionen og AND-operatøren. Mål billedets samlede mobilområde. For at beregne dækningen divideres området for det colokaliserede billede med området for PECAM-1 binært billede.
- For at analysere cellekonkurrencen for endotelspids / stilkcelleposition af spirer udviklet af mosaik EB'er skal du manuelt score antallet af spidsceller og markere deres genotypiske oprindelse baseret på fluorescenssignalet. Beregn middelværdierne pr. EB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokoloversigten over blodkarspiringsanalysen er vist i figur 1. Ni dage gamle EB'er afledt af tre uafhængige 129/Ola mESC-linjer (Z/Red, R1 og E14) blev enzymatisk dissocieret til enkeltceller ved hjælp af collagenase A. Celler blev farvet for PECAM-1 og analyseret ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) som beskrevet. Alle cellelinjerne udviste robust endoteldifferentiering, og der blev ikke observeret forskelle i deres evne til at differentiere sig til endotelceller. Alle cellelinjerne producerede ca. 10,5% ± 1,3% af endotelcellerne (figur 2A). De relative ekspressionsniveauer af PAN-endotelielle cellemarkører i PECAM-1 (+) cellepopulationerne blev også kvantificeret. MRNA-ekspressionsniveauerne for alle de analyserede markører (Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2 og Cdh5) var sammenlignelige mellem cellelinjerne og eksperimenterne, hvilket bekræftede differentieringsprotokollens robusthed (figur 2B). PECAM-1 (+) cellepopulationer udtrykte kun meget lave mRNA-niveauer af arterielle (Notch1 og Efnb2) eller venøse (Couptf2 og Ephb4) markører, der understøtter den relativt umodne tilstand af endotelcellerne, der blev genereret af protokollen (figur 2C).
Evnen af den vaskulære spirende EB-model til at screene for lægemiddelmodulerende angiogenese blev derefter demonstreret (figur 3). DC101 og DAPT (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-Lalanyl]-S-phenylglycin t-butylester) blev testet. Disse forbindelser anvendes i vid udstrækning i mus til henholdsvis at blokere angiogenese ved at hæmme VEGFR2-aktivitet eller til at fremme endotelspidscelledifferentiering og dannelsen af en tæt vaskulær plexus ved at målrette Notch-signalering (figur 3A). Både VEGF og Notch signalveje er nøgleregulatorer af spirende angiogenese in vivo. Virkningerne af forskellige koncentrationer af DC101 og DAPT i EB'er belagt med kollagen I blev evalueret. Høje doser af DC101 fra 6-30 mg· L-1 hæmmede både antallet og længden af beholderspirerne, mens DAPT havde modsatte virkninger ved en dosis på 1 μmol· L-1 (figur 3B-C). Der findes også billeder med høj forstørrelse af beholderspirer, der er farvet for PECAM-1 af EB'er, der dyrkes under tilstedeværelse af DAPT (figur 3D). DAPT selv ved lave doser fra 0,5-1 μmol· L-1 øgede kraftigt antallet af endotelspidsceller med karspirer, der havde en vildledende fænotype (figur 3D-F). Høj dosis DAPT førte også til karkoalescens og dannelse af store og flade endotelcelleområder uden organisering (figur 3A). Resultaterne bekræftede modellens evne til at teste lægemidler, der enten fremmer eller hæmmer angiogenese.
For at bekræfte, at denne model er egnet til at efterligne vaskulære sygdomme, leveres de konfokale billeder af EB'er afledt af Acvrl1+/- mESC'er. Acvrl1-genet koder for ALK1 (Activin Receptor-like Kinase 1), en receptor, der specifikt udtrykkes i endotelceller, der, hvis den muteres, er ansvarlig for udviklingen af en vaskulær sjælden sygdom med angiodysplasi ved navn Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT). Et højt forstørrelsesbillede af Acvrl1+/- endotelspirerne afslørede, at de havde flere endotelspidsceller og flere grene pr. spirer, der var i tilfældige vinkler i forhold til moderkarrene. Disse bekræftede in vitro en misledende fænotype som observeret hos HHT-mus (figur 4).
Ved at danne kimære EB'er, der indeholder differentieret mESC fluorescerende mærket og mESC af en bestemt genotype, er en alternativ protokol til undersøgelse af processen med valg af endotelspids inkluderet (figur 5A-C). Et konfokal billede af PECAM-1-mærkede karspirer identificerede den genotypiske oprindelse af de førende endotelspidsceller (figur 5B). Blandinger af en vildtype YFP (gult fluorescerende protein) mESC-linje i forholdet 1: 1 med en umærket mESC-vildtypelinje førte konsekvent til hvert befolknings lige store bidrag til de førende endotelspidsceller (figur 5C).
Denne protokol er også velegnet til kvantificering af vægmaleriets celledækning af karspiren. EB'er, der gennemgår angiogenese, blev fikseret og farvet for PECAM-1 (endotelceller, rød) og for α-Smooth Muscle Actin (α-SMA) (vægmalericeller, grøn) (figur 5D). Et billede med høj forstørrelse afslørede, hvordan en enkelt karspire var omgivet af vægmalerier (figur 5E, venstre). Binær transformation blev udført efter farvekanalseparation (figur F-G) for at kvantificere forholdet mellem PECAM-1 (+) beholder dækket af α-SMA (+) vægmalericeller ved hjælp af ImageJ-softwaren (figur 5H).
Figur 1: Tidslinje for protokolprocedurerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakterisering af EC'er afledt af mESC vaskulær differentiering inden for EB'er. (A) Flowcytometrisk analyse af CD31-ekspression fra 9 dage gamle EB'er og kvantificering af procentdelen af Pecam-1 (+) celler. (B-D) mRNA-ekspressionsniveauer af Pecam-1, Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2, Cdh5, Notch1, EfnB2, Couptf2 og EphB4 i sorterede endotelceller fra 9 dage gamle EB'er. Fejlbjælker repræsenterer middelværdien ± standardfejlen for middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: 3D-spirende angiogeneseanalyse til lægemiddeltestning. (A) Konfokale billeder af tre repræsentative EB'er farvet for Pecam-1 (hvide, endotelceller) behandlet med vehikel alene, DAPT (0,5 μmol· L-1, 1,0 μmol· L-1, 5,0 μmol· L-1) eller DC101 (3 mg· L-1, 6 mg · L-1, 30 mg · L-1). B) Kvantificering af antallet af spirer pr. EB. C) Kvantificering af spirelængden. D) På øverste venstre panel høj forstørrelse af endotelspirer, der viser netværkets kompleksitet og grenpunktets tal på to forskellige lag fra samme EB, nederst til venstre en skematisk illustration, der repræsenterer målemetoden for endotelspirens orientering. På øverste højre panel, høj forstørrelse af endotelspirer fra køretøjet alene og på nederste højre panel, høj forstørrelse af endotelspirer fra DAPT (0,5 μmol· L-1) tilstand. E) Kvantificering af antallet af tipceller pr. spire. F) Kvantificering af procentdelen af filopodia inden for vinkel >50°. Alle søjler repræsenterer gennemsnitlige ± SEM- og p-værdier fra uparret, envejs ANOVA test. ns = ikke-signifikant, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 og ****p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Defekt karspiring i arvelige hæmoragiske Telangiectasia EB'er. På toppanelet, konfokale billeder af repræsentative 12 dage gamle EB'er fra Acvrl1+/+ og Acvrl1+/- genotyper farvet for Pecam-1 (hvide, endotelceller). På bundpanelet er høj forstørrelse af Acvrl1+/- endotelspirer (hvid boks fra toppanelet), der viser adskillige spidsceller (røde pile), endotelgrenpunkter (blå prikker) og spirende vildledningsfænotype (grønne pile). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Undersøgelse af spids / stilk celleposition og karmodning ved hjælp af 3D-spiringsassayet. (A) Konfokalbillede af en repræsentativ 12 dage gammel kimær EB fremstillet af R1 vildtypecellelinje blandet 1:1 med 7ACS/EYFP vildtypecellelinje farvet for Pecam-1 (røde, endotelceller). Røde pile angiver spidsceller fra R1-cellelinjen, og grønne pile angiver spidsceller fra 7ACS/EYFP-cellelinjen. B) Høj forstørrelse af en endotelspire, der viser fordelingen af R1 og 7ACS/EYFP-endotelceller langs spiren. C) Kvantificering af de relative genotypespidsceller fra repræsentative vildtype-EB'er. (D) Konfokalbillede af en repræsentativ 12 dage gammel EB farvet for Pecam-1 (røde, endotelceller) og α-SMA (grønne, vægmalericeller). (E) Høj forstørrelse af en endotelspire (hvid rektangulær stiplet boks fra D), der viser vægmaleri / endotelcelleinteraktion. (F-G) Billeder af den farvede endotelspire og deres tilknyttede binære transformerede billeder. (H) Binært billede af co-lokaliseret Pecam-1 og α-SMA farvning. Forholdet mellem endotelcellespirer dækket af vægmalericeller. Alle søjler repræsenterer gennemsnitlig ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver et upartisk, robust og reproducerbart 3D EB-baseret vaskulært spiringsassay, der kan screenes for lægemidler og gener, der modulerer angiogenese. Denne metode giver fordele i forhold til mange udbredte todimensionelle (2D) assays ved anvendelse af endotelcellekulturer såsom humane navlestrengendotelceller (HUVEC'er) til overvågning af migration (lateral ridseanalyse eller Boyden-kammerassayet)22,23 eller proliferation (tælling af celleantal, påvisning af DNA-syntese, påvisning af proliferationsmarkører eller metaboliske assays)24 idet det unikt tillader undersøgelse af både endotel- og vægmalericelledifferentiering og deres organisering i et vaskulært netværk, der efterligner vigtige trin i spiring af angiogenese. Disse trin omfatter valg af endotelspidsceller, spredning af stilkcellerne, rumlig orientering og migration af karspiren og rekruttering af vægceller til det spirende blodkar25. Det giver også fordele for mange 3D-angiogenesemodeller. Fibrinperlen 26,27 eller kollagengelanalysen28,29,30, der efterligner tubulogenesen, bruger almindeligvis HUVEC'er eller endotelkolonidannende celler afledte endotelceller (ECFC-EC), da de har en høj proliferativ hastighed, men ikke er egnede til musens primære endotelceller, der er vanskelige at opretholde i kultur. Ex vivo retina explant31 eller vaskulariseret mikroorgananalyse32 kan rekapitulere godt alle blodkardannelsestrinne, men de har komplekse eksperimentelle procedurer og er ikke egnede til lægemiddel med høj gennemstrømning eller genetisk screening. Dette gælder også for ex vivo aortaringanalysen 33,34 og for mange in vivo-assays såsom tumorimplanteret i mus eller funktionstabsundersøgelser i mus, der ofte har høje omkostninger og vanskeligheder med at opnå store mængder data 35. Denne protokol supplerer også fint lignende in vitro angiogeneseassays ved hjælp af humane iPSC'er, der muliggør sammenligninger mellem muse- og humane data. Selvom det er vigtigt at bemærke, at humane iPSC-afledte endotelceller viser mindre evne til at spire end musecellerne36,37.
Den metode, der udvikles her, har også nogle begrænsninger. Det kan ikke evaluere virkningerne af væskestrøm på blodkarmodning, karpermeabilitet og producerer ikke spirende blodkar i et specifikt vævsmiljø sammenlignet med nylige mikrofabrikerede enheder, der er under udvikling. Faktisk kan organ-on-chip-teknologier, der kombinerer mikrofluidik med vævsteknik, give dyrkede endotelceller et mikromiljø svarende til det in vivo38,39. Mikrofluidiske systemer indeholder den korrekte ekstracellulære matrixsammensætning og er designet til at producere mekaniske signaler såsom forskydningsspænding. Nogle er designet til at inkorporere vægmalerier og andre støttende celler i et givet væv eller kan generere kemiske gradienter. De indeholder netværk af mikronskala væskefyldte kanaler, der er ens i størrelse og struktur til blodkapillærerne. Organ-on-chip-teknologierne muliggør også kvantificering af specifikke vaskulære funktioner, herunder permeabilitet og transendotelelektrisk modstand. Selvom organ-on-chip-teknologier giver løfte, er de så langt ud over forskningsekspertisen i de fleste biologiske laboratorier, har stadig brug for ordentlig standardisering og kræver specialiserede fabrikationsteknikker. Kommercialisering af organ-on-chip-teknologifremstilling er kun lige begyndt, og disse systemer betragtes som omkostninger og tid uoverkommelige for farmaceutiske virksomheder i øjeblikket40,41.
Der er flere kritiske skridt, der bør tages i betragtning. Brug celler af høj kvalitet, der robust udtrykker velaccepterede markører (Nanog, Oct4, Sox2 og SSEA-1) i den pluripotente tilstand. Det er vigtigt nøje at overvåge deres vækst, mES-celleform og størrelsen og morfologien af mES-kolonier. Da karyotypisk stabilitet er stokastisk i dyrkede celler, er det vigtigt at revurdere den efter omfattende passage. Det anbefales at bruge produkter, der allerede er testet for mESC-kultur, og teste MEF-fødere, føtalt kalveserum og alle kemiske forbindelser i flere passager for at detektere, om mESC'er bevarer deres cellulære egenskaber, eller om de differentierer eller erhverver en epiblastisk fænotype. Mediet skal opdateres dagligt, og mESC-kolonier må ikke blive for store og tætte. Endelig skal mESC'er dyrkes mindst i to passager uden 2i før differentiering for at sikre det bedste udbytte af endotelceller.
Endoteldifferentieringen omfatter to vigtige trin: dannelsen af EB'er ved hjælp af hængende dråbemetoden og deres kultur under flydende forhold i nærvær af vaskulært differentieringsmedium13,14. Bevægelsen af de hængende dråbeskåle bør minimeres for at opnå ensartet celleaggregering. Antallet af mESC'er, der bruges til at danne et aggregat i de fleste tilfælde, varierer mellem 800-1.000 celler, men det kan være nødvendigt at optimere, hvis mESC'er har en anden genetisk baggrund end 129 / ola for at sikre en optimal differentiering i vaskulariserede EB'er. Når de dyrkes under flydende forhold, skal EB'er fordeles omhyggeligt og undgå bevægelse, der favoriserer EB-klumpning.
EB'er dyrkes til sidst i kollagen I-gel for at danne karspirer. Angiogent medium skal være frisklavet, og når det er blandet med kollagen, skal jeg holdes på is for at undgå spontan gelering. I tilfælde af lægemiddeltest tilsættes lægemidler i den kolde blanding i den rigtige koncentration under dette trin. Justering af pH med NaOH før resuspendering af EB'erne er afgørende, ellers vil kollagensyre forårsage celletoksicitet. Endelig bør EB'er spredes i ækvidistance fra hinanden for at sikre reproducerbare resultater.
Afslutningsvis introducerer denne metode et 3D vaskulært spiringsassay baseret på mESC, der har den nødvendige robusthed og skalerbarhed til at blive brugt til genetisk screening som for nylig beskrevet af Elling U. et al. der genererede en stor haplobank af hemi / homozygot mutant mESC16 og til fænotypisk lægemiddelopdagelsesprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND og af Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ?secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
- Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A.
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
- Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
- Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
- Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
- Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).
- Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
- Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
- Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G.
- Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
- Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
- van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).
- Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
- Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
- Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
- Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
- Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
- Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
- Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
- Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).
- Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).
- Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17 (2020).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
