Summary
Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.
Abstract
Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) en genbewerkingstechnologieën maken de ontwikkeling mogelijk van nieuwe op menselijke cellen gebaseerde ziektemodellen voor fenotypische geneesmiddelenontdekking (PDD) -programma's. Hoewel deze nieuwe apparaten de veiligheid en werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen bij mensen nauwkeuriger konden voorspellen, is hun ontwikkeling naar de kliniek nog steeds sterk afhankelijk van zoogdiergegevens, met name het gebruik van muizenziektemodellen. Parallel aan humane organoïde of organ-on-chip ziektemodellen is de ontwikkeling van relevante in vitro muismodellen daarom een onvervulde behoefte aan het evalueren van directe geneesmiddeleneffectiviteit en veiligheidsvergelijkingen tussen soorten en in vivo en in vitro aandoeningen. Hier wordt een vasculaire kiemtest beschreven die gebruik maakt van embryonale stamcellen van muizen die zijn gedifferentieerd in embryoïde lichamen (EB's). Gevasculariseerde EB's gekweekt op 3D-collageengel ontwikkelen nieuwe bloedvaten die uitzetten, een proces dat kiemende angiogenese wordt genoemd. Dit model vat de belangrijkste kenmerken samen van in vivo ontkiemende angiogenese-vorming van bloedvaten uit een reeds bestaand vasculair netwerk - inclusief endotheelcelselectie, endotheelcelmigratie en proliferatie, celgeleiding, buisvorming en rekrutering van muurschilderingen. Het is vatbaar voor screening op geneesmiddelen en genen die angiogenese moduleren en vertoont overeenkomsten met recent beschreven driedimensionale (3D) vasculaire assays op basis van menselijke iPSC-technologieën.
Introduction
In de afgelopen drie decennia is target-based drug discovery (TDD) op grote schaal gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen door de farmaceutische industrie. TDD bevat een gedefinieerd moleculair doelwit dat een belangrijke rol speelt in een ziekte en is gebaseerd op de ontwikkeling van relatief eenvoudige celkweeksystemen en uitlezingen voor geneesmiddelenscreening1. De meeste typische ziektemodellen die in TDD-programma's worden gebruikt, omvatten traditionele celkweekmethoden zoals kankercellen of onsterfelijke cellijnen die zijn gekweekt in kunstmatige omgevingen en niet-fysiologische substraten. Hoewel veel van deze modellen levensvatbare hulpmiddelen hebben geboden voor het identificeren van succesvolle kandidaat-geneesmiddelen, kan het gebruik van dergelijke systemen twijfelachtig zijn vanwege hun slechte ziekterelevantie2.
Voor de meeste ziekten zijn de onderliggende mechanismen inderdaad complex en verschillende celtypen, onafhankelijke signaalroutes en meerdere sets genen blijken vaak bij te dragen aan een specifiek ziektefenotype. Dit geldt ook voor erfelijke ziekten waarbij de primaire oorzaak een mutatie in één enkel gen is. Met de recente komst van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologieën en genbewerkingstools, is het nu mogelijk om 3D-organoïden en organ-on-chip ziektemodellen te genereren die de in vivo menselijke complexiteit beter kunnen samenvatten 3,4. De ontwikkeling van dergelijke technologieën wordt geassocieerd met een heropleving van de interesse in fenotypische geneesmiddelenontdekking (PDD) -programma's1. PDD kan worden vergeleken met empirische screening, omdat ze niet afhankelijk zijn van kennis van de identiteit van een specifiek geneesmiddeldoelwit of een hypothese over de rol ervan bij de ziekte. De PDD-aanpak wordt nu steeds meer erkend om sterk bij te dragen aan de ontdekking van eersteklas geneesmiddelen5. Omdat de ontwikkeling van menselijke organoïde en organ-on-chip-technologieën nog in de kinderschoenen staat, wordt verwacht dat iPSC-modellen (aangevuld met innovatieve beeldvormings- en machine-learningtools6,7) in de nabije toekomst meerdere nieuwe complexe celgebaseerde ziektemodellen voor geneesmiddelenscreening en bijbehorende PDD-programma's zullen bieden om de slechte productiviteit van de TDD-benadering te overwinnen8, 9.
Hoewel menselijke organoïde- en organ-on-chip-modellen belangrijke inzichten kunnen bieden in de complexiteit van de ziekte en in de identificatie van nieuwe geneesmiddelen, is het brengen van geneesmiddelen in de nieuwe klinische praktijk ook sterk afhankelijk van gegevens uit diermodellen om hun werkzaamheid en veiligheid te beoordelen. Onder hen zijn genetisch gemodificeerde muizen zeker de meest geprefereerde zoogdiermodellen. Ze hebben veel voordelen omdat ze een relatief korte generatietijd hebben voor zoogdieren, veel vergelijkbare fenotypen hebben als menselijke ziekten en gemakkelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd. Ze worden daarom op grote schaal gebruikt in programma's voor het ontdekken van geneesmiddelen10. Het overbruggen van de kloof tussen muizen en mensen blijft echter een belangrijke uitdaging11. De ontwikkeling van in vitro muismodellen die gelijkwaardig zijn aan humane organoïde en organ-on-chip-modellen zou deze leemte ten minste gedeeltelijk kunnen opvullen, omdat het directe vergelijkingen van de werkzaamheid en veiligheid van geneesmiddelen tussen in vivo muis- en in vitro menselijke gegevens mogelijk zal maken.
Hier wordt een vasculaire kiemtest in embryoïde lichamen van muizen (EB's) beschreven. Bloedvaten zijn samengesteld uit endotheelcellen (binnenbekleding van vaatwanden), muurschilderingen (vasculaire gladde spiercellen en pericyten)12. Dit protocol is gebaseerd op de differentiatie van muizenembryonale stamcellen (mESCs) in gevasculariseerde EB's met behulp van hangende druppels die de novo endotheelcel- en muurschilderceldifferentiatie recapituleren13,14. Muis-SER's kunnen gemakkelijk in cultuur worden vastgesteld van geïsoleerde dag 3.5 muisblastocysten met verschillende genetische achtergronden15. Ze bieden ook mogelijkheden voor klonale analyse, afstammingstracering en kunnen gemakkelijk genetisch worden gemanipuleerd om ziektemodellente genereren 13,16.
Omdat bloedvaten alle organen voeden, is het niet verrassend dat veel ziekten, zo niet alle, geassocieerd zijn met veranderingen in de microvasculatuur. In pathologische omstandigheden kunnen endotheelcellen een geactiveerde toestand aannemen of disfunctioneel worden, wat resulteert in de dood van muurschilderingen of migratie weg van bloedvaten. Deze kunnen leiden tot overmatige angiogenese of tot bloedvaten, kunnen een abnormale bloedstroom en een defecte bloedvatbarrière veroorzaken, wat leidt tot extravasatie van immuuncellen en ontsteking12,17,18,19. Onderzoek voor de ontwikkeling van geneesmiddelen die bloedvaten moduleren is daarom hoog, en meerdere moleculaire spelers en concepten zijn al geïdentificeerd voor therapeutische targeting. In deze context is het beschreven protocol bijzonder geschikt voor het bouwen van ziektemodellen en voor het testen van geneesmiddelen, omdat het de belangrijkste kenmerken van in vivo kiemende angiogenese samenvat, waaronder endotheelpunt- en stengelcelselectie, endotheelcelmigratie en -proliferatie, endotheelcelbegeleiding, buisvorming en rekrutering van muurschilderingen. Het vertoont ook overeenkomsten met recent beschreven 3D vasculaire assays op basis van menselijke iPSC-technologieën20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mediavoorbereiding en cultuur van mESC
- Bereid geconditioneerd medium +/- (CM+/-) met behulp van het supplement 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medium met 10% (vol/vol) warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 0,05 mM β-mercaptoethanol, 1x niet-essentiële aminozuren (NEAA 1x), 2 mM L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat.
- Bereid geconditioneerd medium +/+ (CM+/+) met behulp van het supplement CM+/- medium met leukemie remmende factor (LIF) (1.500 E/ml) en 0,1 mM β-mercaptoethanol.
- Bereid geconditioneerd medium +/+ in aanwezigheid van twee remmers (CM+/+ 2i) met behulp van het supplement CM+/+ medium met 1 μM PD0325901 en 3 μM CHIR99021.
- Bereid 0,1% gelatine-oplossing door 25 ml voorverwarmde 2% gelatine-oplossing te mengen in 500 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (DPBS).
- Bereid 10x Trypsine Versene Fosfaat (TVP 10x) buffer door Trypsine (2,5%) te mengen met TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% kippenserum, 0,01% Trypsine (2,5%) in H2O) (1:10 verhouding, vol/vol).
OPMERKING: Filter alle oplossingen door een poriënfilter van 0,22 μm. Bewaar het kweekmedium langdurig bij -20 °C en bewaar andere reagentia gedurende maximaal 3 weken bij 4 °C (zie materiaaltabel). - Bedek twee 12-well celkweekplaten met 0,1% gelatine-oplossing (500 μL per put) en incuber ze gedurende 30 minuten in een CO 2-incubator (37 °C, 5% CO2, vochtige atmosfeer).
- Was de met gelatine beklede platen met PBS en voeg 500 μL CM+/- medium toe.
- Ontdooi twee injectieflacons met 1 x 106 gecryopreserveerde bestraalde muizenembryonale fibroblasten (MEF's) bij 37 °C en breng de celsuspensie over in een conische buis met 5 ml CM+/- medium.
- Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Zuig het medium aan en resuspensie de celpellet voorzichtig in 12 ml CM+/- medium in een concentratie van 1,67 x 105 cellen per ml.
- Zaai 500 μL MEF-suspensie in een 12-well celkweekplaat (2,4 x 105 cellen per cm 2) en incuber de plaat 's nachts (o/n) in een CO2-incubator.
- Ontdooi één injectieflacon met gecryopreserveerde mESCs (1 x 106) in CM+/+ 2i medium.
- Zaai de mESC-suspensie op een voorgewassen plaat met 12 putjes met MEF's in 1 ml CM+/+ 2i medium en breng de plaat over naar een CO 2-incubator. Ververs het medium dagelijks.
- Was bij 70% samenvloeiing de mESC-kolonies met DPBS. Voeg 150 μL warme 10x TVP-buffer toe en incubeer gedurende 30 s bij RT om enzymatische dissociatie te initiëren.
- Verwijder voorzichtig de TVP-buffer, resuspendien de cellen in 1 ml CM+/+ 2i-medium en dissocieer de kolonies in afzonderlijke cellen door voorzichtig pipetteren.
- Passeer de cellen door ze over te brengen naar een nieuwe 12-well celkweekplaat met MEF's (splitsingsverhouding: 1:3-1:5). Meng voorzichtig om de cellen te verdelen en incuber in een CO 2-incubator.
- Ververs het kweekmedium (2-3 ml) en observeer de celgroei/morfologie dagelijks. Herhaal seriële passaging bij 70% confluency om de 2 dagen. Schakel over naar CM+/+ medium gedurende twee passages voordat u celdifferentiatie start.
2. EB-vorming in hangende druppel
- Bereid vers mesodermdifferentiatiemedium door het CM+/- medium aan te vullen met de basisch fibroblastgroeifactor (bFGF) (50 ng·ml-1) en met botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP-4) (5 ng·ml-1) en houd het tot gebruik op 4 °C.
- Bedek een putje van de 6-well celkweekplaat met 500 μL 0,1% gelatine-oplossing en plaats deze gedurende 30 minuten in een CO 2-incubator.
- Was de met gelatine beklede platen met PBS en voeg 500 μL CM+/- medium toe.
- Om een zuivere populatie van mESCs te verkrijgen, trypsiniseert u de celkweekplaat met 10x TVP-buffer gedurende 30 s bij RT, resuspenseert u de cellen in 1 ml mesodermdifferentiatiemedium en brengt u ze vervolgens gedurende 30 minuten over naar de met gelatine gecoate 6-well-plaat, zodat de MEF's zich kunnen hechten terwijl de mESCs in suspensie blijven.
- Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 50 ml en tel de cellen met behulp van een Neubauer-hemocytometer en Trypan-blauwe kleurstof voor een uitsluiting van levende / dode cellen.
- Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant en resuspensie de celpellet in mesodermdifferentiatiemedium tot 4,55 x 104 cellen per ml.
- Vul de bodem van 94 mm polystyreen schaaltjes met lage aanhechting met 15 ml steriel water.
OPMERKING: Vier schalen met hangende druppels (1,6 x 105 cellen in 3,52 ml medium) zijn vereist voor het testen van een bepaalde aandoening met behulp van de 3D-kiemangiogenesetest. - Breng de celsuspensie over in een steriel plastic reservoir en laad vier posities van een meerkanaalspipet met 22 μL celsuspensie per kanaal (1 x 103 cellen per druppel van 22 μL).
- Til het deksel van de 94 mm schotel op en keer het om en plaats het op het schone oppervlak van de stroomkast met de binnenkant naar boven gericht.
- Leg 40 druppels van de celsuspensie op het binnenoppervlak van elk deksel. Keer het deksel voorzichtig om zonder verstoring en plaats het terug op de schaal, zodat de druppels naar het water gericht zijn.
- Incubeer de gerechten in een CO 2-incubator. Beschouw dit als differentiatie dag 0. Houd de platen 4 dagen aan om EB's te vormen.
3. Wedstrijdtest voor de positie van de tipcel
- Kweek één fluorescerende en één niet-fluorescerende mESC-lijn zoals eerder beschreven13. Als voorbeeld worden 7ACS/EYFP mESCs met gele en R1 mESCs gebruikt.
- Bereid mozaïek-EB's voor door gelijke hoeveelheden van de twee mESC-lijnen (1:1-verhouding) te mengen en incuber de hangende druppelschalen in een CO 2-incubator zoals beschreven in stap2 .
4. Drijvende EBs-cultuur voor vasculaire differentiatie
- Voordat u EB's van de hangende druppels verzamelt, bereidt u het volgende voor.
- Bereid 5% agaroplossing in H2O en steriliseer het door autoclaveren (20 min bij 120 °C).
- Gebruik de warme 5% agar-oplossing om G-MEM BHK-21 medium met 1% agar te bereiden en giet snel 3 ml in een van de 60 mm polystyreenschalen. Laat de agar 1 uur stollen bij RT. Bewaar de gerechten bij 4 °C tot gebruik.
- Bereid vers 2x vasculaire differentiatiemedium door het CM+/- medium aan te vullen met bFGF (100 ng·mL-1) en VEGF-A (50 ng·mL-1). Bewaar het medium bij 4 °C tot gebruik.
- Verzamel de hangende druppels in een conische buis van 15 ml met behulp van een P1000-pipet en verwijder het supernatant na een paar minuten EB-bezinking.
- Resuspensie van de EB's in 3 ml 2x vasculair differentiatiemedium, breng de EB-suspensie over naar één met agar gecoate schaal en verdeel de EB's homogeen om aggregatie te voorkomen.
- Incubeer de gerechten in CO 2-incubator en ververs het medium elke2 dagen tot dag 9 met behulp van 1x vasculair differentiatiemedium in aanwezigheid van bFGF (50 ng · mL-1) en VEGF-A (25 ng · mL-1).
- U kunt ook van bloedplaatjes afgeleide groeifactor-BB (PDGF-BB) (10 ng·ml-1 op dag 4 en 5 ng·ml-1 op dag 6 en dag 8) toevoegen aan het vasculaire differentiatiemedium om de differentiatie van murale cellen te bevorderen.
5. Flowcytometrie analyse
- Verzamel de 9 dagen oude EB's in een conische buis van 15 ml met behulp van een P1000-pipet en was ze eenmaal met warme PBS.
- Voeg 1 ml G-MEM BHK-21 medium toe dat 0,2 mg·ml-1 collagenase A bevat en incuber de cellen gedurende 5 minuten in een CO 2-incubator.
- Dissocieer de EB's door voorzichtig op en neer te pipetten met een P1000-pipet.
- Stop de collagenase-activiteit door 1 ml koud G-MEM BHK-21-medium met 10% FBS toe te voegen.
- Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Resuspendeer de cellen in 500 μL PBS met 2% FBS.
- Tel de cellen met behulp van een Neubauer hemocytometer.
- Resuspendeer 400.000 cellen in 100 μL PBS met 2% FBS per kleuringsconditie.
- Incubeer de cellen gedurende 45 minuten bij 4 °C met de volgende antilichamen: APC-geconjugeerd antimuis PECAM-1-antilichaam bij ratten (kloon MEC13.3) en FITC-geconjugeerde antimuis CD45 bij ratten (kloon 30-F11) of isotypecontroleantistoffen.
- Was de cellen tweemaal met 1 ml PBS met 2% FBS.
- Resuspendeer de cellen om een uiteindelijke concentratie van 5 x 106 cellen per ml te bereiken.
- Filter de cellen met behulp van een polystyreen reageerbuis met ronde bodem, met een klikdop van een celzeef.
- Analyseer 20.000 PECAM-1 (+) gebeurtenissen door middel van flowcytometrie.
6.3D kiemende angiogenesetest en immunofluorescentiekleuring
- Bereid op dag 9 een kiemmedium door toevoeging van 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·ml-1), VEGF-A (25 ng·ml-1), humaan recombinant erytropoëtine (hEPO) (20 ng·ml-1), humaan interleukine-6 (IL-6) (10 ng·ml-1), 0,05 mM β-mercaptoethanol, NEAA (1x), L-glutamine (1x), natriumpyruvaat (1x), collageen van rattenstaarten type I (1,25 mg·ml-1), en NaOH (3,1 mM) naar GMEM BHK-1 medium.
- Om collageen gelatie te voorkomen, houdt u het kiemmedium op ijs tot gebruik.
- Om het effect van pro/anti-angiogene moleculen te evalueren, voegt u het geselecteerde geneesmiddel of medium toe aan het kiemmedium in de geselecteerde concentratie.
- Verzamel 9 dagen oude EB's uit een agarschaal van 60 mm in een conische buis van 15 ml (equivalent aan één voorwaarde) en verwijder het supernatant na een paar minuten sedimentatie.
- Bedek de bodem van een kweekschaal van 35 mm met 1 ml van het kiemmedium en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C om gelatie op te wekken.
- Resuspendie van de EB's in 2 ml koud kiemmedium.
- Breng de suspensie over in de 35 mm kweekschaal bedekt met de eerste laag kiemmedium.
- Verdeel de EB's over de hele plaat en zorg ervoor dat ze op gelijke afstand van elkaar staan. Incubeer de schaal in een CO 2-incubator. De eerste kiemvorming vindt plaats binnen 24-48 uur.
- Op dag 12 wordt de collageengel met EB's voorzichtig overgebracht naar een glasplaat (75 x 26 mm) met behulp van een spatel.
- Verwijder de overtollige vloeistof met een pipet (P1000) en droog de gel uit door een gaasje nylon en absorberende filterkaarten (gelblottingpapier) op de gel te leggen. Oefen druk uit door gedurende 2 minuten een gewicht (250 g) te plaatsen. Verwijder voorzichtig het nylon/filterpapier en laat de dia's 30 minuten aan de lucht drogen bij RT.
- Was de dia's drie keer met PBS gedurende 5 minuten bij RT.
- Bevestig de EB's met behulp van zinkoplossing (zie materiaaltabel) o/n bij 4 °C. U kunt ook de mozaïek fluorescerende EB's fixeren met Paraformaldehyde (PFA) (4%) o/n bij 4 °C in het donker.
- Verwijder het fixatief. Was de dia's vijf keer met PBS gedurende 5 minuten bij RT.
- Permeabiliseer de EB's in PBS met 0,1% Triton-X100 gedurende 15 minuten bij RT.
- Verwijder de permeabilisatieoplossing. Was de dia's vijf keer met PBS gedurende 5 minuten.
- Incubeer de EB's in de blokkeringsbuffer (PBS met 2% Bovine Serum Albumin, BSA) gedurende 1 uur bij RT.
- Om de endotheelspruiten te kleuren, gebruikt u een antimuis anti-PECAM-1 primair antilichaam bij ratten (1:100 verdunning) in blokkeringsbuffer o/n bij 4 °C.
- Was de dia's vijf keer met PBS gedurende 5 minuten.
- Incubeer de dia's met geiten anti-rat Alexa 555 secundair antilichaam in blokkerende buffer (1:250 verdunning) en indien nodig, met FITC-geconjugeerd anti-α-SMA antilichaam in blokkerende buffer (1:250 verdunning) om muurschilderingscellen gedurende 2 uur bij RT in het donker te kleuren.
- Was de dia's drie keer met PBS gedurende 5 minuten en één keer met H20 voordat u ze monteert.
7. Confocale beeldvorming, morfometrische en kwantitatieve analyse van EB-endotheelspruiten
- Verkrijg beelden met hoge resolutie van de immunogekleurde EB's door samenvoeging van het brandpuntsvlak (z-stacking) met behulp van een confocale microscoop. Gebruik een vergrotingsobjectief van 10x om hele EB's in beeld te brengen.
- Analyseer de beelden verkregen met behulp van ImageJ om de morfologie te evalueren en kwantificeer de kenmerken van PECAM-1 positieve endotheelspruiten volgens gevestigde kwantificeringsmethoden13,14,21.
- Bereken het gemiddelde aantal endotheelspruiten per EB door handmatig het totale kiemgetal per individuele EB te tellen.
- Meet de afzonderlijke spruitlengtes met het tekengereedschap ImageJ. Definieer de basis van de endotheelspruit vanaf het EB-kerngebied en teken handmatig een lijn tot het uiteinde van de spruitpunt.
- Bereken het gemiddelde aantal tipcellen per spruit door handmatig het aantal tipcellen per individuele spruit te tellen en bereken vervolgens het gemiddelde per EB.
- Bereken de filopodia-oriëntatie door handmatig de as van de ouderspruit te bepalen en meet de scherpe hoek ertussen met behulp van het beeldJ-softwarehoekgereedschap. Bereken het aantal spruiten met een oriëntatie >50 ° en deel het door het totale aantal spruiten van de EB van belang.
OPMERKING: De hoeken varieerden altijd van 0° tot 90°.
- Verkrijg beelden met hoge resolutie van de immunogekleurde EB's met behulp van een confocale microscoop. Gebruik een vergrotingsobjectief van 40x om afbeeldingen met een hoge resolutie van enkele endotheelspruiten te realiseren.
- Kwantificeer de vaatdekking van PECAM-1-positieve EC-spruiten omringd door α-SMA-positieve MC's met behulp van de ImageJ-software.
- Splits de samengevoegde afbeeldingen in afzonderlijke rode en groene kanalen.
- Converteer de afbeeldingen naar de binaire vorm.
- Meet het totale cellulaire gebied van de spruit dat afzonderlijk wordt ingenomen door PECAM-1 (endotheelcellen gelabeld in rood) en door α-SMA (muurschilderingscellen gelabeld in groen) positieve cellen.
- Genereer de samengevoegde afbeelding met behulp van de functie afbeeldingscalculator en de operator AND. Meet het totale cellulaire gebied van de afbeelding. Om de dekking te berekenen, deelt u het gebied van de gecolokaliseerde afbeelding door de oppervlakte van de pecam-1 binaire afbeelding.
- Om de celcompetitie voor endotheeltip / stengelcelpositie van spruiten ontwikkeld door mozaïek-EB's te analyseren, scoort u handmatig het aantal tipcellen en markeert u hun genotypische oorsprong op basis van het fluorescentiesignaal. Bereken de gemiddelde waarden per EB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocoloverzicht van de bloedvatkiemtest is weergegeven in figuur 1. Negen dagen oude EB's afgeleid van drie onafhankelijke 129 / Ola mESC-lijnen (Z / Red, R1 en E14) werden enzymatisch gedissocieerd in enkele cellen met behulp van collagenase A. Cellen werden gekleurd voor PECAM-1 en geanalyseerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) zoals beschreven. Alle cellijnen vertoonden robuuste endotheeldifferentiatie en er werden geen verschillen waargenomen in hun vermogen om te differentiëren in endotheelcellen. Alle cellijnen produceerden ongeveer 10,5% ± 1,3% endotheelcellen (figuur 2A). De relatieve expressieniveaus van PAN-endoteliale celmarkers in de PECAM-1 (+) celpopulaties werden ook gekwantificeerd. De mRNA-expressieniveaus van alle geanalyseerde markers (Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2 en Cdh5) waren vergelijkbaar tussen de cellijnen en de experimenten, wat de robuustheid van het differentiatieprotocol bevestigde (figuur 2B). PECAM-1 (+) celpopulaties drukten alleen zeer lage mRNA-niveaus van arteriële (Notch1 en Efnb2) of veneuze (Couptf2 en Ephb4) markers die de relatief onvolgroeide toestand van de endotheelcellen ondersteunen die door het protocol werden gegenereerd (figuur 2C).
Het vermogen van het vasculaire kiemende EB-model om te screenen op geneesmiddelen die angiogenese moduleren, werd vervolgens aangetoond (figuur 3). DC101 en DAPT (N-[N-(3,5-difluorfenacetyl)-Lalanyl]-S-fenylglycine t-butylester) werden getest. Deze verbindingen worden veel gebruikt bij muizen om respectievelijk angiogenese te blokkeren door VEGFR2-activiteit te remmen of om endotheelpuntceldifferentiatie en de vorming van een dichte vasculaire plexus te bevorderen door zich te richten op Notch-signalering (figuur 3A). Zowel VEGF- als Notch-signaleringsroutes zijn belangrijke regulatoren van kiemende angiogenese in vivo. De effecten van verschillende concentraties van DC101 en DAPT in EB's verguld in collageen I werden geëvalueerd. Hoge doses DC101 variërend van 6-30 mg· L-1 remde zowel het aantal als de lengte van de vaatspruiten, terwijl DAPT tegengestelde effecten had bij de dosis van 1 μmol. L-1 (figuur 3B-C). Hoge vergrotingsfoto's van de vatspruiten gekleurd voor PECAM-1 van EB's gekweekt in aanwezigheid van DAPT worden ook verstrekt (figuur 3D). DAPT zelfs bij lage doses variërend van 0,5-1 μmol· L-1 verhoogde sterk het aantal endotheelpuntcellen met vaatspruiten die een misleidend fenotype hadden (figuur 3D-F). Hoge dosis DAPT leidde ook tot vatcoalescentie en de vorming van grote en platte endotheelcelgebieden zonder organisatie (figuur 3A). De resultaten bevestigden het vermogen van het model om geneesmiddelen te testen die angiogenese bevorderen of remmen.
Om te bevestigen dat dit model geschikt is voor het nabootsen van vaatziekten, worden de confocale beelden van EB's afgeleid van Acvrl1+/- mESCs verstrekt. Het Acvrl1-gen codeert voor ALK1 (Activin Receptor-like Kinase 1), een receptor die specifiek tot expressie komt in endotheelcellen en die, indien gemuteerd, verantwoordelijk is voor de ontwikkeling van een vasculaire zeldzame ziekte met angiodysplasie genaamd Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT). Een hoge vergrotingsfoto van de Acvrl1+/- endotheelspruiten onthulde dat ze meer endotheelpuntcellen en meer takken per spruit hadden die zich onder willekeurige hoeken ten opzichte van de oudervaten bevonden. Deze bevestigden in vitro een misleidend fenotype zoals waargenomen bij HHT-muizen (figuur 4).
Door chimere EB's te vormen die gedifferentieerde mESC fluorescerend gelabeld en mESC van een bepaald genotype bevatten, is een alternatief protocol opgenomen om het proces van endotheelpuntselectie te bestuderen (figuur 5A-C). Een confocale afbeelding van PECAM-1 gelabelde vaatspruiten identificeerde de genotypische oorsprong van de leidende endotheelpuntcellen (figuur 5B). Mengsels van een wild-type YFP (geel fluorescerend eiwit) mESC-lijn in een verhouding van 1:1 met één ongelabelde mESC wild-type lijn leidden consequent tot de gelijke bijdrage van elke populatie aan de leidende endotheelpuntcellen (figuur 5C).
Dit protocol is ook geschikt voor het kwantificeren van muurschilderingceldekking van de vaatkiem. EB's die angiogenese ondergaan, werden gefixeerd en gekleurd voor PECAM-1 (endotheelcellen, rood) en voor α-Smooth Muscle Actin (α-SMA) (muurschilderingen, groen) (figuur 5D). Een hoge vergrotingsafbeelding onthulde hoe een individuele vatspruit werd omringd door muurschilderingscellen (figuur 5E, links). Binaire transformatie werd uitgevoerd na kleurkanaalscheiding (figuur F-G) om de verhouding van PECAM-1 (+) vat bedekt door α-SMA (+) muurschilderingscellen te kwantificeren met behulp van de ImageJ-software (figuur 5H).
Figuur 1: Tijdlijn van de protocolprocedures. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van EC's afgeleid van mESC vasculaire differentiatie binnen EB's. (A) Flowcytometrische analyse van CD31-expressie van 9 dagen oude EB's en kwantificering van het percentage Pecam-1 (+) cellen. (B-D) mRNA-expressieniveaus van Pecam-1, Flk1, Flt1, Flt4, Eng, Tie2, Cdh5, Notch1, EfnB2, Couptf2 en EphB4 in gesorteerde endotheelcellen van 9 dagen oude EB's. Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: 3D kiemende angiogenese assay voor drugstesten. (A) Confocale beelden van drie representatieve EB's gekleurd voor Pecam-1 (witte, endotheelcellen) behandeld met alleen een medium, DAPT (0,5 μmol· L-1, 1,0 μmol· L-1, 5,0 μmol· L-1) of DC101 (3 mg· L-1, 6 mg· L-1, 30 mg· L-1). (B) Kwantificering van het aantal kiemgroenten per EB. (C) Kwantificering van de kiemlengte. (D) Op het linkerbovenpaneel, hoge vergroting van de endotheelspruit met de netwerkcomplexiteit en het vertakkingspunt dat op twee verschillende lagen van dezelfde EB telt, op het linkeronderpaneel een schematische illustratie die de meetmethode van de endotheelspruitoriëntatie weergeeft. Op het paneel rechtsboven, hoge vergroting van endotheelspruiten alleen uit het voertuig en op het rechteronderpaneel, hoge vergroting van endotheelspruiten van DAPT (0,5 μmol· L-1) toestand. (E) Kwantificering van het aantal tipcellen per spruit. (F) Kwantificering van het percentage filopodia binnen hoek >50°. Alle staven vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM- en p-waarden van ongepaarde, eenrichtings-ANOVA-test. ns = niet-significant, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 en ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Defect bloedvat ontkiemt in erfelijke hemorragische teleangiëctasieën EB's. Op het bovenste paneel, confocale beelden van representatieve 12 dagen oude EB's van Acvrl1 +/+ en Acvrl1 + / - genotypen gekleurd voor Pecam-1 (witte, endotheelcellen). Op het onderste paneel, hoge vergroting van Acvrl1 +/- endotheelspruiten (witte doos van bovenpaneel) met talrijke tipcellen (rode pijlen), endotheeltakpunten (blauwe stippen) en ontkiemend misleidingsfenotype (groene pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het bestuderen van de positie van tip/stengelcellen en de rijping van het vat met behulp van de 3D-kiemtest. (A) Confocale afbeelding van een representatieve 12 dagen oude chimere EB gemaakt van R1 wild-type cellijn gemengd 1:1 met 7ACS / EYFP wild-type cellijn gekleurd voor Pecam-1 (rode, endotheelcellen). Rode pijlen geven tipcellen van de R1-cellijn aan en groene pijlen geven tipcellen van 7ACS/EYFP-cellijn aan. (B) Hoge vergroting van een endotheelspruit die de verdeling van R1 en 7ACS/EYFP endotheelcel langs de spruit laat zien. (C) Kwantificering van de relatieve genotyperingstipcellen van representatieve wild-type EB's. (D) Confocale afbeelding van een representatieve 12 dagen oude EB gekleurd voor Pecam-1 (rode, endotheelcellen) en α-SMA (groene, muurschilderingscellen). (E) Hoge vergroting van een endotheelspruit (witte rechthoekige gestippelde doos van D) met interactie tussen muurschildering en endotheelcellen. (F-G) Afbeeldingen van de gekleurde endotheelspruit en de bijbehorende binaire getransformeerde beelden. (H) Binair beeld van co-gelokaliseerde Pecam-1 en α-SMA kleuring. Verhouding van endotheelcelspruiten bedekt met muurschilderingen. Alle balken vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een onbevooroordeelde, robuuste en reproduceerbare 3D EB-gebaseerde vasculaire kiemtest die vatbaar is voor screening op geneesmiddelen en genen die angiogenese moduleren. Deze methode biedt voordelen ten opzichte van veel veelgebruikte tweedimensionale (2D) assays met behulp van endotheelcelculturen zoals Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) om migratie te monitoren (laterale scratch assay of de Boyden chamber assay)22,23 of proliferatie (celnummer tellen, detectie van DNA-synthese, detectie van proliferatiemarkers of metabole assays)24 omdat het op unieke wijze de studie van zowel endotheel- als muurceldifferentiatie en hun organisatie in een vasculair netwerk mogelijk maakt dat belangrijke stappen van ontkiemende angiogenese nabootst. Deze stappen omvatten de selectie van endotheelcellen, proliferatie van de stengelcellen, ruimtelijke oriëntatie en migratie van de vaatspruit en de rekrutering van muurschilderingen naar het ontluikende bloedvat25. Het biedt ook voordelen voor veel 3D-angiogenesemodellen. De fibrinekraal 26,27 of collageengeltest28,29,30 die de tubulogenese nabootst, gebruikt gewoonlijk HUVECs of Endothelial Colony Forming Cells derived Endothelial Cells (ECFC-EC) omdat ze een hoge proliferatieve snelheid hebben, maar niet geschikt zijn voor primaire endotheelcellen van muizen die moeilijk te onderhouden zijn in cultuur. De ex vivo retina explant31 of gevasculariseerde micro-orgaantest32 kan alle stappen voor de vorming van bloedvaten goed samenvatten, maar ze hebben complexe experimentele procedures en zijn niet geschikt voor geneesmiddelen met een hoge doorvoer of genetische screening. Dit geldt ook voor de ex vivo aortaringtest 33,34 en voor veel in vivo assays zoals tumorimplantaten bij muizen of functieverliesstudies bij muizen die vaak hoge kosten en moeilijkheden hebben bij het verkrijgen van grote hoeveelheden gegevens 35. Dit protocol vormt ook een mooie aanvulling op soortgelijke in vitro angiogenese-assays met behulp van menselijke iPSC's die vergelijkingen tussen muis- en menselijke gegevens mogelijk maken. Hoewel het belangrijk is op te merken dat menselijke iPSC-afgeleide endotheelcellen minder vermogen vertonen om te ontkiemen dan de muizencellen36,37.
De hier ontwikkelde methode heeft ook enkele beperkingen. Het kan de effecten van vloeistofstroom op bloedvatrijping, vaatdoorlaatbaarheid niet evalueren en produceert geen ontluikend bloedvat in een specifieke weefselomgeving in vergelijking met recente microgefabriceerde apparaten die in ontwikkeling zijn. Inderdaad, organ-on-chip-technologieën die microfluïdica combineren met tissue engineering kunnen gekweekte endotheelcellen voorzien van een micro-omgeving die vergelijkbaar is met die in vivo38,39. Microfluïdische systemen bevatten de juiste extracellulaire matrixsamenstelling en zijn ontworpen om mechanische signalen zoals schuifspanning te produceren. Sommige zijn ontworpen om muurschilderingen en andere ondersteunende cellen van een bepaald weefsel op te nemen of kunnen chemische gradiënten genereren. Ze bevatten netwerken van met micron gevulde vloeistofkanalen die qua grootte en structuur vergelijkbaar zijn met de bloedcapillairen. De organ-on-chip-technologieën maken ook de kwantificering van specifieke vasculaire functies mogelijk, waaronder de permeabiliteit en de trans-endotheliale elektrische weerstand. Hoewel organ-on-chip-technologieën veelbelovend zijn, gaan ze de onderzoeksexpertise van de meeste biologielaboratoria ver te boven, hebben ze nog steeds een goede standaardisatie nodig en vereisen ze gespecialiseerde fabricagetechnieken. De commercialisering van de productie van organ-on-chip-technologie is nog maar net begonnen en deze systemen worden op dit moment als onbetaalbaar beschouwd voor farmaceutische bedrijven40,41.
Er zijn verschillende kritieke stappen waarmee rekening moet worden gehouden. Gebruik hoogwaardige cellen die robuust goed geaccepteerde markers (Nanog, Oct4, Sox2 en SSEA-1) van de pluripotente toestand tot expressie brengen. Het is essentieel om hun groei, mES-celvorm en de grootte en morfologie van mES-kolonies zorgvuldig te volgen. Omdat karyotypische stabiliteit stochastisch is in gekweekte cellen, is het essentieel om het opnieuw te beoordelen na uitgebreide passaging. Het wordt aanbevolen om producten te gebruiken die al zijn getest op mESC-cultuur en MEF-feeders, foetaal kalfsserum en alle chemische verbindingen gedurende verschillende passages te testen om te detecteren of mESCs hun cellulaire eigenschappen behouden of dat ze differentiëren of een epiblastisch fenotype krijgen. Het medium moet dagelijks worden ververst en mESC-kolonies mogen niet te groot en dicht worden. Ten slotte moeten mESCs ten minste gedurende twee passages zonder 2i vóór differentiatie worden gekweekt om de beste opbrengst van endotheelcellen te garanderen.
De endotheeldifferentiatie omvat twee belangrijke stappen: de vorming van EB's met behulp van de hangende druppelmethode en hun cultuur onder drijvende omstandigheden in aanwezigheid van vasculair differentiatiemedium13,14. Beweging van de hangende druppelschotels moet worden geminimaliseerd om een uniforme celaggregatie te bereiken. Het aantal mESCs dat wordt gebruikt om een aggregaat te vormen, varieert in de meeste gevallen tussen 800-1.000 cellen, maar het moet mogelijk worden geoptimaliseerd als mESCs een andere genetische achtergrond hebben dan 129 / ola om een optimale differentiatie in gevasculariseerde EB's te garanderen. Wanneer EB's onder drijvende omstandigheden worden gekweekt, moeten ze zorgvuldig worden verdeeld en beweging vermijden die EB-klontering bevordert.
EB's worden uiteindelijk gekweekt in collageen I-gel om vaatspruiten te vormen. Angiogeen medium moet vers worden bereid en eenmaal gemengd met collageen moet ik op ijs worden gehouden om spontane gelatie te voorkomen. In het geval van drugstests worden tijdens deze stap geneesmiddelen in de juiste concentratie in het koude mengsel toegevoegd. Het aanpassen van de pH met NaOH voordat de EB's opnieuw worden gesuspendeerd is cruciaal, anders zal de collageenzuurgraad celtoxiciteit veroorzaken. Ten slotte moeten EB's op gelijke afstand van elkaar worden verspreid om reproduceerbare resultaten te garanderen.
Kortom, deze methode introduceert een 3D vasculaire kiemtest op basis van mESC die de vereiste robuustheid en schaalbaarheid heeft om te worden gebruikt voor genetische screening zoals onlangs beschreven door Elling U. et al. dat genereerde een grote haplobank van hemi/homozygote mutant mESC16 en voor fenotypisch medicijnontdekkingsprogramma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND en door de Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ?secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
References
- Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
- Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
- Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A.
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
- Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
- Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
- Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
- Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).
- Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
- Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
- Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G.
- Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
- Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
- van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).
- Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
- Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
- Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
- Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
- Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
- Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, Clifton, N.J. 325-344 (2017).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
- Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
- Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).
- Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).
- Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), Basel, Switzerland. 17 (2020).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
