הדמיה של היווצרות קפלים בממברנה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת
Summary
מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי שמור מאוד שהחל על ידי היווצרות של הקרנות ממברנה דמויות יריעות F-אקטין, הידועות גם בשם קפלים ממברנה. שיעור מוגבר של הפנמה מקרופינוציטוטית של מומסים היה מעורב במצבים פתולוגיים שונים. פרוטוקול זה מציג שיטה לכימות היווצרות קפלים בקרום במבחנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
Abstract
תפיחת ממברנה היא היווצרות של בליטות קרום פלזמה תנועתיות המכילות רשת של חוטי אקטין פולימריים חדשים. קפלים ממברנה עשויים להיווצר באופן ספונטני או בתגובה לגורמי גדילה, ציטוקינים דלקתיים ואסטרי פורבול. חלק מבליטות הממברנה עשויות להתארגן מחדש לקפלי ממברנה עגולים המתמזגים בשוליים הדיסטליים שלהם ויוצרים כוסות שנסגרות ונפרדות לתוך הציטופלסמה כשקעים גדולים והטרוגניים הנקראים מקרופינוזומים. במהלך התהליך, קפלים לוכדים נוזל חוץ-תאי ומומסים שמפנימים בתוך מקרופינוזומים. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה (SEM) היא טכניקת הדמיה נפוצה להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים של ממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות סגורות על פני התא. הפרוטוקול הבא מתאר את תנאי תרבית התאים, את הגירוי של היווצרות קפל הממברנה במבחנה, וכיצד לתקן, לייבש ולהכין תאים להדמיה באמצעות SEM. מתוארים גם כימות של רפרוף ממברנה, נורמליזציה של נתונים, וממריצים ומעכבים של היווצרות קפלים בממברנה. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידה של מקרופינוציטוזה בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, לחקור מטרות חדשות המווסתות את היווצרותם של ממברנות, ולזהות מגרים פיזיולוגיים שעדיין אינם אופייניים, כמו גם מעכבים פרמקולוגיים חדשניים של מקרופינוציטוזה.
Introduction
מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי האחראי על הפנמת כמות גדולה של נוזל חוץ-תאי ותכולתו באמצעות היווצרות של בליטות ממברנת פלזמה דינמיות ומונעות אקטין הנקראות קפלים ממברנה1. רבים מקפלי הממברנה האלה יוצרים כוסות שנסגרות ומתמזגות בחזרה אל התא ונפרדות מקרום הפלזמה כאנדוזומים תוך-תאיים גדולים והטרוגניים הידועים גם בשם מקרופינוזומים1. למרות שמקרופינוציטוזה מושרית על ידי גורמי גדילה כגון גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) וגורם גדילה אפידרמלי (EGF) במגוון רחב של סוגי תאים, תהליך ייחודי נוסף, תלוי סידן, המכונה מקרופינוציטוזה מכוננת נצפה גם בתאי חיסון מולדים 2,3,4,5,6,7,8.
הודגם כי יכולתם של תאים להפנים חומר חוץ-תאי באמצעות מקרופינוציטוזה ממלאת תפקיד חשוב במגוון תהליכים פיזיולוגיים, החל מספיגת חומרים מזינים וכלה בלכידת פתוגנים והצגת אנטיגן 9,10,11. עם זאת, מכיוון שתהליך זה אינו סלקטיבי ובלתי ניתן להשראה, הוא גם היה מעורב במספר מצבים פתולוגיים. ואכן, מחקרים קודמים הציעו כי מקרופינוציטוזה ממלאת תפקיד חשוב במחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סרטן, נפרוליתיאזיס וטרשת עורקים 12,13,14,15,16. יתר על כן, חיידקים ווירוסים מסוימים הראו שהם משתמשים במקרופינוציטוזה כדי להיכנס לתאים המארחים ולגרום לזיהום17,18. מעניין, גירוי של macropinocytosis יכול להיות מנוצל גם עבור משלוח ממוקד של סוכנים טיפוליים במצבי מחלה שונים19,20.
מחקרים קודמים בחנו מקרופינוציטוזה על ידי כימות סמני פאזה נוזלית מופנמים המתויגים באופן פלואורסצנטי בהיעדר ונוכחות של חומרים פרמקולוגיים המעכבים מקרופינוציטוזה באמצעות ציטומטריה של זרימה והדמיה קונפוקלית21,22. כלים פרמקולוגיים זמינים כיום המעכבים מקרופינוציטוזה מוגבלים ומורכבים מ-1) מעכבי פילמור אקטין (ציטוכלאסין D ולטרונקולין), 2) חוסמי PI3K (LY-290042 ו-wortmannin) ו-3) מעכבי מעכבי נתרן ממחליפי מימן (NHE) (אמילוריד ו-EIPA)5,14,15,23,24,25 . עם זאת, מכיוון שלעכבים אלה יש השפעות עצמאיות של אנדוציטוזה, קשה לקבוע באופן סלקטיבי את תרומתה של מקרופינוציטוזה להמסת ספיגה ופתוגנזה של מחלה במיוחד in vivo21.
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הוא סוג של מיקרוסקופ אלקטרונים המפיק תמונות ברזולוציה גבוהה במיוחד של תאים באמצעות קרן ממוקדת של אלקטרונים26. במחקר מקרופינוציטוזה, הדמיית SEM נחשבת לטכניקת תקן הזהב כדי להמחיש מאפיינים טופוגרפיים ומורפולוגיים של קרום הפלזמה, לכמת את היווצרות הקפלים של הממברנה ולחקור את התקדמותם לקראת הפנמה של מקרופינוזום. יתר על כן, סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים בשילוב עם כימות ספיגת המומס, בנוכחותם ובהיעדר חוסמי מקרופינוציטוזה, מספקת אסטרטגיה אמינה לבחינת הפנמה מקרופינוציטוטית במבחנה. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט כיצד להכין תאים ל-SEM, לדמיין את פני התא, לכמת את היווצרות הקפלים ולבחון את התקדמותם לקראת סגירת כוסות והפנמה של מקרופינוזום.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול ההדמיה הנוכחי של SEM מספק כלי להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים בממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות על פני התא במבחנה. אף על פי שהפרוטוקול הנוכחי מתמקד במקרופאג’ים, מחקרים הראו כי היווצרות קפלים בממברנה מתרחשת גם בסוגי תאים שונים אחרים, כולל תאים דנדריטיים, פיברובלס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לליבי פרי (אוניברסיטת אוגוסטה) על עזרתה בהכנת הדגימה של SEM. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R01HL139562 (G.C.) ו- K99HL146954 (B.S.)] ואיגוד הלב האמריקאי [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | |||
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts. Bio- Protocols. 9 (10), (2019).
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
