מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי שמור מאוד שהחל על ידי היווצרות של הקרנות ממברנה דמויות יריעות F-אקטין, הידועות גם בשם קפלים ממברנה. שיעור מוגבר של הפנמה מקרופינוציטוטית של מומסים היה מעורב במצבים פתולוגיים שונים. פרוטוקול זה מציג שיטה לכימות היווצרות קפלים בקרום במבחנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
תפיחת ממברנה היא היווצרות של בליטות קרום פלזמה תנועתיות המכילות רשת של חוטי אקטין פולימריים חדשים. קפלים ממברנה עשויים להיווצר באופן ספונטני או בתגובה לגורמי גדילה, ציטוקינים דלקתיים ואסטרי פורבול. חלק מבליטות הממברנה עשויות להתארגן מחדש לקפלי ממברנה עגולים המתמזגים בשוליים הדיסטליים שלהם ויוצרים כוסות שנסגרות ונפרדות לתוך הציטופלסמה כשקעים גדולים והטרוגניים הנקראים מקרופינוזומים. במהלך התהליך, קפלים לוכדים נוזל חוץ-תאי ומומסים שמפנימים בתוך מקרופינוזומים. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה (SEM) היא טכניקת הדמיה נפוצה להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים של ממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות סגורות על פני התא. הפרוטוקול הבא מתאר את תנאי תרבית התאים, את הגירוי של היווצרות קפל הממברנה במבחנה, וכיצד לתקן, לייבש ולהכין תאים להדמיה באמצעות SEM. מתוארים גם כימות של רפרוף ממברנה, נורמליזציה של נתונים, וממריצים ומעכבים של היווצרות קפלים בממברנה. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידה של מקרופינוציטוזה בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, לחקור מטרות חדשות המווסתות את היווצרותם של ממברנות, ולזהות מגרים פיזיולוגיים שעדיין אינם אופייניים, כמו גם מעכבים פרמקולוגיים חדשניים של מקרופינוציטוזה.
מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי האחראי על הפנמת כמות גדולה של נוזל חוץ-תאי ותכולתו באמצעות היווצרות של בליטות ממברנת פלזמה דינמיות ומונעות אקטין הנקראות קפלים ממברנה1. רבים מקפלי הממברנה האלה יוצרים כוסות שנסגרות ומתמזגות בחזרה אל התא ונפרדות מקרום הפלזמה כאנדוזומים תוך-תאיים גדולים והטרוגניים הידועים גם בשם מקרופינוזומים1. למרות שמקרופינוציטוזה מושרית על ידי גורמי גדילה כגון גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) וגורם גדילה אפידרמלי (EGF) במגוון רחב של סוגי תאים, תהליך ייחודי נוסף, תלוי סידן, המכונה מקרופינוציטוזה מכוננת נצפה גם בתאי חיסון מולדים 2,3,4,5,6,7,8.
הודגם כי יכולתם של תאים להפנים חומר חוץ-תאי באמצעות מקרופינוציטוזה ממלאת תפקיד חשוב במגוון תהליכים פיזיולוגיים, החל מספיגת חומרים מזינים וכלה בלכידת פתוגנים והצגת אנטיגן 9,10,11. עם זאת, מכיוון שתהליך זה אינו סלקטיבי ובלתי ניתן להשראה, הוא גם היה מעורב במספר מצבים פתולוגיים. ואכן, מחקרים קודמים הציעו כי מקרופינוציטוזה ממלאת תפקיד חשוב במחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סרטן, נפרוליתיאזיס וטרשת עורקים 12,13,14,15,16. יתר על כן, חיידקים ווירוסים מסוימים הראו שהם משתמשים במקרופינוציטוזה כדי להיכנס לתאים המארחים ולגרום לזיהום17,18. מעניין, גירוי של macropinocytosis יכול להיות מנוצל גם עבור משלוח ממוקד של סוכנים טיפוליים במצבי מחלה שונים19,20.
מחקרים קודמים בחנו מקרופינוציטוזה על ידי כימות סמני פאזה נוזלית מופנמים המתויגים באופן פלואורסצנטי בהיעדר ונוכחות של חומרים פרמקולוגיים המעכבים מקרופינוציטוזה באמצעות ציטומטריה של זרימה והדמיה קונפוקלית21,22. כלים פרמקולוגיים זמינים כיום המעכבים מקרופינוציטוזה מוגבלים ומורכבים מ-1) מעכבי פילמור אקטין (ציטוכלאסין D ולטרונקולין), 2) חוסמי PI3K (LY-290042 ו-wortmannin) ו-3) מעכבי מעכבי נתרן ממחליפי מימן (NHE) (אמילוריד ו-EIPA)5,14,15,23,24,25 . עם זאת, מכיוון שלעכבים אלה יש השפעות עצמאיות של אנדוציטוזה, קשה לקבוע באופן סלקטיבי את תרומתה של מקרופינוציטוזה להמסת ספיגה ופתוגנזה של מחלה במיוחד in vivo21.
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הוא סוג של מיקרוסקופ אלקטרונים המפיק תמונות ברזולוציה גבוהה במיוחד של תאים באמצעות קרן ממוקדת של אלקטרונים26. במחקר מקרופינוציטוזה, הדמיית SEM נחשבת לטכניקת תקן הזהב כדי להמחיש מאפיינים טופוגרפיים ומורפולוגיים של קרום הפלזמה, לכמת את היווצרות הקפלים של הממברנה ולחקור את התקדמותם לקראת הפנמה של מקרופינוזום. יתר על כן, סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים בשילוב עם כימות ספיגת המומס, בנוכחותם ובהיעדר חוסמי מקרופינוציטוזה, מספקת אסטרטגיה אמינה לבחינת הפנמה מקרופינוציטוטית במבחנה. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט כיצד להכין תאים ל-SEM, לדמיין את פני התא, לכמת את היווצרות הקפלים ולבחון את התקדמותם לקראת סגירת כוסות והפנמה של מקרופינוזום.
פרוטוקול ההדמיה הנוכחי של SEM מספק כלי להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים בממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות על פני התא במבחנה. אף על פי שהפרוטוקול הנוכחי מתמקד במקרופאג’ים, מחקרים הראו כי היווצרות קפלים בממברנה מתרחשת גם בסוגי תאים שונים אחרים, כולל תאים דנדריטיים, פיברובלס?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לליבי פרי (אוניברסיטת אוגוסטה) על עזרתה בהכנת הדגימה של SEM. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R01HL139562 (G.C.) ו- K99HL146954 (B.S.)] ואיגוד הלב האמריקאי [17POST33661254 (B.S.)].
0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
Accuri C6 Flow Cytometer | |||
Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Zeiss LSM 780 confocal microscope |