Visualisere membran ruffle formasjon ved hjelp av skanning elektron mikroskopi

Summary

Makropinocytose er en svært konservert endokytisk prosess initiert av dannelsen av F-aktinrike arklignende membranprojeksjoner, også kjent som membran ruffles. Økt grad av makropinocytotisk solute internalisering har vært involvert i ulike patologiske forhold. Denne protokollen presenterer en metode for å kvantifisere membran ruffle formasjon in vitro ved hjelp av skanning elektronmikroskopi.

Abstract

Membran ruffling er dannelsen av motile plasmamembran fremspring som inneholder et nettingverk av nylig polymeriserte aktinfilamenter. Membran ruffles kan dannes spontant eller som svar på vekstfaktorer, inflammatoriske cytokiner og phorbol estere. Noen av membranutstikkene kan omorganisere seg til sirkulære membran ruffles som smelter sammen ved deres distale marginer og danner kopper som lukker og skiller seg inn i cytoplasmaet som store, heterogene vakuoler kalt makropinosomer. Under prosessen fanger ruffles ekstracellulær væske og løsemidler som internaliserer i makropinosomer. Høyoppløselig skanning elektronmikroskopi (SEM) er en vanlig brukt bildeteknikk for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring og lukkede makropinocytiske kopper på celleoverflaten. Følgende protokoll beskriver cellekulturforholdene, stimulering av membranen ruffle formasjon in vitro, og hvordan å fikse, dehydrere og forberede celler for avbildning ved hjelp av SEM. Kvantifisering av membran ruffling, data normalisering, og stimulatorer og hemmere av membran ruffle formasjon er også beskrevet. Denne metoden kan bidra til å svare på sentrale spørsmål om makropinocytoserollen i fysiologiske og patologiske prosesser, undersøke nye mål som regulerer membran ruffle dannelse, og identifisere ennå ukarakteriserte fysiologiske stimulatorer samt nye farmakologiske hemmere av makropinocytose.

Introduction

Makropinocytose er en endokytisk prosess som er ansvarlig for å internalisere en stor mengde ekstracellulær væske og dets innhold via dannelsen av dynamiske og aktindrevne plasmamembranutstikk som kalles membran ruffles¹. Mange av disse membran ruffles danner kopper som lukker og smelter tilbake på cellen og skiller seg fra plasmamembranen som store, heterogene intracellulære endosomer også kjent som makropinosomer¹. Selv om makropinocytose er indusert av vekstfaktorer som makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og epidermal vekstfaktor (EGF) i et bredt spekter av celletyper, har en ekstra unik, kalsiumavhengig prosess kjent som konstituerende makropinocytose også blitt observert i medfødte immunceller 2,3,4,5,6,7,8.

Cellenes evne til å internalisere ekstracellulært materiale via makropinocytose har vist seg å spille en viktig rolle i en rekke fysiologiske prosesser som spenner fra næringsopptak til patogenfangst og antigenpresentasjon ^9,10,11. Men fordi denne prosessen er ikke-selektiv og inducible, har den også blitt involvert i en rekke patologiske forhold. Faktisk antydet tidligere studier at makropinocytose spiller en viktig rolle i Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, kreft, nephrolithiasis og aterosklerose 12,13,14,15,16. Videre har visse bakterier og virus vist seg å bruke makropinocytose for å få inngang i vertsceller og indusere infeksjon^17,18. Interessant nok kan stimulering av makropinocytose også utnyttes for målrettet levering av terapeutiske midler under ulike sykdomstilstander^19,20.

Tidligere studier har utforsket makropinocytose ved å kvantifisere internaliserte fluorescerende taggede væskefasemarkører i fravær og tilstedeværelse av farmakologiske midler som hemmer makropinocytose ved hjelp av strømningscytometri og konfomisk avbildning^21,22. Tilgjengelige farmakologiske verktøy som hemmer makropinocytose er begrenset til og består av 1) aktinpolymerisasjonshemmere (cytochalasin D og latrunculins), 2) PI3K-blokkere (LY-290 042 og wortmannin) og 3) hemmere av natrium hydrogenvekslere (NHE) (amilorid og EIPA)5,14,15,23,24,25 . Men fordi disse inhibitorene har endokytoseuavhengige effekter, er det vanskelig å selektivt bestemme bidraget av makropinocytose til løsning av opptak og sykdomspatogenese spesielt in vivo²¹.

Skanning av elektronmikroskopi (SEM) er en type elektronmikroskop som produserer bilder med ultrahøy oppløsning av celler ved hjelp av en fokusert stråle av elektroner²⁶. I makropinocytoseforskning anses SEM-avbildning som gullstandardteknikken for å visualisere topografiske og morfologiske egenskaper ved plasmamembranen, kvantifisere membran ruffle formasjon og undersøke deres progresjon mot makropinosom internalisering. Videre gir skanning av elektronmikroskopi kombinert med kvantifisering av løsningsmiddelopptak, i nærvær og fravær av makropinocytoseblokkere, en pålitelig strategi for å undersøke makropinocytotisk solute internalisering in vitro. Dette dokumentet gir en detaljert protokoll om hvordan du forbereder celler for SEM, visualiserer celleoverflaten, kvantifiserer ruffleformasjon og undersøker deres fremgang mot kopplukking og makropinosom internalisering.

Protocol

MERK: Følgende er en generell protokoll som brukes til å kvantifisere membran ruffle formasjon i RAW 264.7 makrofager ved hjelp av SEM mikroskopi. Optimalisering kan være nødvendig for forskjellige celletyper. 1. Cellelinje og cellekultur Vokse RAW 264.7 makrofager i Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% (vol /vol) varme-inaktivert Fetal Bovine Serum (FBS), 100 IE /ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 %CO2. B…

Representative Results

Her beskriver vi resultatene fra den presenterte teknikken. Representative SEM-bilder vist i figur 1 viser membran ruffle dannelse i RAW 264.7 makrofager etter behandling med PMA og M-CSF. Bilder ble først tatt med en forstørrelse på 3500x for kvantifiseringsformål og deretter ved høyere forstørrelsesnivåer (8500x til 16 000x) for å vise plasmamembranen med større detaljer. Forbehandling av makrofager med makropinocytosehemmeren EIPA svekket membran ruffle formasjon (<strong class="…

Discussion

Den nåværende SEM-bildeprotokollen gir et verktøy for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring, og makropinocytiske kopper på celleoverflaten in vitro. Selv om den nåværende protokollen fokuserer på makrofager, har studier vist at membran ruffle formasjon også forekommer på ulike andre celletyper, inkludert dendritiske celler, fibroblaster, nevroner og kreftceller 11,12,14,21,30.^…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
4% Paraformaldehyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Flow Cytometer
Carbon Adhesive Tabs	Electron Microscopy Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR scanning electron microscope
Microscope Cover Glass	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC	ATCC TIB-71
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Critical Point Dryer	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminum Specimen Mounts	Electron Microscopy Sciences	75220
Sodium Cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 confocal microscope