Kokultur von glutamatergen Neuronen und pädiatrischen hochgradigen Gliomzellen in mikrofluidische Geräte zur Beurteilung elektrischer Wechselwirkungen
Summary
Neuere Arbeiten decken die neuronalen Auswirkungen auf hochgradige pädiatrische Gliomzellen (pHGG) und ihre wechselseitigen Interaktionen auf. Die vorliegende Arbeit zeigt die Entwicklung eines In-vitro-Modells , das pHGG-Zellen und glutamaterge Neuronen kokulturiert und ihre elektrophysiologischen Interaktionen aufzeichnet, um diese Wechselwirkungen nachzuahmen.
Abstract
Pädiatrische hochgradige Gliome (pHGG) repräsentieren Hirntumore im Kindes- und Jugendalter, die eine schnelle düstere Prognose haben. Da es notwendig ist, die Resistenz gegen aktuelle Behandlungen zu überwinden und einen neuen Weg der Heilung zu finden, ist es sehr anspruchsvoll, die Krankheit in einem In-vitro-Setting so nah wie möglich zu modellieren, um neue Medikamente und therapeutische Verfahren zu testen. Die Untersuchung ihrer grundlegenden pathologischen Prozesse, einschließlich der Übererregbarkeit von glutamatergen Neuronen, wird ein echter Fortschritt beim Verständnis der Wechselwirkungen zwischen dem Umweltgehirn und den pHGG-Zellen sein. Um Neuronen/ pHGG-Zellinteraktionen nachzubilden, zeigt diese Arbeit die Entwicklung eines funktionellen In-vitro-Modells , das human-induzierte pluripotente Stamm (hiPS) -abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen pHGG-Zellen in kompartimentierte mikrofluidische Geräte und einen Prozess zur Aufzeichnung ihrer elektrophysiologischen Modifikationen kokulturiert. Der erste Schritt bestand darin, menschliche glutamaterge Neuronen zu differenzieren und zu charakterisieren. Zweitens wurden die Zellen in mikrofluidischen Geräten mit pHGG-abgeleiteten Zelllinien kultiviert. Die Mikroumgebung des Gehirns und die neuronale Aktivität wurden dann in dieses Modell einbezogen, um die elektrischen Auswirkungen von pHGG-Zellen auf diese Mikroumgebungsneuronen zu analysieren. Elektrophysiologische Aufzeichnungen werden unter Verwendung von Multielektrodenarrays (MEA) an diese mikrofluidischen Geräte gekoppelt, um physiologische Bedingungen nachzuahmen und die elektrische Aktivität des gesamten neuronalen Netzwerks aufzuzeichnen. Eine signifikante Erhöhung der Neuronenerregbarkeit wurde in Gegenwart von Tumorzellen unterstrichen.
Introduction
Pädiatrische hochgradige Gliome (pHGG) weisen eine erweiterte genotypische und phänotypische Vielfalt auf, abhängig vom Alter des Patienten, der anatomischen Lage und Erweiterung des Tumors sowie den molekularen Treibern1. Es handelt sich um aggressive Hirntumore, die mit den derzeit verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten schlecht kontrolliert werden und die häufigste Todesursache im Zusammenhang mit Hirntumoren bei Kindern und Jugendlichen sind2. So erleiden mehr als 80% der Patienten innerhalb von 2 Jahren nach ihrer Diagnose einen Rückfall, und ihr medianes Überleben beträgt 9-15 Monate, abhängig von Gehirnstandorten und Treibermutationen. Das Fehlen einer kurativen Behandlung ist der primäre Drang zur Laborforschung und unterstreicht den unmittelbaren Bedarf an neuen innovativen Therapieansätzen. Zu diesem Zweck wurden patientenabgeleitete Zelllinien (PDCL) mit der Hoffnung entwickelt, die pHGG-Diversität3 in zweidimensionalen (2D) Linien und/oder dreidimensionalen (3D) Neurosphären bereitzustellen. Dennoch ahmen diese von Patienten abgeleiteten In-vitro-Zellkulturen nicht alle variablen Situationen des Gehirns nach. Diese Modelle berücksichtigen nicht die makroskopischen und mikroskopischen neuroanatomischen Umgebungen, die typischerweise in pHGG beschrieben werden.
Normalerweise entwickelt sich pHGG bei jüngeren Kindern hauptsächlich in pontinen und thalamischen Regionen, während sich das HGG von Jugendlichen und jungen Erwachsenen in den kortikalen Bereichen konzentriert, insbesondere in frontotemporalen Lappen1. Diese Standortspezifitäten im pädiatrischen Alter scheinen verschiedene Umgebungen zu umfassen, die zu Gliomagenese und einem sich verbindenden Netzwerk zwischen Tumorzellen und spezifischer neuronaler Aktivität führen4,5,6. Obwohl Mechanismen noch nicht identifiziert sind, entwickelt sich pHGG hauptsächlich aus neuronalen Vorläuferzellen entlang der Differenzierungsbahn von astroglialen und oligodendroglialen Linien. Während die Rolle dieser Glialinien lange Zeit auf einfache strukturelle Unterstützung für Neuronen beschränkt war, ist es jetzt klar erwiesen, dass sie sich vollständig in neuronale Schaltkreise integrieren und komplexe bidirektionale glia-neuronale Interaktionen aufweisen, die in der Lage sind, strukturelle Regionen des Gehirns zu reorganisieren und neuronale Schaltkreise umzugestalten4,7,8 . Darüber hinaus deuten zunehmende Fetzen von Beweisen darauf hin, dass das zentrale Nervensystem (ZNS) eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und progression von Hirntumoren spielt. Jüngste Arbeiten konzentrierten sich auf neuronale Aktivität, die das Wachstum und die Mitose von glialen Malignomen durch sezernierte Wachstumsfaktoren und direkte elektrochemische synaptische Kommunikation anzutreiben scheint6,9. Reziprok umgekehrt scheinen hochgradige Gliomzellen die neuronale Funktion mit zunehmender glutamaterger neuronaler Aktivität zu beeinflussen und modulieren den Betrieb der Schaltkreise, in die sie strukturell und elektrisch integriert sind9. Studien, die von Patienten abgeleitete Modelle und neuartige neurowissenschaftliche Werkzeuge zur Kontrolle der Neuronenwirkung verwendeten, zeigten eine schaltkreisspezifische Wirkung der neuronalen Aktivität auf die Lage, das Wachstum und die Progression von Gliomen. Die meisten dieser neuronalen Projektionen, die an Gliomen beteiligt sind, sind glutamaterg und kommunizieren über Glutamatsekretionen. Spezifische glutamaterge Biomarker wie mGluR2 oder vGlut1/2 werden häufig beschrieben6.
Interessanterweise zeigen pädiatrische und adulte hochgradige Gliome trotz ihrer molekularen Heterogenität eine typische proliferative Reaktion auf glutamaterge neuronale Aktivität und andere sezernierte Faktoren wie Neuroligin-3 oder BDNF (brain-derived neurotrophic factor)4,6,10,11,12,13 . In kortikalen Regionen können pädiatrische und erwachsene HGGs durch eine erhöhte Glutamatsekretion neuronale Übererregbarkeit induzieren und GABA-Interneuronen hemmen, was zu Gliomen führt, die mit epileptischer Netzwerkaktivität assoziiert sind14,15. Darüber hinaus können neuronale Schaltkreise durch Gliome, die bestimmte neurologische Aufgaben, z. B. Sprache, vorantreiben, umgestaltet werden und zusätzliche organisierte neuronale Aktivitäten erfordern9.
Basierend auf dieser Begründung muss das Verständnis der bidirektionalen Kommunikation zwischen Gliomzellen und Neuronen vollständig aufgeklärt und in die frühen Stadien der In-vitro-pHGG-Ansätze integriert werden. Eine solche innovative Modellierung ist entscheidend für das Verständnis und die Messung der Auswirkungen der neuronalen elektrischen Aktivität während des Drogentests und die Antizipation der pHGG-Reaktion in die Schaltkreise des Gehirns. Jüngste Entwicklungen in neurowissenschaftlichen Werkzeugen, wie mikrofluidische Geräte und pHGG-Forschungsarbeiten, sind das Fundament, um neue Modellierungsansätze zu entwickeln und nun in der Lage zu sein, die Mikroumgebung des Gehirns in In-vitro-pHGG-Modelle zu integrieren3,16,17,18,19. Gekoppelt mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen unter Verwendung von Multielektrodenarrays (MEA) bieten mikrofluidische Bauelemente20,21,22 die Möglichkeit, physiologische Bedingungen nachzuahmen, während die elektrische Aktivität des gesamten neuronalen Netzwerks aufgezeichnet und Netzwerkkonnektivitätsparameter unter verschiedenen Bedingungen extrahiert werden. Dieses Gerät23,24 ermöglicht zunächst die präzise Abscheidung von Zellen in einer Kammer direkt auf MEA. Diese Technologie ermöglicht die Kontrolle der Zellsaatdichte und -homogenität auf MEA und die Feinsteuerung des Medienaustauschs, was ein kritischer Schritt für die Differenzierung des menschlichen neuronalen Vorläufers direkt in Geräte ist. Darüber hinaus kann die vorliegende Abscheidungskammer mit mehreren Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten ausgesät werden.
Daher zielte diese Studie darauf ab, ein funktionelles In-vitro-Modell zu entwickeln, das menschliche pluripotente Stamm (hiPS) –abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen und pHGG-abgeleitete Zellen in mikrofluidische Geräte kokulturiert und ihre elektrische Aktivität aufzeichnet, um elektrische Wechselwirkungen zwischen beiden Zellpopulationen zu bewerten. Zuerst wurden hiPS-abgeleitete kortikale glutamaterge Neuronen in mikrofluidischen Geräten in verschiedenen Stadien der Kultur [Tag 4 (D4) als hiPS-Zellen und Tag 21 (D21) und Tag 23 (D23) als glutamaterge gereifte Neuronen] erhalten und charakterisiert. Für den zweiten Schritt der Kokultur wurden zwei pHGG-Modelle verwendet: kommerzialisierte pädiatrische UW479-Linie und pHGG-Zellen, die von einem Patiententumor (BT35)3 initiiert wurden, der eine H3.3 K27M-Treibermutation trug. Schließlich führten wir elektrophysiologische Aufnahmen von glutamatergen Zellen bei D21 vor der pHGG-Zellaussaat und D23 nach 48 h Kokultur in dasselbe mikrofluidische Gerät durch. Die Wechselwirkungen zwischen glutamatergen Neuronen und pHGG-Zellen waren durch einen signifikanten Anstieg der aufgezeichneten elektrophysiologischen Aktivität gekennzeichnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit beschreibt ein genaues funktionelles In-vitro-Modell zur Bewertung der Interaktion zwischen humanen hiPS-abgeleiteten kortikalen glutamatergen Neuronen und Hirntumorzellen in mikrofluidischen Geräten. Einer der entscheidenden Schritte im vorliegenden Protokoll war die hiPS-Differenzierung in glutamatergen Neuronen, die durch die Abnahme der Nestin- und Sox2-Immunfluoreszenzfärbung und das gleichzeitige Auftreten von mGluR2- und vGLUT1-Färbung bestätigt wurde. Dennoch blieben nur wenige neuronale…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Satt Conectus-Programms, der Fondation de l’Université de Strasbourg, «J’ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» und «Semeurs d’Etoile» unterstützt. Wir danken den von HGGs betroffenen Kindern und Familien für ihre Beiträge zu dieser Forschung und ihre Unterstützung.
Materials
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
|
Cortical Glutamatergic Neurons
|
BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | – | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 – 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 – 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 – 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
Referências
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