Cocultivo de neuronas glutamatérgicas y células pediátricas de glioma de alto grado en dispositivos microfluídicos para evaluar las interacciones eléctricas
Summary
Trabajos recientes descubren el impacto neuronal en las células de glioma pediátrico de alto grado (pHGG) y sus interacciones recíprocas. El presente trabajo muestra el desarrollo de un modelo in vitro que co-cultiva células pHGG y neuronas glutamatérgicas y registra sus interacciones electrofisiológicas para imitar esas interactividades.
Abstract
Los gliomas pediátricos de alto grado (pHGG) representan cánceres cerebrales infantiles y adolescentes que tienen un pronóstico sombrío rápido. Dado que existe la necesidad de superar la resistencia a los tratamientos actuales y encontrar una nueva forma de curación, modelar la enfermedad lo más cerca posible en un entorno in vitro para probar nuevos medicamentos y procedimientos terapéuticos es muy exigente. El estudio de sus procesos patobiológicos fundamentales, incluida la hiperexcitabilidad de las neuronas glutamatérgicas, será un verdadero avance en la comprensión de las interacciones entre el cerebro ambiental y las células pHGG. Por lo tanto, para recrear las interacciones entre las neuronas y las células pHGG, este trabajo muestra el desarrollo de un modelo funcional in vitro de cocultivo que coculta las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de Stem (hiPS) inducidas por humanos en células pHGG microfluídicas compartimentadas y un proceso para registrar sus modificaciones electrofisiológicas. El primer paso fue diferenciar y caracterizar las neuronas glutamatérgicas humanas. En segundo lugar, las células se cultivaron en dispositivos microfluídicos con líneas celulares derivadas de pHGG. El microambiente cerebral y la actividad neuronal se incluyeron en este modelo para analizar el impacto eléctrico de las células pHGG en estas neuronas microambientales. Los registros electrofisiológicos se acoplan utilizando matrices multielectrodos (MEA) a estos dispositivos microfluídicos para imitar las condiciones fisiológicas y registrar la actividad eléctrica de toda la red neuronal. Se subrayó un aumento significativo en la excitabilidad neuronal en presencia de células tumorales.
Introduction
Los gliomas pediátricos de alto grado (pHGG) presentan una diversidad genotípica y fenotípica extendida dependiendo de la edad del paciente, la ubicación y extensión anatómica tumoral y los impulsores moleculares1. Son tumores cerebrales agresivos que están mal controlados con las opciones de tratamiento actualmente disponibles y son la principal causa de muerte relacionada con cánceres cerebrales en niños y adolescentes2. Por lo tanto, más del 80% de los pacientes recaen dentro de los 2 años posteriores a su diagnóstico, y su supervivencia media es de 9 a 15 meses, dependiendo de las ubicaciones del cerebro y las mutaciones impulsoras. La ausencia de tratamiento curativo es el principal impulso para la investigación de laboratorio y destaca la necesidad inmediata de nuevos enfoques terapéuticos innovadores. Para este propósito, se desarrollaron líneas celulares derivadas de pacientes (PDCL) con la esperanza de proporcionar la diversidad de pHGG3 en líneas bidimensionales (2D) y / o neuroesferas tridimensionales (3D). Sin embargo, esos cultivos celulares in vitro derivados del paciente no imitan todas las situaciones de variables cerebrales. Estos modelos no consideran los ambientes neuroanatómicos macroscópicos y microscópicos típicamente descritos en pHGG.
Por lo general, la pHGG en niños más pequeños se desarrolla principalmente en las regiones pontina y talámica, mientras que la HGG de adolescentes y adultos jóvenes se concentra en las áreas corticales, especialmente en los lóbulos frontotemporales1. Estas especificidades de localización a lo largo de las edades pediátricas parecen involucrar diferentes ambientes que conducen a la gliomagénesis y a una red de intricción entre las células tumorales y la actividad neuronal específica4,5,6. Aunque los mecanismos aún no se han identificado, el pHGG se desarrolla principalmente a partir de células precursoras neurales a lo largo de la trayectoria de diferenciación de los linajes astrogliales y oligodendrogliales. Si bien el papel de estos linajes gliales se ha restringido durante mucho tiempo al soporte estructural simple de las neuronas, ahora está claramente establecido que se integran completamente en los circuitos neuronales y exhiben complejas interacciones glial-neuronales bidireccionales capaces de reorganizar las regiones estructurales del cerebro y remodelar los circuitos neuronales4,7,8 . Además, el aumento de fragmentos de evidencia indica que el sistema nervioso central (SNC) desempeña un papel crítico en el inicio y la progresión del cáncer cerebral. Trabajos recientes se centraron en la actividad neuronal, que parece impulsar el crecimiento y la mitosis de las neoplasias gliales malignas a través de factores de crecimiento secretados y comunicaciones sinápticas electroquímicas directas6,9. Recíprocamente, las células de glioma de alto grado parecen influir en la función neuronal con una creciente actividad neuronal glutamatérgica y modular el funcionamiento de los circuitos en los que están integradas estructural y eléctricamente9. Por lo tanto, los estudios que utilizaron modelos derivados del paciente y nuevas herramientas de neurociencia que controlan la acción neuronal demostraron un efecto específico del circuito de la actividad neuronal en la ubicación, el crecimiento y la progresión del glioma. La mayoría de estas proyecciones neuronales involucradas en los gliomas son glutamatérgicas y se comunican a través de secreciones de glutamato. Comúnmente se describen biomarcadores glutamatérgicos específicos como mGluR2 o vGlut1/26.
Curiosamente, a pesar de su heterogeneidad molecular, los gliomas pediátricos y adultos de alto grado muestran una respuesta proliferativa típica a la actividad neuronal glutamatérgica y otros factores secretados como la neuroligina-3 o el BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro)4,6,10,11,12,13 . En las regiones corticales, los HGG pediátricos y adultos pueden inducir hiperexcitabilidad neuronal a través de un aumento de la secreción de glutamato e inhibir las interneuronas gaba que conducen a gliomas asociados con la actividad de la red epiléptica14,15. Además de eso, los circuitos neuronales pueden ser remodelados por gliomas que empujan tareas neurológicas específicas, por ejemplo, el lenguaje, y pueden requerir actividad neuronal organizada adicional9.
Sobre la base de esta lógica, el avance de la comprensión de las comunicaciones bidireccionales entre las células de glioma y las neuronas debe dilucidarse completamente e integrarse con las primeras etapas de los enfoques in vitro de pHGG. Este modelado innovador es crucial para comprender y medir el impacto de la actividad eléctrica neuronal durante las pruebas de drogas y anticipar la respuesta de pHGG en los circuitos cerebrales. Los desarrollos recientes en herramientas de neurociencia, como los dispositivos microfluídicos y los trabajos de investigación de pHGG, son la base para desarrollar nuevos enfoques de modelado y poder integrar ahora el microambiente cerebral en modelos de pHGG de vitro3,16,17,18,19. Junto con los registros electrofisiológicos utilizando matrices multielectrodos (MEA), los dispositivos microfluídicos20,21,22 ofrecen la posibilidad de imitar las condiciones fisiológicas mientras registran la actividad eléctrica de toda la red neuronal y extraen los parámetros de conectividad de la red bajo varias condiciones. Este dispositivo23,24 permite en primer lugar la deposición precisa de células en una cámara directamente sobre MEA. Esta tecnología permite el control de la densidad de siembra celular y la homogeneidad en MEA y el control fino del intercambio de medios, que es un paso crítico para la diferenciación de progenitores neurales humanos directamente en dispositivos. Además, la cámara de deposición actual se puede sembrar con múltiples células en diferentes puntos de tiempo.
Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un modelo funcional in vitro que coculte las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de Stem (hiPS) humanas y las células derivadas de pHGG en dispositivos microfluídicos y registre su actividad eléctrica para evaluar las interacciones eléctricas entre ambas poblaciones celulares. En primer lugar, se obtuvieron neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS y se caracterizaron en dispositivos microfluídicos en diferentes etapas de cultivo [día 4 (D4), como células hiPS, y día 21 (D21) y día 23 (D23), como neuronas maduras glutamatérgicas]. Para el segundo paso del cocultivo se utilizaron dos modelos de pHGG: la línea UW479 pediátrica comercializada y las células pHGG iniciadas a partir de un tumor de paciente (BT35)3, con una mutación impulsora H3.3 K27M. Finalmente, realizamos registros electrofisiológicos de células glutamatérgicas en D21 antes de la siembra de células pHGG y D23 después de 48 h de cocultivo en el mismo dispositivo microfluídico. Las interacciones entre las neuronas glutamatérgicas y las células pHGG se caracterizaron por un aumento significativo en la actividad electrofisiológica registrada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe un modelo funcional in vitro preciso para evaluar la interacción entre las neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPS humanas y las células tumorales cerebrales en dispositivos microfluídicos. Uno de los pasos cruciales en el presente protocolo fue la diferenciación hiPS en neuronas glutamatérgicas, que se confirmó por la disminución de la tinción inmunofluorescente de Nestin y Sox2 y la aparición simultánea de tinción mGluR2 y vGLUT1. Sin embargo, pocos progenitores …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas del programa Satt Conectus, Fondation de l’Université de Strasbourg, «J’ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Franck, Rayon de Soleil» y «Semeurs d’Etoile». Agradecemos a los niños y familias afectados por losHGG por sus contribuciones a esta investigación y su apoyo.
Materials
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
|
Cortical Glutamatergic Neurons
|
BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | – | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 – 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 – 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 – 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
Referências
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Ostrom, Q. T., et al. Alex’s lemonade stand foundation infant and childhood primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro-Oncology. 16, 1-36 (2015).
- Blandin, A. F., et al. Hypoxic environment and paired hierarchical 3D and 2D models of pediatric H3.3-mutated gliomas recreate the patient tumor complexity. Cancers (Basel). 11 (12), 1875 (2019).
- Monje, M. Synaptic communication in brain cancer. Pesquisa do Câncer. 80 (14), 2979-2982 (2020).
- Mount, C. W., Yalçın, B., Cunliffe-Koehler, K., Sundaresh, S., Monje, M. Monosynaptic tracing maps brain-wide afferent oligodendrocyte precursor cell connectivity. eLife. 18 (8), 49291 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573 (7775), 539-545 (2019).
- Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders. Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
- Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
- Krishna, S., et al. Glioblastoma remodeling of neural circuits in the human brain decreases survival. BioRxiv. , (2021).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573 (7775), 532-538 (2019).
- Wang, X., et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stem cells and differentiated tumor cells promotes malignant progression. Cell Stem Cell. 22 (4), 514-528 (2018).
- Venkatesh, H. S., et al. Targeting neuronal activity-regulated neuroligin-3 dependency in high-grade glioma. Nature. 549 (7673), 533-537 (2017).
- Venkatesh, H. S., et al. Neuronal activity promotes glioma growth through Neuroligin-3 secretion. Cell. 161 (4), 803-816 (2015).
- Buckingham, S. C., et al. Glutamate release by primary brain tumors induces epileptic activity. Nature Medicine. 17 (10), 1269-1274 (2011).
- Campbell, S. L., Buckingham, S. C., Sontheimer, H. Human glioma cells induce hyperexcitability in cortical networks. Epilepsia. 53 (8), 1360-1370 (2012).
- Maisonneuve, B. G. C., Vieira, J., Larramendy, F., Honegger, T. Microchannel patterning strategies for in vitro structural connectivity modulation of neural networks. BioRxiv. , (2021).
- Pastore, V. P., Godjoski, A., Martinoia, S., Massobrio, P. SpiCoDyn: A toolbox for the analysis of neuronal network dynamics and connectivity from multi-site spike signal recordings. Neuroinformatics. 16 (1), 15-30 (2018).
- Honegger, T., Thielen, M. I., Feizi, S., Sanjana, N. E., Voldman, J. Microfluidic neurite guidance to study structure-function relationships in topologically-complex population-based neural networks. Scientific Reports. 6, 28384 (2016).
- Nguyen, A., et al. Characterization of the transcriptional and metabolic responses of pediatric high grade gliomas to mTOR-HIF-1α axis inhibition. Oncotarget. 8 (42), 71597-71617 (2017).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Cerea, A., et al. Selective intracellular delivery and intracellular recordings combined in MEA biosensors. Lab on a Chip. 18 (22), 3492-3500 (2018).
- Bruno, G., et al. Microfluidic multielectrode arrays for spatially localized drug delivery and electrical recordings of primary neuronal cultures. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 626 (2020).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Maisonneuve, B. G. C., et al. Deposition chamber technology as building blocks for a standardized brain on chip framework. BioRxiv. , (2021).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- Andreiuk, B., et al. Fluorescent polymer nanoparticles for cell barcoding in vitro and in vivo. Small. 13 (38), (2017).
