グルタミン酸ニューロンと小児の高品位グリオーマ細胞の微小流体デバイスへの共培養による電気的相互作用の評価
Summary
最近の研究では、高等度の小児神経膠腫(pHGG)細胞とそれらの相互相互作用に対する神経細胞の影響を明らかにする。本研究は、イン ビトロ モデルの共培養pHGG細胞とグルタミン酸ニューロンの開発を示し、それらの相互作用を模倣するためにそれらの電気生理学的相互作用を記録した。
Abstract
小児の高等神経膠腫(pHGG)は、急速な陰気予後を運ぶ小児および思春期の脳癌を表す。現在の治療法に対する耐性を克服し、新しい治療法を見つける必要があるため、新薬や治療手順をテストするための インビトロ の設定でできるだけ近い病気をモデル化することは非常に厳しいです。グルタミン酸神経過興奮性を含む基本的な病態生物学的プロセスを研究することは、環境脳とpHGG細胞の相互作用を理解する上で本当の進歩となるだろう。したがって、ニューロン/pHGG細胞相互作用を再現するために、この研究は、ヒト誘発多能性幹細胞(hiPS)由来の細胞質性大細胞性大細胞を区分された微小流体デバイスに共培養する機能 インビトロ モデルの開発と、その電気生理学的修飾を記録するプロセスを示す。最初のステップは、ヒトグルタミン酸細胞を区別し、特徴付けでした。第二に、細胞をpHGG由来細胞株を有するマイクロ流体デバイスで培養した。次に、脳微小環境と神経活動をこのモデルに含め、pHGG細胞がこれらの微小環境ニューロンに及ぼす電気的影響を分析した。電気生理学的記録は、多電極アレイ(MEA)を用いてこれらの微小流体デバイスに結合して、生理学的状態を模倣し、ニューラルネットワーク全体の電気的活動を記録する。神経興奮性の有意な増加は、腫瘍細胞の存在下で下線を引いた。
Introduction
小児の高等質神経膠腫(pHGG)は、患者の年齢、腫瘍解剖学的位置および拡張、および分子ドライバに応じて、拡張されたジェノティピックおよび現象の多様性を示す1。彼らは、現在利用可能な治療オプションで制御が不十分であり、小児および青年の脳癌に関連する主要な死因である積極的な脳腫瘍である2。したがって、患者の80%以上が診断後2年以内に再発しており、その中央値の生存率は脳の位置とドライバーの突然変異に応じて9〜15ヶ月である。治癒治療の欠如は、実験室での研究のための主要な衝動であり、新しい革新的な治療アプローチの即時の必要性を強調しています。この目的のために、患者由来細胞株(PDCL)は、2次元(2D)線および/または3次元(3D)神経球でpHGG多様性3 を提供することを期待して開発された。それにもかかわらず、これらの患者由来 のインビトロ 細胞培養は、すべての脳可変状況を模倣するわけではない。これらのモデルは、pHGGに典型的に記載されている巨視的および微視的な神経解剖学的環境を考慮していない。
通常、若い小児のpHGGは主にポンチンおよび視床領域で発達しているのに対し、思春期および若年成人のHGGは皮質領域、特に前頭側頭葉1に集中する。小児期におけるこれらの位置特異性は、神経膠腫形成につながる異なる環境と、腫瘍細胞と特異的神経活動との間の複雑なネットワークを伴うようである4,5,6。メカニズムはまだ特定されていないが、pHGGは主にアストログリアおよびオリゴデンドログリア系統の分化軌道に沿って神経前駆細胞から発達する。これらのグリア系統の役割は、ニューロンの単純な構造的サポートに長い間制限されてきたが、神経回路に完全に統合し、脳の構造領域を再編成し、神経回路を改造することができる複雑な双方向グリア神経相互作用を示すことが明らかに確立された4,7,8.さらに、証拠の断片の増加は、中枢神経系(CNS)が脳癌の開始および進行において重要な役割を果たしていることを示している。最近の研究は、分泌された成長因子と直接電気化学的シナプス通信を通じてグリア悪性腫瘍の成長と有糸分裂を促進すると思われる神経活動に焦点を当てた6,9。相互に、高等度の神経膠腫細胞は、増加するグルタミン酸作動性神経活動と神経機能に影響を与え、それらが構造的および電気的に統合された回路の動作を調節する9。そこで、神経細胞の作用を制御する患者由来モデルと新しい神経科学ツールを用いた研究は、神経膠腫の位置、成長、および進行に対する神経活動の回路特異的効果を示した。これらの神経細胞の突起の大部分は、神経膠腫に関与し、グルタミン酸分泌物を介して通信します。.mGluR2またはvGlut1/2などの特異的グルタミン酸バイオマーカーは、一般的に説明される6。
興味深いことに、その分子異質性にもかかわらず、小児および成人の高等級神経膠腫は、グルタミン酸神経活性および神経リジン-3またはBDNF(脳由来神経栄養因子)などの他の分泌因子に対する典型的な増殖反応を示す4,6,6,10,11,12,13.皮質領域では、小児および成人HGGは、グルタミン酸分泌の増加を介して神経過励起を誘発し、てんかんネットワーク活動に関連する神経膠腫につながるGABAインターニューロンを阻害する14,15。その上、神経回路は、例えば、言語などの特定の神経学的タスクを押す神経膠腫によって改造することができ、追加の組織化された神経活動を要求することができます9。
この根拠に基づいて、神経膠腫細胞とニューロン間の双方向通信の理解を進め、インビトロpHGGアプローチの初期段階で完全に解明し、統合されなければならない。このような革新的なモデリングは、薬物検査中の神経細胞の電気活動への影響を理解し測定し、脳回路へのpHGG応答を予測する上で極めて重要です。マイクロ流体デバイスやpHGG研究などの神経科学ツールの最近の発展は、新しいモデリングアプローチを開発し、インビトロpHGGモデル3、16、17、18、19に脳微小環境を統合することができるベッドです。多電極アレイ(MEA)を用いた電気生理学的記録と組み合わせることで、マイクロ流体デバイス20,21,22は、ニューラルネットワーク全体の電気的活動を記録しながら生理的条件を模倣し、いくつかの条件下でネットワーク接続パラメータを抽出する可能性を提供します。この装置23,24は最初にMEAの直接の部屋の細胞の精密な沈着を可能にする。この技術により、MEA上の細胞播種密度と均質性の制御と、ヒト神経前駆物質のデバイスへの直接分化にとって重要なステップであるメディア交換の細かい制御が可能になります。また、この堆積チャンバは、異なる時点で複数の細胞で播種することができる。
そこで本研究は、ヒト多能性幹細胞(hiPS)由来の多能性幹細胞(hiPS)由来の皮質グルタマ作動性ニューロンおよびpHGG由来細胞をマイクロ流体デバイスに共培養する機能インビトロモデルを開発し、それらの電気的活性を記録して、両細胞集団間の電気的相互作用を評価することを目的とした。まず、hiPS由来の皮質グルタミン酸ニューロンを得て、培養の異なる段階でマイクロ流体デバイスで特徴付け[4日目(D4)、hiPS細胞として、および23日目(D23)、グルタマチル化成熟ニューロンとして。共培養の第2段階では、2つのpHGGモデルが使用された:市販された小児UW479ラインおよびpHGG細胞は患者腫瘍から開始された(BT35)3、H3.3 K27Mドライバー突然変異を有する。最後に、同じマイクロ流体装置への共培養の48時間後にpHGG細胞播種とD23の前にD21でグルタミン酸細胞の電気生理学的記録を行った。グルタミン酸ニューロンとpHGG細胞との相互作用は、記録された電気生理学的活性の有意な増加によって特徴付けられていた。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究は、ヒトhiPS由来の皮質グルタミン酸ニューロンと脳腫瘍細胞との間の微小流体デバイスにおける相互作用を評価するための正確な機能イン ビトロ モデルを説明する。本プロトコルの重要なステップの1つは、グルタマ作動性ニューロンにおけるhiPS分化であり、これはネスチンとSox2免疫蛍光染色の減少とmGluR2およびvGLUT1染色の同時出現によって確認された。それにもかかわらず?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、サット・コネクトゥス・プログラム、フォンダシオン・ド・ラ・ヴェルシオン・ド・ストラスブール、«J’ai demandé la lune»、«ウネ・ルーラードはチャーライン»、«ライフピンク»、«フランク、レーヨン・ド・ソレイユ»と«セムール・デ・エトワール»協会からの助成金によって支えられました。HGGの影響を受けた子どもたちやご家族の皆様のご支援に感謝申し上げます。
Materials
| 256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
| 40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
| 60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
| Accutase | Sigma | A6964 | |
| Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
| Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
| Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
| Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
|
Cortical Glutamatergic Neurons
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BrainXell | BX-0300 | |
| DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
| DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
| DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
| EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| Incubator | Memmert | IC0150med | |
| MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
| Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
| Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
| Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
| Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
| Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
| MultiChannel Experimenter | MCS | – | |
| N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
| Non filter tip 0.1 – 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
| Non filter tip 1 – 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
| Non filter tip 50 – 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
| Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
| Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
| Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
| Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
| Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
| Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
| TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
| Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
| Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
Referências
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