Summary
כאן, אנו מתארים מערכת תכנות מחדש ישירה ממוטבת עבור מלנוציטים ומערכת אריזה מרוכזת של וירוסים ביעילות גבוהה המבטיחה תכנות מחדש ישיר חלק.
Abstract
אובדן התפקוד של מלנוציטים מוביל vitiligo, אשר משפיע ברצינות על הבריאות הפיזית והנפשית של האנשים המושפעים. כיום, אין טיפול יעיל לטווח ארוך עבור vitiligo. לכן, זה הכרחי לפתח טיפול נוח ויעיל עבור vitiligo. טכנולוגיית רפואה רגנרטיבית לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים נראית כטיפול חדשני ומבטיח בויטיליגו. זה כרוך בתכנות מחדש ישיר של תאי העור של המטופל למלנוציטים תפקודיים כדי לעזור למתן את אובדן המלנוציטים בחולים עם ויטיליגו. עם זאת, שיטה זו צריכה להיבדק תחילה על עכברים. למרות שתכנות מחדש ישיר נמצא בשימוש נרחב, אין פרוטוקול ברור לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. יתר על כן, מספר גורמי השעתוק הזמינים הוא מכריע.
כאן, פרוטוקול מערכת אריזה מרוכזת של lentivirus מוצג כדי לייצר גורמי שעתוק שנבחרו לתכנות מחדש של תאי עור למלנוציטים, כולל Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 ו- Snai2. פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) נדבקו בנגיף הלנטי המרוכז עבור כל גורמי השעתוק הללו לתכנות מחדש ישיר של ה-MEFs למלנוציטים מושרים (iMels) במבחנה. יתר על כן, גורמי שעתוק אלה נבדקו, והמערכת הותאמה לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. הביטוי של הסמנים האופייניים של מלנין ב- iMels ברמת הגן או החלבון היה מוגבר באופן משמעותי. תוצאות אלה מצביעות על כך שתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים יכול להיות אסטרטגיה טיפולית חדשה ומוצלחת עבור ויטיליגו ולאשר את המנגנון של התפתחות מלנוציטים, אשר יספק את הבסיס לתכנות מחדש ישיר נוסף של פיברובלסטים למלנוציטים in vivo.
Introduction
ויטיליגו היא מחלת עור המשפיעה קשות על בריאותם הגופנית והנפשית של האנשים המושפעים. מסיבות שונות, כולל הפרעות מטבוליות, עקה חמצונית, יצירת מתווכים דלקתיים, ניתוק תאים ותגובה אוטואימונית, המלנוציטים התפקודיים הולכים לאיבוד, והפרשת המלנין נעצרת, מה שמוביל להתפתחות של ויטיליגו 1,2. מצב זה מתרחש באופן נרחב והוא בעייתי במיוחד על הפנים. הטיפול העיקרי הוא שימוש סיסטמי בקורטיקוסטרואידים ובאימונומודולטורים. פוטותרפיה יכולה לשמש למחלות סיסטמיות או מקומיות, וישנם טיפולים כירורגיים, כגון השתלת עור מחורר והשתלת מלנוציטים אוטולוגית 3,4,5. עם זאת, חולים המשתמשים בטיפול תרופתי ובפוטותרפיה נוטים להישנות, ולטיפולים אלה יש השפעות טיפוליות ארוכות טווח גרועות. הטיפול הכירורגי הוא טראומטי ויעיל למדי רק 2,6. לכן, יש צורך באסטרטגיה טיפולית חדשה ויעילה עבור ויטיליגו.
התכנות מחדש של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) הופך את התאים האלה ממצבם הסופי למצב פלוריפוטנטי, תהליך המתווך על ידי גורמי השעתוק, Oct4, Sox2, Klf4 ו-c-Myc7. עם זאת, בשל האפשרות של גידולים סרטניים וזמן הייצור הארוך, טכנולוגיה זו נתקלה בספקנות כאשר יושמה על הגדרות קליניות8. תכנות מחדש ישיר הוא טכנולוגיה שגורמת לסוג אחד של תא סופני להפוך לסוג אחר של תא סופני9. תהליך זה מושג על ידי גורמי שעתוק מתאימים. תאים שונים כבר תוכננו מחדש ישירות בהצלחה, כולל קרדיומיוציטים10, נוירונים11 ותאי שיער שבלול12. חלק מהחוקרים אף תיכנתו מחדש את רקמת העור ישירות באתרה, שיכולה לשמש לתיקוןפצעים 13. היתרונות של תכנות מחדש ישיר כוללים זמני המתנה ועלויות מופחתים, סיכון נמוך יותר לסרטן, פחות בעיות אתיות והבנה טובה יותר של המנגנון העומד בבסיס קביעת גורל התא9.
למרות ששיטת התכנות מחדש הישירה נמצאת בשימוש נרחב, אין כיום שיטה מוגדרת לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים, במיוחד בגלל גורמי השעתוק הרבים להיחשב14,15. גורמי השעתוק, Mitf, Sox10 ו-Pax3, שימשו לתכנות מחדש ישיר של תאי העור למלנוציטים14. לעומת זאת, השילוב של MITF, PAX3, SOX2 ו-SOX9 שימש גם לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים אנושיים במחקר אחר15. בפרוטוקול זה, למרות השימוש בשיטת סינון שונה, אותה תוצאה הושגה עם השילוב של Mitf, Sox10 ו- Pax3 לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים כפי שתואר קודם לכן14. פיתוח מערכת ליצירת מלנוציטים מתאי עור אחרים יכול לספק תוכנית להפיכת תאי עור אחרים של חולי ויטיליגו למלנוציטים. לפיכך, חיוני לבנות שיטה פשוטה ויעילה לתכנות מחדש ישיר זה כדי ליצור מלנוציטים בהצלחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבודה זו אושרה על ידי הוועדה לניהול ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת ג'יאנגסו (UJS-IACUC-AP--20190305010). הניסויים בוצעו תוך הקפדה על התקנים שנקבעו על ידי האגודה להערכה והסמכה של ארגון המחקר הבינלאומי לטיפול בחיות מעבדה (AAALAC International). לא היו ניסויים שבהם היו מעורבים בני אדם, ולכן עבודה זו לא הייתה זקוקה לאישור ועדת האתיקה של המחקר האנושי. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ריאגנטים.
1. בניית מערכת אריזה מרוכזת של נגיף הלנטי לגורמי שעתוק
- ייצור הנגיף המרוכז (איור 1A, B)
- צלחת 1.5 × 106 תאי HEK-293T לתוך צלחת של 60 מ"מ ותרבית תאים אלה עם תווך רגיל (ראה טבלה 1) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2.
הערה: אם יש צורך לארוז את הנגיף בקבוצות, ניתן להשתמש בצלחת תרבית תאים של 100 מ"מ (לפרטים, ראו טבלה 2). - לאחר 24 שעות, ודא שתאי HEK-293T הגיעו למפגש של 80-90% ביום ההעתקה, והחלף את המדיום ב-3.5 מ"ל של DMEM (150 μL של DMEM לכל 1 ס"מ2). השאירו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2 למשך שעתיים.
הערה: המדיום החלופי חייב להיות נטול סרום, כך שניתן יהיה "להרעיב" את התאים כדי לשפר את טרנספקציה של פלסמיד. - הכן את התערובת של פלסמידים (תערובת A) המכילה 3 מיקרוגרם של פלסמידי המטרה של Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 או Snai2; 1 מיקרוגרם של האריזה פלסמיד PMD2. G, ו-2 מיקרוגרם של האריזה פלסמיד PSPAX2. הוסיפו את הנפח של תערובת A עד 150 μL עם DMEM ללא סרום. מכינים את התערובת של ריאגנט הטרנספקציה (תערובת B) על ידי הוספת 12 μL של מגיב הטרנספקציה (הנפח כפול מהמסה הכוללת של כל הפלסמידים), ומרכיבים את נפח התערובת B עד 150 μL עם DMEM ללא סרום.
הערה: בעת הכנת התערובות, חשוב להוסיף נוזל לאט כדי למנוע בועות אוויר. - ערבבו את תערובת A וערבבו את B לאחר שאפשרו להם לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דגירה של התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות כדי ליצור את קומפלקס הטרנספקציה.
- הוציאו את תאי HEK-293T מהאינקובטור, החליפו את המדיום ב-DMEM + 2% FBS, הוסיפו את התערובת משלב 1.1.4 בצורה טיפתית וערבבו את הנוזל בעדינות.
- לאחר 8 שעות, לשנות את המדיום עם 3.5 מ"ל של בינוני נורמלי. לאחר שינוי המדיום, לאסוף את supernatant הנגיף כל 24 שעות ו 48 שעות.
- ערבבו את חומרי העל של הנגיף שנאספו בשתי נקודות זמן שונות. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנט דרך מסנני 0.45 מיקרומטר ואוספים אותו בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
הערה: ניתן לאחסן את הנגיף שנאסף בשעה 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולערבב אותו עם הנגיף שנאסף בשעה 48 שעות. - רכז את הווירוס סופרנאטנט על ידי צנטריפוגה ב 6000 × גרם ב 4 °C בלילה (~ 16 שעות). ודא שכדור הווירוס נראה בתחתית הצינור החרוטי לאחר הצנטריפוגה.
- שופכים את ה-supernatant לאט. ממיסים את כדור הנגיף בנפח של מדיום תקין שהוא 1/100th מנפח ה-supernatant של הנגיף. באמצעות מיקרופיפט P1000, פיפטה למעלה ולמטה בעדינות עד לקבלת תערובת הומוגנית. מחלקים את הנגיף המרוכז לצינורות מיקרוצנטריפוגה לפי הצורך. יש לאחסן בטמפרטורה של −80 °C (80 °F).
הערה: הנגיף מרוכז פי 100 בשיטה זו. ניתן לאחסן את הנגיף המרוכז (100x) במשך שנה >1 בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. הימנעו מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של הנגיף.
- צלחת 1.5 × 106 תאי HEK-293T לתוך צלחת של 60 מ"מ ותרבית תאים אלה עם תווך רגיל (ראה טבלה 1) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2.
- זיהוי של טיטר וירוסים מרוכז (איור 1C)
- צלחת 1 × 105 תאי HEK-293T לבאר אחת של צלחת בעלת 6 בארות. זכור להוסיף אחד טוב כמו שליטה שלילית. תרבית תאים אלה עם תווך נורמלי ב 37 °C בחממה לחה עם 5% CO2.
- הוסף 0.1 μL או 0.2 μL של נגיף מרוכז פלואורסצנטי (100x) לכל באר לאחר 24 שעות, והוסף 4 ng/μL של מגיב הטרנספקציה הפולימרית הקטיונית לכל באר. כ 8-12 שעות לאחר ההדבקה, להחליף את המדיום עם בינוני נורמלי.
הערה: כדי להבטיח את הדיוק והיעילות של זיהוי הפלואורסצנציה, שיעור ההדבקה חייב להיות 10-30%. הוספת 0.1 μL או 0.2 μL של הנגיף המרוכז פלואורסצנטי יכולה לשמור על יעילות הזיהום בטווח זה. טיטר הנגיף המרוכז יכול להגיע ל-1 × 108 יחידות התמרה (TU)/mL לפחות. - כ-48 שעות לאחר ההדבקה, שטפו את התבנית ב-1 מ"ל של מי מלח סטריליים עם מאגר פוספט (PBS) כדי להסיר תאים מתים.
- נסה את התאים האלה באמצעות 250 μL של 0.05% טריפסין-EDTA לבאר בצלחת של 6 בארות למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C ולאחר מכן להסיר את supernatant.
- בצעו החייאה של גלולת התא ב-1 מ"ל של PBS, הוסיפו את ההשעיה לצינור בעל תחתית עגולה של פוליסטירן 5 מ"ל, וזהו את יעילות הזיהום של הפלואורסצנציה של הנגיף (חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP+) באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- חשב את טיטר הנגיף המרוכז באמצעות הנוסחה הבאה: 105 (נפח תא) × שיעור ההדבקה (GFP+%)/נפח הנגיף המוסף (0.1 μL או 0.2 μL).
2. תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים (איור 2A)
- מצפים באר אחת של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות עם 1 מ"ל של תמיסת ג'לטין 0.1% בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות. ודא כי הבאר מכוסה לחלוטין עם תמיסת ג'לטין 0.1%. שאפו לתמיסת הג'לטין 0.1% לאחר הציפוי.
הערה: הכינו תמיסת ג'לטין 0.1% (100 מ"ל) באופן הבא: 0.1 גרם אבקת ג'לטין מומסת ב-100 מ"ל של מים אולטרה-אפורים בבקבוק זכוכית אוטו-קליפה ולאחר מכן מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מחודשיים. - צלחת 5 × 104 MEFs לבאר אחת של צלחת 6 בארות המצופה בג'לטין 0.1% (כמו בשלב 2.1), ותרבית תאים אלה עם תווך נורמלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO2 למשך הלילה.
- לאחר 24 שעות, לאשר כי MEFs הגיעו 40-50% מפגש. החלף את המדיום במדיום רגיל.
- ביום 0, מוציאים את הנגיף המרוכז מהמקפיא וממיסים את הנגיף על קרח. חשב את נפח הווירוס שיש להוסיף באמצעות eq. (1). הוסף את הווירוס המרוכז עבור ששת גורמי השעתוק, Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ו- Snai2 (ראה טבלת חומרים) לכל באר בהתאם לנפח המחושב, ולאחר מכן הוסף 4 מיקרוגרם /מ"ל של חומר הטרנספקציה הפולימרי הקטיוני.
מספר תא (5 × 104) × 30 (ריבוי זיהום, MOI)/וירוס טיטר (1) - ביום הראשון, 8-12 שעות לאחר ההדבקה, הסירו את המדיום המכיל את הנגיף והחליפו אותו במדיום תקין טרי תוך הוספת 0.5 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין לסינון קווי תאים נגועים יציבים.
- ביום 2, 48 שעות לאחר ההדבקה, החליפו את התווך הסופר-נטנטי בהדרגה במדיום התכנות מחדש. ראשית, שנה 1/4מהנפח הבינוני הכולל, והוסף 3 μM CHIR99021.
- מיום 3 עד יום 7, בהתאם למצב התאים, שנה את המדיום על ידי החלפה בשיעור גבוה יותר של מדיום תכנות מחדש (ראה טבלה 1) בהדרגה, ועבור לבינוני תכנות מחדש מלא תוך 5 ימים.
הערה: במהלך תקופה זו, יש להשתמש בפורומיצין וב- CHIR99021 מדי יום. תאים מתים רבים יופיעו ביום הראשון והשני של שינוי מדיום התכנות מחדש. זה נורמלי מכיוון שהתאים מסתגלים בהדרגה לטרנספורמציה. לכן, המדיום צריך להיות שונה בהדרגה כדי להבטיח את התפשטות בריאה של התאים. - כדי להעביר את התאים, הוסיפו 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA כדי לעכל את התאים במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר כ-60% מהתאים צפים למעלה, הפסיקו את העיכול על ידי הוספת מדיום תקין פי 2 מנפח אנזים העיכול. לאסוף את תרחיף התא בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, להסיר את הסופרנאטנט, להחזיר את גלולת התא עם מדיום התכנות מחדש, ולצלוח את התאים בצלחת סטרילית של 60 מ"מ בצפיפות של 3 × 104/ס"מ2. תרבית תאים אלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 של 5% לחות.
הערה: מהיום ה-8 ועד היום ה-21, תאים אלה עוברים תת-תרבית כל 3-5 ימים ומתרבית במנות סטריליות בקוטר 60 מ"מ כדי להתרחב. הם יכולים להיות מתורבתים כדי להגיע לפחות מעבר 5.
3. אופטימיזציה לתכנות מחדש וזיהוי ישירים
- סינון לגורמי השעתוק הממוטבים
- חזור על שלבים 2.1-2.7, תוך הפחתת אחד מששת גורמי השעתוק בכל פעם. הדביקו את ה-MEFs בנגיף בשילובים של חמישה גורמי שעתוק.
- שבעה ימים לאחר ההדבקה, הוציאו את הרנ"א של התאים האלה16, וניתחו את רמות הביטוי של הגנים המלנוציטיים שלהם באמצעות PCR של שעתוק הפוך (RT-PCR)17 כדי לסנן את גורמי השעתוק בעלי ההשפעה הגדולה ביותר על ההמרה למלנוציטים על ידי הסרתם בזה אחר זה (איור 3A).
- השתמש בשלושת גורמי השעתוק המובילים המשפיעים על ההמרה למלנוציטים כדי להדביק את ה- MEFs. חזור על שלבים 2.1-2.7.
הערה: שבעה ימים לאחר ההדבקה, הגנים המלנוציטיים צריכים להיות ניתנים לזיהוי בתאים שעברו טרנספורמציה (איור 3B). מידע ראשוני לאפיון iMels כלול בטבלה 3.
- זיהוי מלנוציטים מושרים (iMels)
- השתמשו בכתם אימונופלואורסצנטי18 כדי לוודא שה-iMels מבטאים חלבונים מלנוציטיים, כולל TYRP-1 ו-DCT (איור 4A).
- כתם ספציפי למלנין 3,4-דיהידרוקסיפנילאלנין (DOPA) ספציפי למלנין (איור 4B)
- הכן 4% paraformaldehyde (10 מ"ל) כדלקמן: להמיס 0.4 גרם של אבקת paraformaldehyde ב 10 מ"ל PBS. מניחים את התמיסה בתנור בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לקדם את הפירוק.
הערה: הפתרון יכול להישמר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מחודש. - מרבים את ה-iMels במנה של 30 מ"מ ושוטפים את המנה פעמיים עם PBS שחומם מראש. מוסיפים 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד כדי לתקן את התאים למשך 20 דקות, ושטפו את המנה 3 פעמים עם PBS.
- הכינו תמיסת כתמי DOPA 0.1% (10 מ"ל) ממש לפני השימוש על ידי המסת 0.01 גרם אבקת L-DOPA ב-10 מ"ל של PBS. הניחו את התמיסה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; לנער אותו מספר פעמים כדי לקדם פירוק.
- הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת צביעת DOPA 0.1% שהוכנה זה עתה. דגירה בתנור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-5 שעות. אם אין חלקיקים חומים-שחורים, יש להמשיך לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות נוספות, אך לא למשך >5 שעות. בדוק את הדגימות כל 30 דקות.
- יש לשטוף את המנה 3 פעמים עם PBS למשך דקה אחת בכל פעם. הכתימו את הגרעין ב-1 מ"ל של תמיסת צביעת המטוקסילין למשך 2 דקות.
- לאחסון לטווח ארוך, לייבש את הדגימות באמצעות 95% אתנול במשך 3 דקות ולאחר מכן 100% אתנול למשך 5 דקות. אוטמים את המנה בקסילן ובבלזם נייטרלי.
- הכן 4% paraformaldehyde (10 מ"ל) כדלקמן: להמיס 0.4 גרם של אבקת paraformaldehyde ב 10 מ"ל PBS. מניחים את התמיסה בתנור בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לקדם את הפירוק.
- צביעת מאסון-פונטנה ספציפית למלנין (איור 4B)
- צלחת iMels בצלחת 30 מ"מ ולתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות; לשטוף את המנה 3 פעמים עם PBS.
- הוסיפו 1 מ"ל של תמיסה A (תמיסת כסף אמוניה) מתוך ערכת הכתמים של מאסון-פונטנה (ראו טבלת חומרים), הניחו את המנה בקופסה כהה והניחו את הקופסה הכהה בתנור בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15-40 דקות.
הערה: אם חלקיקים חומים-שחורים אינם נראים לאחר 15 דקות בתנור, החזירו את הדגימות לתנור של 56 מעלות צלזיוס כדי להמשיך לדגר אך לא למשך >40 דקות. ניתן להוסיף מעט מים לקופסה הכהה כדי למנוע התייבשות. - שאפו לפתרון A ושטפו את התבשיל 5-6 פעמים במים מזוקקים, 1-2 דקות בכל פעם.
- הוסיפו תמיסה B של 1 מ"ל (היפו תמיסה) מתוך ערכת הכתמים של Masson-Fontana, והשאירו את המנה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
- שאפו לתמיסה B ושטפו את הכלים במי ברז 3 פעמים, דקה בכל פעם.
- הוסיפו 1 מ"ל של תמיסה C (צבע אדום נייטרלי) מתוך ערכת הכתמים של Masson-Fontana, והשאירו את המנה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
- שאפו לתמיסה C ושטפו את התבשיל 3 פעמים במים מזוקקים, דקה אחת בכל פעם.
- מוסיפים 1 מ"ל של 100% אתנול להתייבשות מהירה, ושואפים את האתנול לאחר 3 דקות.
הערה: ניתן לאחסן דגימות מוכתמות במשך זמן רב לאחר איטום עם קסילן ובלסם נייטרלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מאמר זה כולל את הפרוטוקולים של מערכת אריזה מרוכזת של lentivirus לייצור lentivirus של גורמי שעתוק לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים ופרוטוקולים לסינון גורמי שעתוק ותכנות מחדש ישיר של מלנוציטים מ- MEFs.
ההצלחה של ייצור לנטי-וירוס מרוכז הוערכה על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנטיות של GFP (איור 1A) או על ידי ציטומטריית זרימה (איור 1B) לאחר הדבקת תאי HEK-293T במשך 48 שעות בנגיף לנטי לא מרוכז (1x) ובנגיף לנטי מרוכז (100x). הטיטר של הנגיף המרוכז היה 108 TU /mL או יותר, שהוא גבוה יחסית (איור 1C).
תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים מושג באמצעות הזיהום עם גורם השעתוק lentivirus וטרנספורמציה עם מדיום התכנות מחדש המותאם. הסכימה ליצירת iMels מ-MEFs מוצגת באיור 2A. המורפולוגיה של התא משתנה בהדרגה במהלך תכנות מחדש ישיר. הסינפסות של התאים מתארכות, וגרעיני התא גדלים. עם זאת, תאים אלה מזדקנים בהדרגה לאחר ~יום 20 (~5 מעברים) (איור 2B).
גורם שעתוק אחד הוסר בכל פעם מהסט המקורי של שישה גורמי שעתוק (Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ו-Snai2) כדי לקבוע את גורם השעתוק עם ההשפעה הגדולה ביותר על תכנות מחדש. הסרת Mitf, Pax3 או Sox10 הביאה להשתקת הביטוי של הגנים המלנוציטיים Tyr, Tyrp1 ו-Mlana (איור 3A), מה שמצביע על כך שלשלושת גורמי השעתוק האלה הייתה ההשפעה הגדולה ביותר על המרת פיברובלסטים למלנוציטים. הביטוי של גנים מלנוציטיים המושרים על ידי תכנות מחדש ישיר עם שלושה גורמי שעתוק היה גבוה יותר מזה של כל ששת גורמי השעתוק (איור 3B).
לבסוף, זוהו המאפיינים של iMels שהושגו באמצעות מערכת אופטימלית זו של תכנות מחדש ישיר. הביטוי של סמנים מלנוציטיים (TYR, TYYP1) זוהה באמצעות כתמים אימונופלואורסצנטיים (איור 4A). שיטות צביעה ספציפיות למלנין, כולל צביעת DOPA ו-Masson-Fontana, הראו גם הן תוצאות חיוביות (איור 4B).
איור 1: ייצור של נגיף מרוכז והערכה של titer. (A) עוצמת הפלואורסצנציה של GFP לאחר הדבקת תאי HEK-293T בנגיף לנטי לא מרוכז (1x) ובנגיף לנטי מרוכז (100x) (B) השוואה של שיעורי ההדבקה של נגיף לנטי לא מרוכז (1x) ונגיף לנטי מרוכז (100x) כפי שזוהו על ידי ציטומטריה של זרימה. (C) הערכת טיטר של נגיף הלנטי המרוכז. פסי קנה מידה = 250 מיקרומטר. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; TU = יחידות מתמרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: יצירת iMels מ-MEFs. (A) דיאגרמה סכמטית של דור iMels. (B) שינויים במורפולוגיה של התא במהלך ההמרה מ-MEFs ל-iMels בתכנות מחדש ישיר ביום 0, ביום ה-3, ביום ה-10 וביום ה-20+. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: iMels = מלנוציטים מושרים; MEFs = פיברובלסטים עובריים של עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: סינון לגורמי שעתוק ממוטבים. (A) qRT-PCR של רמות ה-mRNA של צור, Tyrp1 ו-Mlana בתאים שעברו התמרה עם חמישה גורמי שעתוק (אחד מששת גורמי השעתוק המקוריים הוסר). MEF + EV ו- MEF + 6F משמשים כבקרה שלילית ושליטה חיובית, בהתאמה. ביטוי ה-mRNA מנורמל לביטוי גאדה. (B) רמות qRT-PCR של Tyr,Tyrp1 ו-MRNA של מלאנה בתאים שהתומרו עם ששת גורמי השעתוק המקוריים ועם שלושה גורמי שעתוק. MEF, MEF + EV ו- MMC משמשים כבקרה ריקה, שלילית וחיובית, בהתאמה. רמות ה-mRNA מנורמלות לרמות של Gapdh. כל הערכים הם ממוצעים ± SD של שלושה ניסויים עצמאיים. רצפי הפריימרים מוצגים בטבלה 3. קיצורים: qRT-PCR = PCR תעתיק הפוך כמותי PCR; MEF = פיברובלסטים עובריים של עכברים; MEF+EV = פיברובלסטים עובריים של עכבר + וקטור ריק; MMC = מלנוציט עכבר; 6F = שישה גורמי שעתוק הכוללים את Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ו- Snai2; 3F: שלושה גורמי שעתוק הכוללים את Mitf, Pax3 ו-Sox10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: זיהוי פונקציונלי של iMels. (A) חיסון של סמנים מלנוציטיים (TYR, TYYP1) ב-iMels. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. ראה את טבלת החומרים לדילול נוגדנים המשמשים במחקר זה. (B) צביעת מאסון-פונטנה וצביעת DOPA. MEF וקו התאים Melan-a משמשים כבקרה שלילית ושליטה חיובית, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: iMels = מלנוציטים מושרים; DOPA = 3,4-דיהידרוקסיפנילאלנין; MEF = פיברובלסט עוברי של עכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| רכיבים | מינון (ריכוז, נפח) | ריכוז סופי | |
| בינוני רגיל (100 מ"ל) | DMEM/גלוקוז גבוה | 89 מ"ל | |
| FBS מומת חום | 10 מ"ל | ||
| אנטיביוטיקה(עט/סטרפ) | 10000 U/mL, 1 מ"ל | 100 U/mL | |
| תכנות מחדש של מדיום (100 מ"ל) | RPMI-1640 | 88 מ"ל | |
| FBS מומת חום | 10 מ"ל | ||
| SCF אנושי רקומביננטי | 200 מיקרוגרם/מ"ל, 50 μL | 100 ננוגרם/מ"ל | |
| bFGF אנושי רקומביננטי | 4 מיקרוגרם/מ"ל, 250 μL | 10 ננוגרם/מ"ל | |
| אינסולין אנושי רקומביננטי | 10 מ"ג/מ"ל, 50 μL | 5 מיקרוגרם/מ"ל | |
| EDN3 אנושי | 100 מיקרומטר, 100 μL | 0.1 מיקרומטר | |
| רעלן כולרה | 0.3 מ"ג/מ"ל, 0.56 מיקרול' | 20 pM | |
| פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (TPA) | 1 mM, 20 μL | 200 ננומטר | |
| הידרוקורטיזון | 100 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מיקרול | 0.5 מיקרוגרם/מ"ל | |
| אדנין | 40 מ"ג/מ"ל, 60 מיקרול | 24 מיקרוגרם/מ"ל |
טבלה 1: רכיבים של מדיה רגילה ותכנות מחדש.
| צלחת תרבות | צפיפות זריעה (תאים/צלחת) | בינוני (מ"ל) | מערכת פלסמיד | מגיב טרנספקציה (μL) | ||
| יעד פלסמיד (מיקרוגרם) | PMD2. G (מיקרוגרם) | PSPAX2 (מיקרוגרם) | ||||
| 35 מ"מ | 6 ×105 | 1.5 | 1.5 | 0.5 | 1 | 6 |
| 60 מ"מ | 1.5 × 106 | 3.5 | 3 | 1 | 2 | 12 |
| 100 מ"מ | 4 × 106 | 8 | 8 | 3 | 6 | 34 |
טבלה 2: פרטים על מערכת האריזה של נגיף הלנטי.
| פריימרים RT-PCR | |
| יעד | ערכות פריימרים |
| גאפדה | קדימה: CAACGACCCCTTCATTGACC |
| הפוך: CATTCTCGGGGTTGACTGTG | |
| צור | פורוורד: GGGCCCAAATTGTACAGAGA |
| הפוך: ATGGGTGTTGACCCATTGTT | |
| Tyrp1 | קדימה: AAGTTCAATGGCCAGGTCAG |
| הפוך: TCAGTGAGGAGAGGGGTT | |
| מלאנה | קדימה: AGACGCTCCTATGTCACTGCT |
| הפוך: TCAAGGTTCTGTATCCACTTCGT |
טבלה 3: מידע על הפריימר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
איכות הנגיף חיונית להצלחת התכנות מחדש הישיר למלנוציטים בפרוטוקול זה. השיטה של אריזה וריכוז וירוסים בפרוטוקול זה היא פשוטה וקלה לחזרה ואינה מסתמכת על כל מגיב מרוכז עזר אחר. פרוטוקול זה ניתן לעקוב בהצלחה ברוב המעבדות. כדי להבטיח את איכות הנגיף המרוכז, הנקודות הבאות זקוקות לתשומת לב מיוחדת. האחד הוא מצב התא של HEK-293T. למרות שתאי HEK-293T הם תאים מונצחים, התאים המשמשים לייצור הנגיף המרוכז חייבים להיות תאים בריאים בתוך 10 מעברים (הטיטר יורד עם מעברים גבוהים יותר).
נקודה קריטית נוספת היא חלקו של מגיב הטרנספקציה (במקרה זה, ליפופקטאמין) בו נעשה שימוש. מכיוון שהתאים ניזוקים לאחר הוספת מגיב הטרנספקציה, יש לבדוק שוב ושוב את היחס בין המגיב לפלסמידים כדי להבטיח את מצבם האופטימלי של התאים ואת איכות הנגיף. היחס של 2:1 בין מגיב טרנספקציה לפלסמידים מתאים ביותר לתאי HEK-293T לאריזת הנגיף במערכת זו. בנוסף, כל השלבים דורשים טיפול עדין לאורך כל התהליך. מכיוון שחלקיקי הנגיף יכולים להיספג לאחר הציפוי, מה שמשפיע על טיטר הנגיף, לא מומלץ לצפות את המנה בשום מטריצה בעת אריזת הנגיף. בשל האפשרות של ניתוק של HEK-293T, supernatant חייב להיות מוחלף בזהירות, במיוחד כאשר מתווספים מדיום טרי לאחר איסוף supernatant וירוס לאחר 24 שעות. כמה שיקולים אחרים כוללים את צפיפות התאים, משך זמן הטרנספקציה ותכולת הסרום במדיום. אלה נושאים חשובים שמשפיעים על יעילות הטרנספקציה. התנאים המוצגים בפרוטוקול זה הם המתאימים ביותר, בהתבסס על תוצאות שהתקבלו לאחר ניסויים חוזרים רבים.
בתהליך של תכנות מחדש ישיר למלנוציטים, חשוב לקחת בחשבון את מצב ה- MEFs המקוריים של התא ואת הצפיפות של MEFs המשמשים לתכנות מחדש ישיר. לפני שמתחילים את התכנות מחדש הישיר, MEFs חייבים להיות מתורבתים במנות תרבית תאים שאינן מצופות. יש לבחור תאים בשלב ההתפשטות (40-50% מפגש) לתכנות מחדש ישיר; יעילות הזיהום פוחתת עם הגדלת צפיפות התאים. התאים המתוכנתים מחדש צריכים להיות מצופים בכלי תרבית מצופים ג'לטין.
משך הזמן הדרוש לנגיף כדי להדביק תאים הוא גם קריטי; זמן הדבקה ארוך מדי יפגע בהישרדות התאים, בעוד שזמן הדבקה קצר מדי יפחית את היעילות. שמונה שעות נמצאו מתאימות לנגיף המרוכז להדביק MEFs בפרוטוקול זה. הנקודה הקריטית האחרונה היא הדרך הנכונה לשנות את מדיום התכנות מחדש. MEFs צריכים להסתגל למדיום חדש. יש לבדוק את מצב התאים מדי יום, ולשנות את המדיום בזהירות בהתאם למצב התא. שינוי מדיום התכנות מחדש מהר מדי יגרום למותם של מספר רב של תאים.
בעת טיפוח ותת-תרבות iMels, צפיפות המעבר של התאים היא קריטית. iMels זקוקים לצפיפות גבוהה יחסית כדי לשמור על צמיחה. סינפסות תאים צריכות להיות במגע זו עם זו לצורך התפשטות נורמלית של תאים אלה. אם הצפיפות נמוכה מדי, התאים עלולים להפסיק להתרבות. כאן, הצפיפות של 3 × 104/ס"מ2 נמצאה כצפיפות מעבר מתאימה ל-iMels. לאחר 5 קטעים, ה-iMels מתחילים להזדקן (איור 2B); המלנין בוגר יותר בשלב זה, והתאים המתקבלים יכולים לשמש לצביעת אימונופלואורסצנציה, DOPA או צביעת מאסון-פונטנה. מעברים מוקדמים יותר של תאים יכולים לשמש עבור RT-PCR מכיוון שהביטוי של גנים ישתנה בשלב מוקדם יחסית.
למרות שתכנות מחדש ישיר נחקר באופן נרחב, יש מעט מחקר על תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים. מחקרים שונים השתמשו בגורמי שעתוק שונים14,15, מה שהוביל לבלבול רב. פרוטוקול זה מסביר כיצד לייצר וירוסים מרוכזים באיכות גבוהה ולסנן מספר גורמי שעתוק כדי לבחור את החשובים ביותר לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. למדיום נוספו גורמים תזונתיים לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים בפרוטוקול זה (טבלה 2). לבסוף, iMels פונקציונליים זוהו בהצלחה. מערכת התכנות מחדש הישירה של מלנוציטים ברורה וממוטבת יכולה לספק אסטרטגיות טיפול חדשות למחלות פיגמנטציה כגון ויטיליגו.
עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות על הטכנולוגיה המוצגת במאמר זה. ראשית, קשה להעריך את היעילות של פרוטוקול זה. ניתן לשלב את עריכת הגנים CRISPR-Cas9 עם פרוטוקול זה כדי לדפוק גנים מלנוציטיים, כגון צור או Tyrp-1, לתוך התאים הראשונים כדי לצפות באחוז התאים המושרים במהלך תהליך התכנות מחדש. בנוסף, מערכת המבוא לנטי-וירוס המשמשת בפרוטוקול זה עלולה לשאת את הסיכון של רקומבינציה של גנים ומוטציה בהחדרה19. בעתיד, ניתן יהיה להשתמש בשיטות מבוא יעילות ובטוחות יותר, כגון וקטורים של ביטוי חלבונים רקומביננטיים שאינם נגיפיים או וקטורים של mRNA. הניסוי בפרוטוקול זה עדיין נמצא בשלב מבחנה . השלב הבא הוא לתכנת מחדש את המלנוציטים ישירות in vivo, מה שגורם לעור ללא פיגמנטים להפוך לפיגמנט ולהשתמש במערכת התכנות מחדש הישירה כדי לתכנן טיפול יעיל של ויטיליגו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070638 ו-81770621) ומהקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20180281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | Stored at -20 °C |
| 0.45 μM filter | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% ethanol | LANBAO | 210106 | Stored at RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | Stock concentration 40 mg/mL Final concentration 24 µg/mL |
| Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a | Invitrogen | A21137 | Dilution of 1:500 to use |
| Antibiotics(Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | Stored at -20 °C |
| Anti-TRP1/TYRP1 Antibody | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| Anti-TRP2/DCT Antibody | Abcam | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final concentration 3 μM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Stock concentration 0.3 mg/mL Final concentration 20 pM |
| Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | Dilution of 1:500 to use |
| DMEM (High glucose) | HyClone | SH30243.01 | Stored at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Stored at RT |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Stored at -20 °C Heat-inactivated before use |
| Gelatin | Sigma | G9391 | Stored at RT |
| GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | Stored at -20 °C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | Stored at RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | Stock concentration 100 μM Final concentration 0.1 μM |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 µg/mL Final concentration 0.5 µg/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | Stored at RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent, stored at 4 °C |
| Masson-Fontana staining kit | Solarbio | G2032 | Stored at 4 °C |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | Stored at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Stored at RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | Stored at RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | Stock concentration 1 mM Final concentration 200 nM |
| Polybrene | Sigma | H9268 | cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 μg/µL Final concentration 4 ng/µL |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | Stored at -20 °C |
| Recombinant human bFGF | Invitrogen | 13256-029 | Stock concentration 4 μg/mL Final concentration 10 ng/mL |
| Recombinant human insulin | Sigma | I3536 | Stock concentration 10 mg/mL Final concentration 5 µg/mL |
| Recombinant human SCF | R&D | 255-SC-010 | Stock concentration 200 μg/mL Final concentration 100 ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Stored at 4 °C |
| Xylene | Sigma | 1330-20-7 | Stored at RT |
References
- Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N.
- Picardo, M., et al.
- Speeckaert, R., van Geel, N. Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).
- Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).
- Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H.
- Bishnoi, A., Parsad, D. Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments. International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).
- Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success. Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).
- Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).
- Kurita, M., et al. In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue. Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nature Communications. 5, 5807 (2014).
- Fehrenbach, S., et al. Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage. Scientific Reports. 6, 28891 (2016).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).
- Bachman, J.
- Donaldson, J. G.
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
