Summary
Regulatorer af melanocytfunktioner styrer synlige forskelle i pigmenteringsresultatet. Dekryptering af den molekylære funktion af kandidatpigmenteringsgenet udgør en udfordring. Heri demonstrerer vi brugen af et zebrafiskmodelsystem til at identificere kandidater og klassificere dem i regulatorer af melaninindhold og melanocytantal.
Abstract
Melanocytter er specialiserede neurale kamafledte celler, der findes i den epidermale hud. Disse celler syntetiserer melaninpigment, der beskytter genomet mod skadelige ultraviolette strålinger. Perturbationer i melanocytfunktion fører til pigmentforstyrrelser såsom piebaldisme, albinisme, vitiligo, melasma og melanom. Zebrafisk er et fremragende modelsystem til at forstå melanocytfunktioner. Tilstedeværelsen af iøjnefaldende pigmenterede melanocytter, let genetisk manipulation og tilgængelighed af transgene fluorescerende linjer letter undersøgelsen af pigmentering. Denne undersøgelse anvender brugen af vildtype og transgene zebrafisklinjer, der driver grønt fluorescerende protein (GFP) ekspression under mitfa - og tyrp1-promotorer , der markerer forskellige stadier af melanocytter.
Morfolinobaseret hæmning af kandidatgener opnås for at evaluere det fænotypiske resultat på larvepigmentering og kan anvendes til screening for pigmenteringsregulatorer. Denne protokol demonstrerer metoden fra mikroinjektion til billeddannelse og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)-baseret dissektion af fænotyper ved hjælp af to kandidatgener, kulsyreanhydrase 14 (Ca14) og en histonvariant (H2afv), til omfattende vurdering af pigmenteringsresultatet. Endvidere demonstrerer denne protokol adskillelse af kandidatgener i melanocytspecificerere og differentiatorer, der selektivt ændrer henholdsvis melanocyttal og melaninindhold pr. Celle.
Introduction
Mens brugen af melanin til fotobeskyttelse har udviklet sig flere gange på tværs af dyreriget, har hvirveldyr tilsyneladende perfektioneret processen. Dedikerede pigmentproducerende celler med et omfattende maskineri til syntetisering og indhold af melanin bevares fra fisk til mennesker1. Resultatet af pigmentering er imidlertid dramatisk varieret, lige i farven til recipience og præsenterer som levende mønstre på integreringer, hud og hår2. På trods af mangfoldigheden er repertoiret af gener, der er involveret i pigmenteringsrespons, slående bevaret. Kernekomponenterne i melaninsyntetiseringsmaskineriet, såsom de vigtigste melaninsyntetiserende enzymer, komponenterne i melanosomerne og opstrømsforbindelsen til signalvejen, forbliver i det væsentlige identiske på tværs af organismer. Subtile genetiske forskelle medfører dramatiske ændringer i pigmenteringsmønstrene observeret på tværs af arter3. Derfor giver en omvendt genetisk tilgang i en lavere hvirveldyrorganisme, zebrafisken (Danio rerio), en glimrende mulighed for at dechifrere involveringen af gener i gengivelsen af pigmenteret tilstand4.
Zebrafiskembryoner udvikler sig fra en encellet befrugtet zygote til en larve inden for et tidsrum på ~ 24 timer efter befrugtning (hpf)5. Påfaldende nok er de melanocytækvivalente celler - melanoforerne - store celler, der er til stede i dermis og er iøjnefaldende på grund af det mørke melaninindhold6. Disse neurale kamafledte celler udstråler ~ 11 hpf og begynder at pigmentere ~ 24 hpf 6,7. Konserverede genekspressionsmoduler har gjort det muligt at identificere nøglefaktorer, der orkestrerer melanocytfunktioner og ført til udviklingen af transgene fluorescerende reporterlinjer Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) og Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10, der mærker selektive stadier af melanocytudvikling. Brug af disse transgene fiskelinjer muliggør forhør af cellebiologi af melanocytter på organismeniveau i vævskonteksten med passende signaler i henhold til udviklingstidslinjerne. Disse reportere supplerer pigmentbaseret kvantificering af melanocytter og muliggør en særskilt vurdering af melanocyttal uanset melaninindhold.
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til dekryptering af melanocytternes biologi ved at vurdere to kritiske parametre, nemlig melaninindhold og melanocyttal. Mens førstnævnte er en almindelig funktionel aflæsning, der stammer fra et hypopigmenteringsrespons, er sidstnævnte forbundet med en reduktion i specifikationen eller overlevelsen af melanocytter og er ofte forbundet med genetiske eller erhvervede depigmenteringsbetingelser. Den overordnede strategi for denne omvendte genetiske skærm er at tavse udvalgte gener ved hjælp af en morpholino og undersøge de melanocytspecifikke resultater. Melaninindhold analyseres ved hjælp af billedbaseret kvantificering af gennemsnitlige grå værdier efterfulgt af bekræftelse ved hjælp af et melaninindholdsassay. Antallet af melanocytter på forskellige modningsstadier analyseres ved hjælp af billedbaseret kvantificering og bekræftes yderligere ved anvendelse af FACS-analyse. Her demonstreres screeningsprotokollen ved hjælp af to kandidatgener, nemlig kulsyreanhydrase 14, der er involveret i melanogenese, og en histonvariant H2AFZ.2, der er involveret i specifikationen af melanocytter fra neurale kamforløberpopulationen. Mens førstnævnte ændrer melaninindholdet og ikke melanocyttallene, ændrer sidstnævnte antallet af specificerede melanocytter og følgelig melaninindholdet i embryoet. Alt i alt giver denne metode en detaljeret protokol til at identificere et kandidatgens rolle i pigmentering og skelne dets rolle i at kontrollere melanocyttal versus melaninindhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafiskforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med den institutionelle dyreetiske godkendelse (IAEC) fra CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Indien (forslag nr. 45a). Alle bestræbelser blev gjort for at minimere dyrenes lidelser.
1. Injektion af morpholino i zebrafiskembryoner
- Brug en standard nåletrækker til at tegne meget skarpe og lukkede pipetter.
- Opløsningen indeholdende morpholino lægges i mikropipetterne ved hjælp af en mikrolæsserspids, og den indsættes i mikroinjektorapparatet. Stram skruen ordentligt for at låse mikropipetten.
BEMÆRK: Dosering standardisering af morpholinos er nødvendig. Den passende dosis har en overlevelsesrate på >70% og en specifik fænotype ved 24 hpf. - Skær spidsen af mikropipetten med fine pincet, og kalibrer den11.
- For at kalibrere injiceres 1 volumen morpholinoopløsning i kapillarrøret fra mikropipetten, idet injektionstiden holdes på 1 s. Gentag dette fem gange. Brug standarden 1 mm = 30 nL volumen til at finde det injicerede volumen i 5 s ved at holde kapillarrøret mod en måleskala. Brug ovenstående oplysninger til at beregne den tid (i sekunder), der kræves for at injicere 1-3 nul pr. injektion12.
BEMÆRK: Standarden, 1 mm = 30 nL, er specifik for mikroinjektortrykindstillingerne og diameteren på kapillærrøret, der anvendes til kalibrering. Ideelt set skal injektionen foretages i æggeblomme-cellegrænsefladen, som dannes inden for 15-20 minutter efter befrugtning. For at lette flere injektioner kan udviklingen forsinkes en smule ved at holde embryonerne ved en lavere temperatur (18 °C). Dette bør dog holdes på et minimum og ikke forlænges ud over 30 minutter på grund af den sammensatte effekt af lavere temperatur på genekspressionsændringer. - Monter embryonerne på en agarosestøbt petriskål (60 mm). Stak embryonerne tæt inden for højderne. Brug brandpolerede glaspipetter til at justere dem i den rigtige retning til injektion.
- Under et mikroskop skal du bruge manipulatorer til at bringe mikropipetten tættere på embryoet og injicere inde i æggeblommecellegrænsefladen ved at trykke på fodkontakten.
- Injicer alle embryoner på samme måde; De opsamles i en petriskål med frisk embryovand og inkuberes ved 28 °C.
- Kontroller de injicerede embryoner efter 6-8 timer. Fjern alle de døde embryoner, der kan identificeres på grund af deres høje opacitet, og fortsæt med at skifte embryovand mindst en gang om dagen for at undgå infektion.
2. Pigmentering analyse
- Forberedelse til tælling af laterale midline melanoforer i 3 dpf zebrafiskembryoner
- Behandl embryoner med 0,016% neuromuskulær bedøvelse for at immobilisere dem.
- For at montere embryonerne til billeddannelse tilsættes et par milliliter 1,5-2% methylcellulose i petriskålen (60 mm), så den danner et tyndt lag. Brug en Pasteur-pipette til at udtage embryoner og placere dem forsigtigt i methylcellulose for at begrænse yderligere bevægelse under billeddannelsen.
- Juster deres position for optimal lateral (dorsal stribe, ventral stribe, æggeblommestribe og mid-line melanoforer) eller dorsal (melanoforer på den dorsale del af hovedet) billeddannelse. For bedre opløsning af tilstødende melanoforer, billede ved højere forstørrelse (>5x)
- Brightfield-billedbehandling
BEMÆRK: Brightfield-billeddannelse udføres ved hjælp af et stereomikroskop med 8-10x forstørrelse.- Sæt petriskålen med zebrafiskens embryoner under mikroskopet. Brug en manipulator til at justere fisken i en sådan retning, så alle fem melanocytembryonale striber er synlige (dorsal, ventral, to laterale, æggeblomme) samtidigt (figur 1C). Tag hurtigt billeder ved hjælp af anskaffelsessoftwaren. I tilfælde af at dyret genvinder bevægelse, før det er afbildet, skal du nedsænke det igen i bedøvelse og fortsætte med billeddannelse, når det er tilstrækkeligt immobiliseret.
- Gentag dette med alle fiskene, og sørg for, at forstørrelsen forbliver den samme for hvert billede.
- Beregning af gennemsnitlig grå værdi ved hjælp af ImageJ-software
- Tag dorsale og laterale billeder af 2 dpf zebrafiskembryoner.
- Åbn det billede, der skal kvantificeres i ImageJ, ved hjælp af værktøjet Åbn . Brug værktøjet Frihåndsform til at skitsere det område, der skal analyseres. Gå til indstillingen Indstil målinger , og vælg Gennemsnitlig grå værdi | område. Tryk på M (eller Analysér | Mål) for at beregne den gennemsnitlige grå værdi for det valgte område.
- Hold det område, der skal analyseres, konstant, og beregn det gennemsnitlige grå område for hvert dyr separat.
- Afbild et søjlediagram med de indsamlede data (figur 2F).
- Indhold af melanin analyse
- Ved 2 dpf skal du bruge en glaspasteurpipette til at indsamle ~ 25 zebrafiskembryoner.
- Udfør manuel dechorionation ved hjælp af 1 ml insulinnåle og tilsæt dem til 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
- Kassér embryomediet omhyggeligt og tilsæt 1 ml iskold lysisbuffer (20 mM natriumphosphat (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) med proteasehæmmercocktail og fremstil proteinlysater ved sonikering.
- Lysaterne opløses i 1 ml 1 N NaOH og inkuberes prøverne ved 100 °C i 50 minutter i vandbad. Vortex det intermitterende for at homogenisere lysaterne fuldstændigt.
- Der foretages absorbansaflæsninger af prøverne ved 490 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
- Melaninindholdet beregnes ved at sammenligne prøveabsorbansen med en standardkurve over kendte koncentrationer af syntetisk melanin (figur 2G).
3. Melanofortælling
BEMÆRK: Fluorescensanalyse i transgene zebrafiskembryoner kan udføres ved to metoder: 1) tælling af GFP-positive celler; 2) måling af fluorescensintensitet.
- Forberedelse til FACS-baseret tælling af GFP-positive celler i tidlige zebrafiskembryoner
- Saml 200-250 ftyrp:GFP embryoner og vask dem i en sil med almindeligt embryovand. Som en negativ kontrol, behandle GFP-negative, fasematchede vildtypeembryoner (Assam Wildtype)12.
- Afhængigt af interessestadiet overføres embryonerne til en petriskål, der indeholder 0,6 mg/ml pronase. Efter 5-10 minutter overføres de dechorionerede embryoner til en frisk petriskål med almindeligt embryovand. Brug en glaspasteurpipette til at samle ~100 embryoner og overføre dem til et 2 ml mikrocentrifugerør.
- Mediet kasseres forsigtigt, og der tilsættes 200 μL iskold Ringer-opløsning (deyolking buffer). Hold røret på is, pipette indholdet op og ned ~ 20 gange, indtil æggeblommen er opløst. Glassene centrifugeres ved 100 × g i 1 min i en bordcentrifuge ved 4 °C. Supernatanten centrifugeres igen, og supernatanten kasseres forsigtigt.
- Brug en 1 ml pipette til at overføre de deyolkede embryoner til en petriskål indeholdende 10 ml trypsinopløsning (celledissociationsbuffer). Udfør det i flere petriskåle for at undgå overfyldning af embryonerne og ineffektiv trypsinisering. Brug en 1 ml pipette, bland opløsningen indeholdende embryolegemerne en eller to gange for at reducere aggregering.
- Petriskålene inkuberes ved stuetemperatur i 15 min (<24 hpf embryoner) eller 30 min (24-30 hpf embryoner). Opsug og dispenser suspensionen lejlighedsvis ved hjælp af en 1 ml pipette for at hjælpe med nedbrydning af celler.
- I inkubationsperioden initialiseres flowcytometermaskinen til celletælling.
- Anbring en 70 μm cellesil over et 50 ml konisk rør og før den trypsiniserede suspension gennem silen for at opnå en enkeltcellesuspension. Vask petriskålene med den samme suspension et par gange for at fjerne celler, der klæber til overfladen.
- Drej prøverne ved 450 × g, 4 °C i 5 minutter i en svingende skovlrotor.
- Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 1 ml iskold 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
- Centrifuger igen ved 450 × g, 4 °C i 5 min, og kassér supernatanten.
- Til sidst resuspenderes pelleten i PBS + 5% føtalt bovint serum og opbevares på is, indtil FACS-kørslen.
- Forberedelse af flowcytometeret
- Tænd flowcytometeret og start opstart.
BEMÆRK: Før du tænder for maskinen, skal du tømme affaldsspanden og fylde kappevæsketanken. - Normaliser strømmen af strømmen til en 70 μm (eller 85 μm) dyse. Lad det stå uforstyrret i 10-15 min, hvis det er ustabilt.
- Tænd flowcytometeret og start opstart.
- Tælling af fluorescerende mærkede celler ved hjælp af et flowcytometer
- Initialiser en ny eksperimentmappe, og lav et punktdiagram med fremadrettet spredning versus sidespredning og et histogram af fluoresceinisothiocyanatintensitet (FITC).
- Indlæs vildtypecellerne først for at indstille spredningsportene fremad og på siden (for at udelukke dubletter og snavs) og FITC-tærsklen.
- Når portene er indstillet, skal du fjerne prøven og indlæse cellerne isoleret fra Tg (ftyrp1: GFP) embryoner for at tælle melanocytter.
BEMÆRK: Her, da ftyrp1: GFP specifikt mærker modne melanocytter, vil antallet af GFP-positive celler under FITC-porten svare til antallet af melanocytter. - Gentag ovenstående trin med morpholino-injicerede prøver for at estimere og sammenligne antallet af melanocytter med kontrollen.
- Måling af fluorescensintensitet i zebrafiskembryoner
- Brug en glaspasteurpipette til at samle 100-120 embryoner og overføre dem til en petriskål, der indeholder almindeligt embryovand.
- Ved ~ 10-12 hpf overføres embryonerne til 0,003% 1-phenyl-2-thiourea for at hæmme pigmentering.
- Udfør manuel dechorionation ved hjælp af insulinnåle til billeddannelse af <48 hpf-embryoner.
- For at immobilisere embryoner skal du behandle dem med 0,016% tricain.
- For at montere embryoner til billeddannelse skal du lægge et par ml 1,5-2% methylcellulose i petriskålen (60 mm), så den danner et tyndt lag. Tilsæt embryonerne til methylcellulose for at begrænse yderligere bevægelse under billeddannelsen. Petriskålen med prøverne anbringes under mikroskop. Brug en pipettespids til at justere dyret i den ønskede retning.
- Hent billeder ved hjælp af anskaffelsessoftwaren. For embryoner <24 hpf fanges hele embryoet på én gang under 10x forstørrelse. For >24 hkf trin, erhverve flere scan-felter og derefter samle (sy) dem sammen.
- Gentag dette med alle fiskene, og sørg for, at indstillingen for erhvervelse forbliver konstant gennem eksperimentet.
- Kvantificering
- Analyser billedet yderligere ved hjælp af ImageJ-software.
- Åbn det billede, der skal kvantificeres i ImageJ, ved hjælp af værktøjet Åbn .
- Brug frihåndsværktøjet til at skitsere det område, der skal analyseres (figur 3E).
- Tryk på M (eller Analysér | Mål) for at opnå en valgt arealintensitetsmåling .
- Hold det areal, der skal analyseres, konstant, og beregn gennemsnitsintensiteten pr. areal for hvert dyr separat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbejdsprocessen beskrevet i figur 1 blev brugt til at udføre morfolin-baseret genetisk forstyrrelse på zebrafiskens encellestadie. Pigmenteringsanalyse blev udført ved hjælp af forskellige metoder, som nævnt nedenfor. For at illustrere de repræsentative resultater blev standardiserede mængder antisense morpholino rettet mod h2afv og ca14 gener injiceret i æggeblommen eller encellestadiet af zebrafiskembryoet. Den indledende fænotypning baseret på brightfield-billeddannelse blev udført 48 timer efter befrugtning (hpf), da alle de fem pigmenterede melanoforstriber (dorsal, ventral, æggeblomme, to laterale) var tydelige.
Figur 2A,B repræsenterer en metode til analyse af pigmentering ved at beregne antallet af laterale melanoforer pr. embryo. Laterale melanoforer blev manuelt talt på 48 hkf-stadiet ved at zoome ind på det laterale område af den vippede zebrafisk. En alternativ metode til kvantificering af de pigmenterede melanoforer (supplerende figur S1) involverer manuel tælling af hovedmelanoforerne ved at afbilde zebrafiskens dorsale billede.
Melaninindholdet pr. embryo beregnes ved at måle den gennemsnitlige grå værdi og holde interesseområdet konstant ved hjælp af ImageJ-software. Figur 2C-F viser, at den gennemsnitlige grå værdi af ca14 og h2afv morfaner var højere end i kontrolmorfanter. Da den gennemsnitlige grå værdi er omvendt proportional med melaninindholdet, førte knockdown af ca14- og h2afv-gener til et fald i melaninindholdet pr. embryo. En anden robust metode til kvantificering af melaninindholdet er en NaOH-baseret spektrofotometrisk absorptionsmetode. Som vist i figur 2G var det totale melaninindhold i ca14 morfanter mindre end i kontrolmorfanter.
Fluorescerende billeddannelse afslørede to forskellige stadier af zebrafiskmelanoforudvikling: tidligt specificerede melanoforer (mitfa: gfp) og differentierende melanoforer (ftyrp: gfp). Den morfolinobaserede ændring blev evalueret ved fluorescerende billeddannelse (figur 3A og figur 3C). For yderligere at validere disse observationer blev hyppigheden af GFP-positive celler beregnet ved hjælp af FACS. Knockdown af h2afv, men ikke ca14, reducerede signifikant antallet af melanoforer med hensyn til kontrol (figur 3A-D). Desuden kan en reduktion i den gennemsnitlige fluorescensintensitet/-areal beregnes ved hjælp af ImageJ-software, hvorved interesseområdet holdes konstant. H2afv-morfaner viser et signifikant fald i den gennemsnitlige fluorescerende intensitet/areal i forhold til kontrolmorfaner (figur 3E,F).
Figur 1: Workflow for en omvendt genetisk tilgang til at identificere regulatorer af melanocytbiologi ved hjælp af zebrafisk. (A) Rutediagram, der viser den eksperimentelle arbejdsgang fra mikroinjektion til evaluering af pigmentering ved forskellige metoder. (B) Mikroinjektionsnåleholder og mikromanipulator er sammen med et dissekerende mikroskop en typisk opsætning til mikroinjektion af zebrafiskembryoner i etcellestadiet. (C) Embryonalt melanocytmønster hos zebrafisk ved 3 dpf, der viser alle fem striber: dorsolateral, to laterale midterlinjer (spids af fire røde pile), ventral stribe og æggeblommestribe. (D) For at undersøge pigmenteringsresultatet ved morpholinoinjektion kan laterale midline melanoforer tælles under et stereomikroskop. Brightfield-billede af et dorsalt område ved 2 dpf; Melaninindholdet kan kvantificeres ved at måle den gennemsnitlige grå værdi. E) De gennemsnitlige grå værdier er omvendt proportionale med embryonets melaninindhold. Melaninfyldte melanoforer ved 2 dpf i vildtypeembryoner. (F) Melaninindholdsanalyse kan udføres for at estimere melaninproduktionen inden for disse melanoforer. Transgene zebrafisk, der mærker cellerne, der udtrykker TYRP1-protein ved 2 dpf. (G) Fluorescerende mærkede celler kan kvantificeres ved hjælp af FACS; skalabjælke = 100 μm. Transgene zebrafisk, der mærker cellerne, der udtrykker Mitfa-protein ved 1 dpf. Gennemsnitlig fluorescensintensitet pr. dyr kan måles ved hjælp af ImageJ-software. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: dpf = dage efter befrugtning; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tælling af laterale midline melanoforer, måling af gennemsnitlig grå værdi og melaninindholdsanalyse. Brightfield mikroskopiske billeder af det laterale billede af morfanter blev brugt til at kvantificere melaninindhold ved hjælp af ImageJ-software. (A) Kontrol- og histonvarianter h2afv (h2afv) morfanter ved 3 dpf; Til højre er zoomede bagagerum af disse embryoner, der viser melanocytnumre. (B) Antallet af melanoforer i h2afv-morfanter reduceres drastisk i forhold til kontrol, n > 10 hver ud af 3 biologiske replikater. (C) Repræsentativt billede af kontrol vs kulsyreanhydrase 14 morfanter ved 2 dpf. (D) Melaninkvantificering af ca14 vs kontrolmorfanter, n > 10 på tværs af 3 biologiske replikater. (E) Sidebillede af h2afv vs kontrolmorfanter ved 2 dpf. (F) Kvantificering af melaninindhold af h2afv vs kontrolmorfanter. Røde rektangler repræsenterer investeringsafkast, der er valgt til ImageJ-baseret analyse. G) Indhold af melaninindhold udført på embryoner, der injiceres i morfolin, til kvantificering af det samlede melaninindhold. Gennemsnit af tre uafhængige eksperimenter ± SEM.; **P < 0,01, **** P < 0,0001. Studerendes t-test; fejlbjælker er middelværdi ± standardfejl for middelværdien (SEM). Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: MO = morpholino; dpf = dage efter befrugtning; ROI = region af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af fluorescerende mærkede celler ved hjælp af FACS og måling af gennemsnitlig fluorescensintensitet. (A) Fluorescensbilleder af ca14 og kontrolmorferingsembryoner ved 2 dpf fra Tg (ftyrp1: GFP) linje, hvor de differentierende melanocytter er markeret ved GFP-ekspression. (B) Antallet af melanoforer i ca14 og kontrolmorfantembryoner ved 2 dpf forbliver uændret, n = 3 biologiske replikater. (C) Fluorescensbilleder ved 2 dpf af h2afv og kontrolmorfanter fra Tg(ftyrp1:GFP)-linjen. (D) Antallet af melanoforer i h2afv-morfanter er signifikant reduceret sammenlignet med kontrolmorfantembryonerne ved 2 dpf, n = 3 biologiske replikater. (E) Fluorescensbilleder af kontrol- og h2afv-morfantembryoner ved 36 hpf fra Tg (mitfa: GFP) med mærkede melanocytter. (F) MFI pr. dyr beregnes ved hjælp af ImageJ-software og vises som et søjlediagram, der viser individuelle datasæt. MFI er signifikant reduceret i h2afv morfanter sammenlignet med kontrol. Rødt rektangel repræsenterer ROI valgt til ImageJ-softwarebaseret analyse. n = 3 biologiske replikater; P < 0,001, ****P < 0,0001. Studerendes t-test; fejlbjælker er middelværdien ± standardfejl for middelværdien (SEM) skalastænger = 100 μm. Forkortelser: MO = morpholino; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; GFP = grønt fluorescerende protein; dpf = dage efter befrugtning; ROI = region af interesse; MFI = gennemsnitlig fluorescensintensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Kvantificering af hovedmelanoforer. (A) Dorsalt billede af h2AFV og kontrolmorfanter ved 48 hpf, der viser hovedmelanoforer. Rød boks repræsenterer investeringsafkastet. Ved at holde interesseområdet konstant kan antallet af hovedmelanoforer kvantificeres manuelt. (B) Antallet af melanoforer signifikant reduceret ved h2afv knockdown. Barer repræsenterer geometrisk gennemsnit med 95% CI af antallet af hovedmelanoforer pr. embryo med >30 embryoner hver. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: MO = morpholino; CI = konfidensinterval; HPF = timer efter befrugtning; ROI = region af interesse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Mikroarray af humane primære melanocytter behandlet med PTU. Varmekort viser ekspressionen af pigmenteringsgener (mitf, tyrosinase, dct, mc1r) ved behandling i humane primære melanocytter. Forkortelser: PTU = 1-phenyl-2-thiourea; tyr = tyrosinase. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pigmenteringsfænotype manifesteres ofte som ændringer i indholdet af melanin eller antallet af pigmentbærende melanocytter. Den metode, der er beskrevet heri, gør det muligt at diskonservere denne dikotomi og tillader både kvalitativ og kvantitativ vurdering af melaninindholdet og antallet af melanoforer pr. embryon, uanset melaninindholdet. Zebrafiskens høje frugtbarhed, pigmenterede melanocytters synlige natur og mangel på melanosomoverførsel muliggør dissektion af melanocytbiologi ved hjælp af denne omvendte genetiske tilgang, der er modtagelig for screening med medium gennemstrømning.
Valget af morpholino-baseret hæmning stammer fra den lette lyddæmpning og evnen til at teste flere kandidater parallelt. Der er visse begrænsninger ved at anvende en morfolinobaseret hæmningsmetode, og retningslinjer for brug og fortolkning af disse værdifulde værktøjer er blevet beskrevet tidligere13. I det væsentlige giver validering af fænotype ved knockdown ved hjælp af flere MO'er en håndgribelig løsning på dette problem. En alternativ strategi er brugen af CRISPR-baseret genetisk forstyrrelse. Fænotypens penetrans er begrænset på grund af den iboende lavere frekvens af genetiske hændelser og kan forværres af heterogene mutationer. Dette begrænser dets anvendelse til omvendt genetisk screening14.
Fænotypevurdering af melanocyt-selektive forstyrrelser resulterer ofte i nedsat pigmentindhold på grund af ændret melanogent respons. Der er imidlertid flere gener, der forstyrrer specifikationen af melanocytter og dermed forårsager en reduktion i pigmentering på grund af et fald i det samlede melanocytantal. En systematisk dissektion af de to scenarier er afgørende for at tilskrive genets molekylære funktion i pigmentering. Måling af melaninindhold forværres af den komplekse natur af melaninpolymer. Af de to tilgængelige metoder, nemlig melaninopløselighed ved NaOH og HPLC-baseret påvisning af stabile melaninoxidationsprodukter 1H-pyrrol-2,3,5-tricarboxylsyre og pyrrol-2,3- dicarboxylsyre, kan førstnævnte metode rutinemæssigt udføres i laboratorieomgivelser, mens sidstnævnte kræver specifikke standarder og sofistikeret instrumentering15.
Derudover er antallet af embryoner, der kræves af NaOH-metoden, også højere på grund af flere trin, der er involveret i påvisningen. NaOH-baseret hydrolyse opløser melanin og muliggør spektrofotometrisk kvantificering. Mens denne metode er robust og kan anvendes til en medium gennemstrømningsskærm (10-15 kandidater ad gangen), er xanthin, der er til stede i xantoforer, et potentielt interfererende stof på grund af dets iboende absorption i 400-450 nm-området16. Der skal derfor foretages en overensstemmelse mellem billedanalysebaseret bestemmelse af gennemsnitlig grå værdi og analyse af melaninindhold for at bekræfte reduktionen i melaninindholdet.
PTU tilbyder et nemt værktøj til at reducere pigmenteringen og visualisere det ellers gennemsigtige embryo. Anvendelsen kan muligvis resultere i feedbackændringer og påberåbe sig ændringer i melanocytter. Vi har dog observeret minimale ændringer i ekspressionen af pigmenteringsgener (supplerende figur S2).
Tællingen af melanocytter er nemmest i den laterale midterlinje og hovedregionen, da melanocytterne er relativt tydeligt observerbare i disse regioner (supplerende figur S1). Laterale liniemelanoforer stammer fra melanocytstamcellepopulationen, der ligger tæt på dorsalrodsganglierne18. Billeddannelse af denne population har flere fordele såsom fast antal pr. embryo og klar skelnen. Imidlertid skal de to kontralaterale linjer afbildes ved at vippe embryoet lidt; ellers smelter de to sammen på grund af embryoets gennemsigtige karakter, hvilket gør det vanskeligt at tælle (figur 1C versus figur 2C).
Zebrafisk melanoforer adskiller sig fra de pigmenterede celler i øjet, der stammer fra neuro-ektoderm. Disse kan skelnes ved deres placering i embryoet og er tydelige i øjet versus kropsmønsteret. I det FACS-baserede eksperiment kan de øjenafledte celler skelnes ved deres størrelse, da de er signifikant mindre end melanoforerne og kan lukkes ved hjælp af størrelses- eller spredningskriterier.
Estimater af melanocytter ved forskellige modningsstadier ved anvendelse af transgene linjer udføres let ved hjælp af billedbaseret kvantificering. Kvantificering af antallet af laterale melanoforer er robust, da deres antal varierer i et vindue mellem 2 dpf og 5 dpf på hver side af embryoet17. Antallet af laterale melanoforer bestemmes imidlertid af migration og etablering af en dorsal rodganglion-associeret stamcellepulje18. Derfor kan eventuelle ændringer i disse processer føre til en lignende observation. For at omgå denne forvirrende faktor er FACS-baseret estimering af alle melanoforer en håndgribelig løsning.
Alternativt kan kvantificering af hovedmelanoforer udføres som afgrænset i supplerende figur S1 som surrogat for melanofortal. Det er interessant at bemærke, at ændringerne i steady-state niveauer af melanocyttal kunne betyde to modsatte funktioner for det pågældende kandidatgen. Det kan enten resultere i nedsat specifikation af melanocytter fra neurale kamprækursorer eller forårsage melanocytspecifik død og skal behandles ved hjælp af metoder såsom tunnelanalysen. Variationer såsom mikroinjektioner efterfulgt af levende cellebilleddannelse ville muliggøre overvågning af andre melanocytspecifikke fænotyper såsom migration og mønster. Af interesse for pigmentcelleforskere ville være processen med melanosomoverførsel, som ikke er operativ i fiskesystemet. Imidlertid kan samordnet melanosombevægelse i melanoforer studeres med ændringer i levende cellebilleddannelse beskrevet heri med modifikationer. Alt i alt vil den detaljerede protokol, der præsenteres i denne videoartikel, gøre det muligt for pigmentcellebiologiforskere at forespørge kandidatgener og vurdere deres rolle i melanocytbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkender den økonomiske støtte fra Council for Scientific and Industrial Research vide project MLP2008 og Department of Science and Technology til projektet GAP165 for at støtte det arbejde, der præsenteres i dette manuskript. Vi takker Jeyashri Rengaraju og Chetan Mishra for deres hjælp med eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
- Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
- Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).
- Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
- Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
- Xu, Q.
- Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
- Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).
- Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
- Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).
- Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A.
- Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
- Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).
