Summary
I regolatori delle funzioni dei melanociti governano le differenze visibili nel risultato della pigmentazione. Decifrare la funzione molecolare del gene candidato della pigmentazione rappresenta una sfida. Qui, dimostriamo l'uso di un sistema modello di zebrafish per identificare i candidati e classificarli in regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.
Abstract
I melanociti sono cellule derivate dalla cresta neurale specializzate presenti nella pelle epidermica. Queste cellule sintetizzano il pigmento di melanina che protegge il genoma dalle radiazioni ultraviolette nocive. Le perturbazioni nel funzionamento dei melanociti portano a disturbi pigmentari come piebaldismo, albinismo, vitiligine, melasma e melanoma. Zebrafish è un eccellente sistema modello per comprendere le funzioni dei melanociti. La presenza di melanociti pigmentati cospicui, la facilità di manipolazione genetica e la disponibilità di linee fluorescenti transgeniche facilitano lo studio della pigmentazione. Questo studio impiega l'uso di linee di zebrafish selvatiche e transgeniche che guidano l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) sotto i promotori mitfa e tyrp1 che segnano vari stadi dei melanociti.
Il silenziamento basato su morfolino dei geni candidati è ottenuto per valutare l'esito fenotipico sulla pigmentazione larvale ed è applicabile allo screening dei regolatori della pigmentazione. Questo protocollo dimostra il metodo dalla microiniezione all'imaging e alla dissezione basata sulla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) dei fenotipi utilizzando due geni candidati, l'anidrasi carbonica 14 (Ca14) e una variante istonica (H2afv), per valutare in modo completo l'esito della pigmentazione. Inoltre, questo protocollo dimostra la segregazione dei geni candidati in specificatori e differenziatori di melanociti che alterano selettivamente il numero di melanociti e il contenuto di melanina per cellula, rispettivamente.
Introduction
Mentre l'uso della melanina per la fotoprotezione si è evoluto più volte in tutto il regno animale, i vertebrati hanno apparentemente perfezionato il processo. Le cellule produttrici di pigmenti dedicate con un elaborato macchinario per sintetizzare e contenere la melanina sono conservate dal pesce all'uomo1. Tuttavia, il risultato della pigmentazione è drammaticamente vario, che varia nel colore alla ricetta e si presenta come modelli vivaci su tegumenti, pelle e capelli2. Nonostante la diversità, il repertorio di geni coinvolti nella risposta alla pigmentazione è sorprendentemente conservato. I componenti principali del meccanismo di sintesi della melanina, come gli enzimi chiave che sintetizzano la melanina, i componenti dei melanosomi e la connettività a monte alla via di segnalazione, rimangono essenzialmente identici tra gli organismi. Sottili differenze genetiche determinano cambiamenti drammatici nei modelli di pigmentazione osservati in tutte le specie3. Quindi, un approccio genetico inverso in un organismo vertebrato inferiore, il pesce zebra (Danio rerio), offre un'eccellente opportunità per decifrare il coinvolgimento dei geni nel rendere lo stato pigmentato4.
Gli embrioni di zebrafish si sviluppano da uno zigote fecondato unicellulare a una larva entro un arco di ~ 24 ore dopo la fecondazione (hpf) 5. Sorprendentemente, le cellule equivalenti ai melanociti - i melanofori - sono grandi cellule che sono presenti nel derma e sono evidenti a causa del contenuto di melanina scura6. Queste cellule derivate dalla cresta neurale emanano ~11 hpf e iniziano a pigmentare ~24 hpf 6,7. I moduli di espressione genica conservati hanno permesso l'identificazione di fattori chiave che orchestrano le funzioni dei melanociti e hanno portato allo sviluppo di linee reporter fluorescenti transgeniche Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) e Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10 che marcano gli stadi selettivi dello sviluppo dei melanociti. L'utilizzo di queste linee di pesci transgenici consente l'interrogazione della biologia cellulare dei melanociti a livello dell'organismo nel contesto tissutale con segnali appropriati in base alle tempistiche di sviluppo. Questi reporter integrano la quantificazione dei melanociti basata sul pigmento e consentono una valutazione distinta del numero di melanociti indipendentemente dal contenuto di melanina.
Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per decifrare la biologia dei melanociti valutando due parametri critici, vale a dire il contenuto di melanina e il numero di melanociti. Mentre il primo è una lettura funzionale comune che emana da una risposta di ipopigmentazione, il secondo è associato a una riduzione della specifica o della sopravvivenza dei melanociti ed è spesso associato a condizioni genetiche o di depigmentazione acquisite. La strategia complessiva di questo screening genetico inverso è quella di silenziare geni selezionati utilizzando un morfolino e studiare i risultati specifici dei melanociti. Il contenuto di melanina viene analizzato utilizzando la quantificazione basata su immagini dei valori medi di grigio seguita dalla conferma mediante un test del contenuto di melanina. Il numero di melanociti nelle varie fasi di maturazione viene analizzato utilizzando la quantificazione basata su immagini e ulteriormente confermato utilizzando l'analisi FACS. Qui, il protocollo di screening è dimostrato utilizzando due geni candidati, vale a dire l'anidrasi carbonica 14, coinvolta nella melanogenesi, e una variante istonica H2AFZ.2 coinvolta nella specifica dei melanociti della popolazione precursore della cresta neurale. Mentre il primo altera il contenuto di melanina e non il numero di melanociti, il secondo altera il numero di melanociti specificati e, di conseguenza, il contenuto di melanina nell'embrione. Nel complesso, questo metodo fornisce un protocollo dettagliato per identificare il ruolo di un gene candidato nella pigmentazione e distinguere il suo ruolo nel controllo del numero di melanociti rispetto al contenuto di melanina.
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Protocol
Gli esperimenti sui pesci zebra sono stati condotti in stretta conformità con l'approvazione istituzionale dell'etica animale (IAEC) del CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), India (proposta n. 45a). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.
1. Iniezione di morfolino in embrioni di zebrafish
- Utilizzando un estrattore di aghi standard, disegnare pipet molto affilati e con punta chiusa.
- Caricare la soluzione contenente morpholino nelle micropipette utilizzando una punta di microcaricatore e inserirla nell'apparecchio del microiniettore. Stringere correttamente la vite per bloccare la micropipetta.
NOTA: È necessaria la standardizzazione del dosaggio dei morfolinos. Il dosaggio appropriato ha un tasso di sopravvivenza del >70% e un fenotipo specifico a 24 hpf. - Tagliare la punta della micropipetta con una pinza fine e calibrarla11.
- Per calibrare, iniettare 1 volume di soluzione di morfolino nel tubo capillare dalla micropipetta, mantenendo il tempo di iniezione a 1 s. Ripeti questa operazione cinque volte. Utilizzando lo standard, 1 mm = 30 nL volume, trovare il volume iniettato in 5 s mantenendo il tubo capillare contro una scala di misura. Utilizzando le informazioni di cui sopra, calcolare il tempo (in secondi) necessario per iniettare 1-3 nL per iniezione12.
NOTA: Lo standard, 1 mm = 30 nL, è specifico per le impostazioni di pressione del microiniettore e il diametro del capillare utilizzato per la calibrazione. Idealmente, l'iniezione deve essere effettuata nell'interfaccia tuorlo-cellula, che si forma entro 15-20 minuti dopo la fecondazione. Per facilitare le iniezioni multiple, lo sviluppo può essere leggermente ritardato mantenendo gli embrioni a una temperatura più bassa (18 °C). Tuttavia, questo dovrebbe essere ridotto al minimo e non esteso oltre i 30 minuti a causa dell'effetto combinato della temperatura più bassa sui cambiamenti di espressione genica. - Montare gli embrioni su una capsula di Petri colata di agarosio (60 mm). Impilare gli embrioni strettamente all'interno delle creste. Utilizzando pipette di vetro lucidate a fuoco, allinearle nel corretto orientamento per l'iniezione.
- Al microscopio, utilizzare manipolatori per avvicinare la micropipetta all'embrione e iniettare all'interno dell'interfaccia tuorlo-cellula premendo l'interruttore a pedale.
- Iniettare tutti gli embrioni in modo simile; raccoglierli in una capsula di Petri contenente acqua fresca embrionale e incubarli a 28 °C.
- Controllare gli embrioni iniettati dopo 6-8 ore. Rimuovere tutti gli embrioni morti identificabili a causa della loro elevata opacità e continuare a cambiare l'acqua dell'embrione almeno una volta al giorno per evitare l'infezione.
2. Analisi della pigmentazione
- Preparazione per il conteggio dei melanofori della linea mediana laterale in 3 embrioni di zebrafish dpf
- Trattare gli embrioni con anestetico neuro-muscolare allo 0,016% per immobilizzarli.
- Per montare gli embrioni per l'imaging, aggiungere alcuni millilitri di metilcellulosa all'1,5-2% nella capsula di Petri (60 mm) in modo che formi uno strato sottile. Utilizzando una pipetta Pasteur, prelevare gli embrioni e posizionarli delicatamente nella metilcellulosa per limitare ulteriori movimenti durante l'imaging.
- Regolare la loro posizione per l'imaging ottimale laterale (striscia dorsale, striscia ventrale, striscia di tuorlo e melanofori della linea mediana) o dorsale (melanofori sulla parte dorsale della testa). Per una migliore risoluzione dei melanofori adiacenti, immagine a ingrandimento più elevato (>5x)
- Imaging in campo chiaro
NOTA: l'imaging in campo chiaro viene eseguito utilizzando uno stereomicroscopio con ingrandimento 8-10x.- Posizionare la capsula di Petri contenente gli embrioni di zebrafish al microscopio. Utilizzando un manipolatore, regolare il pesce in tale orientamento in modo che tutte e cinque le strisce embrionali dei melanociti siano visibili (dorsale, ventrale, due laterali, tuorlo) contemporaneamente (Figura 1C). Acquisisci rapidamente immagini utilizzando il software di acquisizione. Nel caso in cui l'animale riacquisti il movimento prima di essere ripreso, immergerlo nuovamente in anestetico e procedere con l'imaging una volta che è sufficientemente immobilizzato.
- Ripeti questa operazione con tutti i pesci e assicurati che l'ingrandimento rimanga lo stesso per ogni immagine.
- Calcolo del valore grigio medio con il software ImageJ
- Scatta immagini dorsali e laterali di 2 embrioni di zebrafish dpf.
- Aprire l'immagine da quantificare in ImageJ utilizzando lo strumento Apri . Utilizzate lo strumento forma a mano libera per delineare l'area da analizzare. Vai all'opzione Imposta misure e seleziona l'area Valore grigio medio | . Premere M (o Analizza | Misura) per calcolare il valore di grigio medio per l'area selezionata.
- Mantenendo costante l'area da analizzare, calcolare separatamente l'area grigia media per ogni animale.
- Tracciare un grafico a barre con i dati acquisiti (Figura 2F).
- Saggio del contenuto di melanina
- A 2 dpf, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per raccogliere ~ 25 embrioni di zebrafish.
- Eseguire la decorionazione manuale utilizzando aghi da insulina da 1 mL e aggiungerli a provette da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Scartare attentamente il terreno embrionale e aggiungere 1 mL di tampone di lisi ghiacciato (20 mM di fosfato di sodio (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) con cocktail di inibitori della proteasi e preparare lisati proteici mediante sonicazione.
- Sciogliere i lisati in 1 mL di 1 N NaOH e incubare i campioni a 100 °C per 50 minuti a bagnomaria. Vortice a intermittenza per omogeneizzare completamente i lisati.
- Prendere letture di assorbanza dei campioni a 490 nm utilizzando uno spettrofotometro.
- Calcolare il contenuto di melanina confrontando l'assorbanza del campione con una curva standard di concentrazioni note di melanina sintetica (Figura 2G).
3. Conta dei melanofori
NOTA: L'analisi della fluorescenza negli embrioni transgenici di Zebrafish può essere effettuata con due metodi: 1) conteggio delle cellule GFP-positive; 2) misurazione dell'intensità della fluorescenza.
- Preparazione per il conteggio basato su FACS di cellule GFP-positive in embrioni di zebrafish precoci
- Raccogliere 200-250 embrioni ftyrp:GFP e lavarli in un colino usando acqua embrionale naturale. Come controllo negativo, elaborare embrioni wild-type GFP-negativi, abbinati allo stadio (Assam Wildtype)12.
- In base allo stadio di interesse, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri contenente 0,6 mg/ml di pronasi. Dopo 5-10 minuti, utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire gli embrioni dechorionati in una capsula di Petri fresca contenente acqua embrionale naturale. Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, raccogliere ~ 100 embrioni e trasferirli in una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
- Scartare accuratamente il mezzo e aggiungere 200 μL di soluzione di Ringer ghiacciata (tampone di deyolking). Mantenendo il tubo sul ghiaccio, pipettare il contenuto su e giù ~ 20 volte fino a quando il tuorlo è sciolto. Centrifugare i tubi a 100 × g per 1 minuto in una centrifuga da tavolo a 4 °C. Centrifugare di nuovo e scartare con attenzione il surnatante.
- Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire gli embrioni deyolked in una capsula di Petri contenente 10 mL di soluzione di tripsina (tampone di dissociazione cellulare). Eseguilo in più piastre di Petri per evitare il sovraffollamento degli embrioni e la tripsinizzazione inefficiente. Utilizzare una pipetta da 1 ml, mescolare la soluzione contenente i corpi embrionali una o due volte per ridurre l'aggregazione.
- Incubare le piastre di Petri a temperatura ambiente per 15 minuti (embrioni <24 hpf) o 30 min (embrioni 24-30 hpf). Aspirare ed erogare la sospensione di tanto in tanto utilizzando una pipetta da 1 mL per favorire la disintegrazione delle cellule.
- Durante il periodo di incubazione, inizializzare la macchina citometrica a flusso per il conteggio delle cellule.
- Posizionare un filtro cellulare da 70 μm sopra un tubo conico da 50 mL e far passare la sospensione tripsinizzata attraverso il filtro per ottenere una sospensione monocellulare. Lavare le piastre di Petri con la stessa sospensione alcune volte per rimuovere le cellule aderenti alla superficie.
- Far ruotare i campioni a 450 × g, 4 °C per 5 minuti in un rotore a benna oscillante.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata.
- Ruotare nuovamente a 450 × g, 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Infine, risospendere il pellet in PBS + siero fetale bovino al 5% e tenerlo in ghiaccio fino all'esecuzione del FACS.
- Preparazione del citometro a flusso
- Accendere il citometro a flusso e avviare l'avvio.
NOTA: Prima di accendere la macchina, svuotare il cestino dei rifiuti e riempire il serbatoio del liquido della guaina. - Normalizzare il flusso del flusso per un ugello da 70 μm (o 85 μm). Lasciarlo indisturbato per 10-15 minuti se è instabile.
- Accendere il citometro a flusso e avviare l'avvio.
- Conteggio di cellule marcate con fluorescenza utilizzando un citometro a flusso
- Inizializzare una nuova cartella dell'esperimento e creare un grafico a dispersione di dispersione diretta rispetto alla dispersione laterale e un istogramma dell'intensità dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC).
- Caricare prima le celle wild-type per impostare le porte di dispersione in avanti e laterali (per escludere doppiette e detriti) e la soglia FITC.
- Dopo aver impostato le porte, rimuovere il campione e caricare le cellule isolate dagli embrioni Tg (ftyrp1: GFP) per contare i melanociti.
NOTA: Qui, poiché ftyrp1:GFP etichetta specificamente i melanociti maturi, il numero di cellule GFP-positive sotto il gate FITC corrisponderà al numero di melanociti. - Ripetere il passaggio precedente con campioni iniettati da morfolino per stimare e confrontare il numero di melanociti con il controllo.
- Misurazione dell'intensità di fluorescenza negli embrioni di zebrafish
- Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, raccogliere 100-120 embrioni e trasferirli in una capsula di Petri contenente acqua embrionale semplice.
- A ~ 10-12 hpf, trasferire gli embrioni allo 0,003% 1-fenil-2-tiourea per inibire la pigmentazione.
- Eseguire la decorionazione manuale utilizzando aghi da insulina per l'imaging di embrioni <48 hpf.
- Per immobilizzare gli embrioni, trattarli con tricaina allo 0,016%.
- Per montare gli embrioni per l'imaging, mettere alcuni ml di metilcellulosa all'1,5-2% nella capsula di Petri (60 mm) in modo che formi uno strato sottile. Aggiungere gli embrioni alla metilcellulosa per limitare qualsiasi ulteriore movimento durante l'imaging. Posizionare la capsula di Petri contenente i campioni al microscopio. Utilizzando una punta per pipetta, regolare l'animale nell'orientamento desiderato.
- Acquisire immagini utilizzando il software di acquisizione. Per gli embrioni <24 hpf, catturare l'intero embrione contemporaneamente con un ingrandimento 10x. Per >24 stadi hpf, acquisire più campi di scansione e successivamente assemblarli (cucirli) insieme.
- Ripeti questo con tutti i pesci e assicurati che l'impostazione per l'acquisizione rimanga costante durante l'esperimento.
- Quantificazione
- Analizza ulteriormente l'immagine utilizzando il software ImageJ.
- Aprire l'immagine da quantificare in ImageJ utilizzando lo strumento Apri .
- Utilizzare lo strumento forma a mano libera per delineare l'area da analizzare (Figura 3E).
- Premere M (o Analizza | Misura) per acquisire una misura dell'intensità dell'area selezionata .
- Mantenendo costante l'area da analizzare, calcolare separatamente l'intensità media per area per ogni animale.
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Representative Results
Il flusso di lavoro descritto nella Figura 1 è stato utilizzato per eseguire perturbazioni genetiche basate sul morfolino allo stadio monocellulare del pesce zebra. L'analisi della pigmentazione è stata eseguita utilizzando vari metodi, come indicato di seguito. Per illustrare i risultati rappresentativi, volumi standardizzati di morfolino antisenso mirati ai geni h2afv e ca14 sono stati iniettati nello stadio tuorlo o unicellulare dell'embrione di zebrafish. La fenotipizzazione iniziale basata sull'imaging in campo chiaro è stata eseguita a 48 ore dopo la fecondazione (hpf), quando tutte e cinque le strisce melanofore pigmentate (dorsale, ventrale, tuorlo, due laterali) erano evidenti.
La figura 2A,B rappresenta un approccio per analizzare la pigmentazione calcolando il numero di melanofori laterali per embrione. I melanofori laterali sono stati contati manualmente allo stadio di 48 hpf ingrandendo la regione laterale del pesce zebra inclinato. Un metodo alternativo per quantificare i melanofori pigmentati (Figura supplementare S1) prevede il conteggio manuale dei melanofori della testa mediante l'imaging della vista dorsale del pesce zebra.
Il contenuto di melanina per embrione viene calcolato misurando il valore medio di grigio, mantenendo costante la regione di interesse con l'aiuto del software ImageJ. La figura 2C-F mostra che il valore medio di grigio dei morfanti ca14 e h2afv era superiore a quello dei morfi di controllo. Poiché il valore medio del grigio è inversamente proporzionale al contenuto di melanina, il knockdown dei geni ca14 e h2afv ha portato a una diminuzione del contenuto di melanina per embrione. Un altro metodo robusto per quantificare il contenuto di melanina è un metodo di assorbimento spettrofotometrico basato su NaOH. Come mostrato nella Figura 2G, il contenuto totale di melanina nei morfanti ca14 era inferiore rispetto ai mordenti di controllo.
L'imaging fluorescente ha rivelato due diverse fasi dello sviluppo dei melanofori del pesce zebra: melanofori specificati precocemente (mitfa: gfp) e melanofori differenzianti (ftyrp: gfp). L'alterazione basata sul morfolino è stata valutata mediante imaging fluorescente (Figura 3A e Figura 3C). Per convalidare ulteriormente queste osservazioni, la frequenza delle cellule GFP-positive è stata calcolata utilizzando FACS. Il knockdown di h2afv ma non ca14 ha ridotto significativamente il numero di melanofori rispetto al controllo (Figura 3A-D). Inoltre, una riduzione dell'intensità/area media di fluorescenza può essere calcolata utilizzando il software ImageJ, mantenendo costante la regione di interesse. I morfanti H2afv mostrano una significativa diminuzione dell'intensità/area fluorescente media rispetto ai mordenti di controllo (Figura 3E,F).
Figura 1: Flusso di lavoro per un approccio genetico inverso per identificare i regolatori della biologia dei melanociti utilizzando il pesce zebra. (A) Diagramma di flusso che illustra il flusso di lavoro sperimentale a partire dalla microiniezione fino alla valutazione della pigmentazione con vari metodi. (B) Il supporto dell'ago per microiniezione e il micromanipolatore, insieme a un microscopio da dissezione, sono una configurazione tipica per la microiniezione di embrioni di zebrafish monocellulare. (C) Pattern embrionale dei melanociti nel pesce zebra a 3 dpf che mostra tutte e cinque le strisce: dorsolaterale, due linee mediane laterali (puntate da quattro frecce rosse), striscia ventrale e striscia di tuorlo. (D) Per studiare l'esito della pigmentazione dopo iniezione di morfolino, i melanofori della linea mediana laterale possono essere contati sotto uno stereomicroscopio. Immagine in campo chiaro di una regione dorsale a 2 dpf; Il contenuto di melanina può essere quantificato misurando il valore medio di grigio. (E) I valori medi di grigio sono inversamente proporzionali al contenuto di melanina dell'embrione. Melanofori ripieni di melanina a 2 dpf in embrioni wild-type. (F) Il saggio del contenuto di melanina può essere eseguito per stimare la produzione di melanina all'interno di questi melanofori. Zebrafish transgenico che marca le cellule che esprimono la proteina TYRP1 a 2 dpf. (G) Le celle marcate con fluorescenza possono essere quantificate utilizzando FACS; barra di scala = 100 μm. Zebrafish transgenico che etichetta le cellule che esprimono la proteina Mitfa a 1 dpf. L'intensità media della fluorescenza per animale può essere misurata utilizzando il software ImageJ. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: dpf = giorni dopo la fecondazione; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Conteggio dei melanofori della linea mediana laterale, misurazione del valore medio di grigio e saggio del contenuto di melanina. Le immagini microscopiche a campo chiaro della vista laterale dei morfi sono state utilizzate per quantificare il contenuto di melanina utilizzando il software ImageJ. (A) Morphanti di controllo e variante istonica h2afv (h2afv) a 3 dpf; Sulla destra ci sono le regioni del tronco ingrandite di questi embrioni raffiguranti il numero di melanociti. (B) Il numero di melanofori nei morfisti h2afv è drasticamente ridotto rispetto al controllo, n > 10 ciascuno in 3 repliche biologiche. (C) Immagine rappresentativa dei morfani di controllo vs anidrasi carbonica 14 a 2 dpf. (D) Quantificazione della melanina di ca14 vs morfi di controllo, n > 10 in 3 repliche biologiche. (E) Vista laterale di h2afv vs mordenti di controllo a 2 dpf. (F) Quantificazione del contenuto di melanina di h2afv vs morfi di controllo. I rettangoli rossi rappresentano il ROI scelto per l'analisi basata su ImageJ. (G) Saggio del contenuto di melanina eseguito su embrioni iniettati con morfolino per quantificare il contenuto totale di melanina. Media di tre esperimenti indipendenti ± SEM.; **P < 0,01, **** P < 0,0001. Test t dello studente; le barre di errore sono l'errore medio ± standard della media (SEM). Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: MO = morpholino; dpf = giorni dopo la fecondazione; ROI = regione di interesse. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Quantificazione delle celle marcate con fluorescenza utilizzando FACS e misurazione dell'intensità media della fluorescenza. (A) Immagini di fluorescenza di ca14 ed embrioni mordenti di controllo a 2 dpf dalla linea Tg (ftyrp1: GFP), dove i melanociti differenzianti sono marcati dall'espressione di GFP. (B) Il numero di melanofori in ca14 e embrioni morfosi di controllo a 2 dpf rimane invariato, n = 3 repliche biologiche. (C) Immagini di fluorescenza a 2 dpf di h2afv e morfosi di controllo dalla linea Tg(ftyrp1:GFP). (D) Il numero di melanofori nei morfosi h2afv è significativamente ridotto rispetto agli embrioni mordenti di controllo a 2 dpf, n = 3 repliche biologiche. (E) Immagini di fluorescenza di embrioni di controllo e h2afv morphant a 36 hpf da Tg (mitfa: GFP) con melanociti marcati. (F) Le IFM per animale sono calcolate utilizzando il software ImageJ e rappresentate come un grafico a barre raffigurante singoli set di dati. L'MFI è significativamente ridotto nei morfisti h2afv rispetto al controllo. Il rettangolo rosso rappresenta il ROI scelto per l'analisi basata su software ImageJ. n = 3 repliche biologiche; P < 0,001, ****P < 0,0001. Test t dello studente; le barre di errore sono l'errore medio ± standard della media (SEM); barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: MO = morpholino; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza; GFP = proteina fluorescente verde; dpf = giorni dopo la fecondazione; ROI = regione di interesse; MFI = intensità media della fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Quantificazione dei melanofori della testa. (A) Vista dorsale di h2afv e morfosi di controllo a 48 hpf che mostrano melanofori della testa. La casella rossa rappresenta il ROI. Mantenendo costante l'area di interesse, il numero di melanofori della testa può essere quantificato manualmente. (B) Numero di melanofori della testa significativamente ridotto dopo knockdown h2afv. Le barre rappresentano la media geometrica con IC del 95% del numero di melanofori della testa per embrione con >30 embrioni ciascuno. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: MO = morpholino; CI = intervallo di confidenza; HPF = ore dopo la fecondazione; ROI = regione di interesse. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Microarray di melanociti primari umani trattati con PTU. La mappa di calore mostra l'espressione dei geni della pigmentazione (mitf, tirosinasi, dct, mc1r) durante il trattamento nei melanociti primari umani. Abbreviazioni: PTU = 1-fenil-2-tiourea; tyr = tirosinasi. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il fenotipo della pigmentazione si manifesta spesso come alterazioni del contenuto di melanina o del numero di melanociti portatori di pigmento. Il metodo qui descritto consente di dissezionare questa dicotomia e consente una valutazione qualitativa e quantitativa del contenuto di melanina e del numero di melanofori per embrione, indipendentemente dal contenuto di melanina. L'elevata fecondità del pesce zebra, la natura visibile dei melanociti pigmentati e la mancanza di trasferimento dei melanosomi consentono la dissezione della biologia dei melanociti utilizzando questo approccio genetico inverso che è suscettibile di screening a medio rendimento.
La scelta del silenziamento a base di morfolino deriva dalla facilità di silenziamento e dalla possibilità di testare più candidati in parallelo. Ci sono alcune limitazioni nell'uso di un approccio di silenziamento basato sul morfolino, e le linee guida per l'uso e l'interpretazione di questi preziosi strumenti sono state descritte in precedenza13. In sostanza, la convalida del fenotipo dopo knockdown utilizzando più MO fornisce una soluzione tangibile a questo problema. Una strategia alternativa è l'uso della perturbazione genetica basata su CRISPR. La penetranza del fenotipo è limitata a causa della frequenza intrinsecamente inferiore degli eventi genetici e potrebbe essere aggravata da mutazioni eterogenee. Ciò ne limita l'uso per lo screening genetico inverso14.
La valutazione fenotipica delle perturbazioni selettive dei melanociti spesso determina una diminuzione del contenuto di pigmento a causa di un'alterata risposta melanogenica. Tuttavia, ci sono diversi geni che perturbano la specifica dei melanociti e quindi causano una riduzione della pigmentazione a causa di una diminuzione del numero complessivo di melanociti. Una dissezione sistematica dei due scenari è essenziale per attribuire la funzione molecolare del gene nella pigmentazione. La misurazione del contenuto di melanina è aggravata dalla natura complessa del polimero di melanina. Dei due metodi disponibili, vale a dire la solubilizzazione della melanina mediante NaOH e la rilevazione basata sull'HPLC di prodotti stabili di ossidazione della melanina 1H-pirrolo-2,3,5-acido tricarbossilico e acido pirrolo-2,3-dicarbossilico, il primo metodo può essere eseguito di routine in un ambiente di laboratorio, mentre il secondo richiede standard specifici e strumentazione sofisticata15.
Inoltre, anche il numero di embrioni richiesti dal metodo NaOH è più elevato a causa di diversi passaggi coinvolti nel rilevamento. L'idrolisi basata sul NaOH solubilizza la melanina e consente la quantificazione spettrofotometrica. Mentre questo metodo è robusto e può essere adottato per uno schermo a medio rendimento (10-15 candidati alla volta), la xantina presente negli xantofori è una sostanza potenzialmente interferente a causa del suo assorbimento intrinseco nell'intervallo 400-450 nm16. Pertanto, deve essere effettuata una concordanza tra la determinazione del valore di grigio medio basata sull'analisi delle immagini e il saggio del contenuto di melanina per confermare la riduzione del contenuto di melanina.
PTU offre uno strumento semplice per ridurre la pigmentazione e visualizzare l'embrione altrimenti trasparente. L'uso potrebbe comportare cambiamenti di feedback e invocare alterazioni nei melanociti. Tuttavia, abbiamo osservato cambiamenti minimi nell'espressione dei geni della pigmentazione (Figura supplementare S2).
Il conteggio dei melanociti è più facile nella linea mediana laterale e nella regione della testa, poiché i melanociti sono relativamente distintamente osservabili in queste regioni (Figura supplementare S1). I melanofori della linea laterale derivano dalla popolazione di cellule staminali dei melanociti che risiede vicino ai gangli della radice dorsale18. L'imaging di questa popolazione ha diversi vantaggi come il numero fisso per embrione e una chiara distinzione. Tuttavia, le due linee controlaterali devono essere visualizzate inclinando leggermente l'embrione; altrimenti i due si fondono a causa della natura trasparente dell'embrione, rendendo difficile il conteggio (Figura 1C contro Figura 2C).
I melanofori del pesce zebra sono distinti dalle cellule pigmentate dell'occhio che derivano dal neuro-ectoderma. Questi sono distinguibili dal loro posizionamento all'interno dell'embrione e sono evidenti nell'occhio rispetto al modello corporeo. Nell'esperimento basato su FACS, le cellule derivate dall'occhio possono essere distinte per le loro dimensioni in quanto sono significativamente più piccole dei melanofori e possono essere controllate utilizzando criteri di dimensione o dispersione.
Le stime dei melanociti nelle diverse fasi di maturazione utilizzando linee transgeniche sono facilmente eseguibili utilizzando la quantificazione basata su immagini. La quantificazione del numero di melanofori della linea laterale è robusta in quanto il loro numero varia in una finestra compresa tra 2 dpf e 5 dpf su ciascun lato dell'embrione17. Tuttavia, il numero di melanofori della linea laterale è determinato dalla migrazione e dall'insediamento di un pool di cellule staminali associate al ganglio della radice dorsale18. Quindi, qualsiasi alterazione in questi processi può portare a un'osservazione simile. Per aggirare questo fattore confondente, la stima basata su FACS di tutti i melanofori è una soluzione tangibile.
In alternativa, la quantificazione dei melanofori della testa può essere eseguita come delineato nella figura supplementare S1 come surrogato dei numeri di melanofori. È interessante notare che le alterazioni nei livelli stazionari del numero di melanociti potrebbero significare due funzioni opposte per il gene candidato in questione. Potrebbe comportare una diminuzione della specifica dei melanociti dai precursori della cresta neurale o causare la morte specifica dei melanociti e deve essere affrontata utilizzando metodi come il test del tunnel. Variazioni come le microiniezioni seguite dall'imaging delle cellule vive consentirebbero di monitorare altri fenotipi specifici dei melanociti come la migrazione e il patterning. Di interesse per i ricercatori delle cellule pigmentate sarebbe il processo di trasferimento del melanosoma, che non è operativo nel sistema ittico. Tuttavia, il movimento concertato dei melanosomi nei melanofori può essere studiato con alterazioni nell'imaging delle cellule vive descritte nel presente documento con modifiche. Nel complesso, il protocollo dettagliato presentato in questo articolo video consentirebbe ai ricercatori di biologia delle cellule pigmentate di interrogare i geni candidati e valutare il loro ruolo nella biologia dei melanociti.
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Disclosures
Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Riconosciamo il sostegno finanziario del Consiglio per la ricerca scientifica e industriale vide progetto MLP2008 e il Dipartimento di Scienza e Tecnologia per il progetto GAP165 per sostenere il lavoro presentato in questo manoscritto. Ringraziamo Jeyashri Rengaraju e Chetan Mishra per il loro aiuto con gli esperimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
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