Summary
Reguladores das funções dos melanócitos governam diferenças visíveis no resultado da pigmentação. Decifrar a função molecular do gene de pigmentação candidato representa um desafio. Neste trabalho, demonstramos o uso de um sistema modelo de peixe-zebra para identificar candidatos e classificá-los em reguladores do conteúdo de melanina e número de melanócitos.
Abstract
Os melanócitos são células especializadas derivadas da crista neural presentes na pele epidérmica. Essas células sintetizam pigmento de melanina que protege o genoma das radiações ultravioletas nocivas. Perturbações no funcionamento dos melanócitos levam a distúrbios pigmentares como piebaldismo, albinismo, vitiligo, melasma e melanoma. O peixe-zebra é um excelente sistema modelo para entender as funções dos melanócitos. A presença de melanócitos pigmentados conspícuos, a facilidade de manipulação genética e a disponibilidade de linhagens fluorescentes transgênicas facilitam o estudo da pigmentação. Este estudo emprega o uso de linhagens de zebrafish selvagens e transgênicas que conduzem a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) sob promotores mitfa e tyrp1 que marcam vários estágios de melanócitos.
O silenciamento morfolinoso de genes candidatos é obtido para avaliar o resultado fenotípico na pigmentação larval e é aplicável à triagem de reguladores de pigmentação. Este protocolo demonstra o método desde a microinjeção até a dissecção de fenótipos baseada em imageamento e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) usando dois genes candidatos, anidrase carbônica 14 (Ca14) e uma variante de histona (H2afv), para avaliar de forma abrangente o resultado da pigmentação. Além disso, este protocolo demonstra a segregação de genes candidatos em especificadores e diferenciadores de melanócitos que alteram seletivamente o número de melanócitos e o conteúdo de melanina por célula, respectivamente.
Introduction
Embora o uso da melanina para fotoproteção tenha evoluído várias vezes em todo o reino animal, os vertebrados aparentemente aperfeiçoaram o processo. Células dedicadas produtoras de pigmentos com uma elaborada maquinaria para sintetizar e conter melanina são conservadas de peixes para humanos1. No entanto, o resultado da pigmentação é dramaticamente variado, variando da cor à recipiência e apresenta-se como padrões vívidos nos tegumentos, na pele e no cabelo2. Apesar da diversidade, o repertório de genes envolvidos na resposta à pigmentação é marcadamente conservado. Os componentes centrais da maquinaria de síntese de melanina, tais como as enzimas-chave de síntese de melanina, os componentes dos melanossomas e a conectividade a montante com a via de sinalização, permanecem essencialmente idênticos entre os organismos. Diferenças genéticas sutis provocam mudanças dramáticas nos padrões de pigmentação observados entre as espécies3. Assim, uma abordagem genética reversa em um organismo vertebrado inferior, o peixe-zebra (Danio rerio), oferece uma excelente oportunidade para decifrar o envolvimento de genes na transformação do estadopigmentado4.
Os embriões de peixe-zebra desenvolvem-se a partir de um zigoto fertilizado unicelular para uma larva dentro de um período de ~24 h após a fertilização (hpf)5. Surpreendentemente, as células equivalentes aos melanócitos - os melanóforos - são células grandes que estão presentes na derme e são conspícuas devido ao conteúdo escuro de melanina6. Essas células derivadas da crista neural emanam ~11 hpf e começam a pigmentar ~24 hpf 6,7. Módulos conservados de expressão gênica permitiram a identificação de fatores-chave que orquestram as funções dos melanócitos e levaram ao desenvolvimento de linhagens fluorescentes transgênicas Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) e Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10 que marcam estágios seletivos do desenvolvimento de melanócitos. O uso dessas linhagens de peixes transgênicos permite a interrogação da biologia celular de melanócitos em nível de organismo no contexto tecidual com pistas apropriadas de acordo com as linhas do tempo de desenvolvimento. Esses repórteres complementam a quantificação de melanócitos baseada em pigmentos e permitem uma avaliação distinta do número de melanócitos, independentemente do conteúdo de melanina.
Este artigo fornece um protocolo detalhado para decifrar a biologia dos melanócitos através da avaliação de dois parâmetros críticos, a saber, o conteúdo de melanina e o número de melanócitos. Enquanto a primeira é uma leitura funcional comum emanada de uma resposta de hipopigmentação, a segunda está associada a uma redução na especificação ou sobrevivência dos melanócitos e é frequentemente associada a condições genéticas ou adquiridas de despigmentação. A estratégia geral deste rastreamento genético reverso é silenciar genes selecionados usando um morfolino e investigar os desfechos específicos dos melanócitos. O conteúdo de melanina é analisado usando quantificação baseada em imagem dos valores médios de cinza seguido de confirmação usando um ensaio de conteúdo de melanina. O número de melanócitos em vários estágios de maturação é analisado usando quantificação baseada em imagem e posteriormente confirmado usando a análise FACS. Aqui, o protocolo de triagem é demonstrado usando dois genes candidatos, a anidrase carbônica 14, envolvida na melanogênese, e uma variante de histona H2AFZ.2 envolvida na especificação de melanócitos da população precursora da crista neural. Enquanto o primeiro altera o conteúdo de melanina e não o número de melanócitos, o segundo altera o número de melanócitos especificados e, consequentemente, o conteúdo de melanina no embrião. Em todos, este método fornece um protocolo detalhado para identificar o papel de um gene candidato na pigmentação e distinguir seu papel no controle do número de melanócitos versus o conteúdo de melanina.
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Protocol
Os experimentos com zebrafish foram realizados em estrita conformidade com a aprovação institucional de ética animal (IAEC) do CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Índia (Proposta nº 45a). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.
1. Injeção de morfolino em embriões de peixe-zebra
- Usando um puxador de agulha padrão, desenhe pipetas muito afiadas e de ponta fechada.
- Carregar a solução contendo morfolino nas micropipetas usando uma ponta de microcarregador e inseri-la no aparelho microinjetor. Aperte o parafuso corretamente para travar a micropipeta.
NOTA: A padronização da dosagem de morfolinos é necessária. A dosagem adequada tem uma taxa de sobrevivência de >70% e um fenótipo específico em 24 hpf. - Corte a ponta da micropipeta com pinça fina e calibre-a11.
- Para calibrar, injetar 1 volume de solução de morfolino no tubo capilar a partir da micropipeta, mantendo o tempo de injeção em 1 s. Repita isso cinco vezes. Usando o volume padrão, 1 mm = 30 nL, encontre o volume injetado em 5 s mantendo o tubo capilar contra uma balança de medição. Usando as informações acima, calcule o tempo (em segundos) necessário para injetar 1-3 nL por injeção12.
NOTA: O padrão, 1 mm = 30 nL, é específico para as configurações de pressão do microinjetor e diâmetro do capilar usado para calibração. Idealmente, a injeção deve ser feita na interface gema-célula, que é formada dentro de 15-20 minutos após a fertilização. Para facilitar injeções múltiplas, o desenvolvimento pode ser ligeiramente atrasado pela manutenção dos embriões a uma temperatura mais baixa (18 °C). No entanto, isso deve ser mantido a um mínimo e não estendido além de 30 min devido ao efeito composto da temperatura mais baixa sobre as alterações de expressão gênica. - Monte os embriões em uma placa de Petri fundida em agarose (60 mm). Empilhe os embriões firmemente dentro das cristas. Usando pipetas de vidro polido a fogo, alinhe-as na orientação adequada para injeção.
- Sob um microscópio, use manipuladores para aproximar a micropipeta do embrião e injete dentro da interface gema-célula pressionando o pedal.
- Injetar todos os embriões da mesma forma; coletá-los em uma placa de Petri contendo água fresca do embrião e incubar a 28 °C.
- Verifique os embriões injetados após 6-8 h. Remova todos os embriões mortos identificáveis devido à sua alta opacidade e continue trocando a água do embrião pelo menos uma vez por dia para evitar a infecção.
2. Análise da pigmentação
- Preparo para contagem de melanóforos da linha média lateral em embriões de peixe-zebra 3 dpf
- Tratar embriões com anestésico neuromuscular a 0,016% para imobilizá-los.
- Para montar os embriões para obtenção de imagens, adicione alguns mililitros de metilcelulose a 1,5-2% na placa de Petri (60 mm) para que ela forme uma camada fina. Usando uma pipeta de Pasteur, pegue os embriões e posicione-os suavemente em metilcelulose para restringir ainda mais os movimentos durante a imagem.
- Ajuste sua posição para obter imagens ideais laterais (listras dorsais, faixas ventrais, listras vitelínicas e melanóforos da linha média) ou dorsais (melanóforos na parte dorsal da cabeça). Para melhor resolução dos melanóforos adjacentes, imagem em maior aumento (>5x)
- Imagem de campo brilhante
NOTA: A imagem de campo brilhante é realizada usando um estereomicroscópio com aumento de 8-10x.- Coloque a placa de Petri contendo os embriões de peixe-zebra sob o microscópio. Com o uso de um manipulador, ajustar os peixes nessa orientação de modo que todas as cinco listras embrionárias de melanócitos sejam visíveis simultaneamente (dorsal, ventral, duas laterais, gema) (Figura 1C). Capture imagens rapidamente usando o software de aquisição. Caso o animal recupere o movimento antes de ser fotografado, mergulhe-o novamente em anestésico e prossiga com a imagem assim que estiver suficientemente imobilizado.
- Repita isso com todos os peixes e certifique-se de que a ampliação permaneça a mesma para todas as imagens.
- Calculando o valor médio de cinza usando o software ImageJ
- Tome imagens dorsais e laterais de embriões de peixe-zebra dpf.
- Abra a imagem a ser quantificada no ImageJ usando a ferramenta Abrir . Use a ferramenta de forma à mão livre para delinear a área a ser analisada. Vá para a opção Definir medidas e selecione Valor cinza médio | área. Pressione M (ou Analisar | Measure) para calcular o valor médio de cinza para a área selecionada.
- Mantendo constante a área a ser analisada, calcule a área cinzenta média de cada animal separadamente.
- Plote um gráfico de barras com os dados adquiridos (Figura 2F).
- Ensaio de teor de melanina
- A 2 dpf, use uma pipeta de vidro Pasteur para coletar ~25 embriões de peixe-zebra.
- Realizar a descorionação manual com agulhas de insulina de 1 mL e adicioná-las a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Eliminar cuidadosamente o meio embrionário e adicionar 1 ml de tampão de lise gelado (fosfato de sódio 20 mM (pH 6,8), Triton X-100 a 1%, PMSF 1 mM, EDTA 1 mM) com cocktail inibidor de protease e preparar lisados proteicos por sonicação.
- Dissolver os lisados em 1 mL de NaOH 1 N e incubar as amostras a 100 °C por 50 min em banho-maria. Vórtice intermitentemente para homogeneizar completamente os lisados.
- Fazer leituras de absorbância das amostras a 490 nm usando um espectrofotômetro.
- Calcular o conteúdo de melanina comparando a absorbância da amostra com uma curva padrão de concentrações conhecidas de melanina sintética (Figura 2G).
3. Contagem de melanóforos
NOTA: A análise de fluorescência em embriões transgênicos de Zebrafish pode ser feita por dois métodos: 1) contagem de células GFP-positivas; 2) mensuração da intensidade da fluorescência.
- Preparação para contagem de células GFP-positivas baseadas em FACS em embriões de peixe-zebra precoce
- Colete 200-250 embriões ftyrp:GFP e lave-os em um filtro usando água pura do embrião. Como controle negativo, processar embriões selvagens (Assam Wildtype) negativos para GFP e compatíveis com estágio12.
- Com base no estágio de interesse, transferir os embriões para uma placa de Petri contendo 0,6 mg/mL de pronase. Após 5-10 min, usando uma pipeta de Pasteur, transfira os embriões descorionados para uma placa de Petri fresca contendo água pura do embrião. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, colete ~100 embriões e transfira-os para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
- Descarte o meio com cuidado e adicione 200 μL de solução de Ringer gelada (tampão de desyolking). Mantendo o tubo no gelo, pipetar o conteúdo para cima e para baixo ~20 vezes até que a gema seja dissolvida. Centrifugar os tubos a 100 × g durante 1 min numa centrífuga de mesa a 4 °C. Centrifugar novamente e descartar cuidadosamente o sobrenadante.
- Usando uma pipeta de 1 mL, transferir os embriões desgemados para uma placa de Petri contendo 10 mL de solução de tripsina (tampão de dissociação celular). Execute-o em várias placas de Petri para evitar superlotação dos embriões e tripsinização ineficiente. Utilizar uma pipeta de 1 ml, misturar a solução que contém os corpos embrionários uma ou duas vezes para diminuir a agregação.
- Incubar as placas de Petri à temperatura ambiente durante 15 min (embriões <24 hpf) ou 30 min (embriões 24-30 hpf). Aspirar e dispensar a suspensão ocasionalmente usando uma pipeta de 1 mL para ajudar na desintegração das células.
- Durante o período de incubação, inicialize a máquina de citômetro de fluxo para contagem celular.
- Coloque um filtro celular de 70 μm acima de um tubo cônico de 50 mL e passe a suspensão tripsinizada através do filtro para obter uma suspensão de célula única. Lave as placas de Petri com a mesma suspensão algumas vezes para remover as células aderidas à superfície.
- Gire as amostras a 450 × g, 4 °C por 5 min em um rotor de caçamba oscilante.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1mL de solução salina 1x tamponada com fosfato (PBS) gelada.
- Gire novamente a 450 × g, 4 °C durante 5 min e elimine o sobrenadante.
- Por fim, ressuspenda o pellet em PBS + 5% de soro fetal bovino e mantenha-o no gelo até o FACS correr.
- Preparação do citômetro de fluxo
- Ligue o citômetro de fluxo e inicie a inicialização.
NOTA: Antes de ligar a máquina, esvazie o caixote do lixo e encha o tanque de fluido da bainha. - Normalizar o fluxo do fluxo para um bocal de 70 μm (ou 85 μm). Deixe-o intacto por 10-15 minutos se estiver instável.
- Ligue o citômetro de fluxo e inicie a inicialização.
- Contagem de células marcadas fluorescentemente usando citômetro de fluxo
- Inicialize uma nova pasta de experimento e faça um gráfico de dispersão de dispersão direta versus dispersão lateral e um histograma de intensidade de isotiocianato de fluoresceína (FITC).
- Carregue as células do tipo selvagem primeiro para definir as portas de dispersão frontal e lateral (para excluir duplicidades e detritos) e o limite FITC.
- Depois que as comportas estiverem definidas, remova a amostra e carregue as células isoladas de embriões Tg(ftyrp1:GFP) para contar melanócitos.
NOTA: Aqui, como ftyrp1:GFP rotula especificamente melanócitos maduros, o número de células positivas para GFP sob a porta FITC corresponderá ao número de melanócitos. - Repita o passo acima com amostras injetadas com morfolinos para estimar e comparar o número de melanócitos com o controle.
- Mensuração da intensidade de fluorescência em embriões de peixe-zebra
- Usando uma pipeta de vidro Pasteur, colete de 100 a 120 embriões e transfira-os para uma placa de Petri contendo água pura do embrião.
- Em ~10-12 hpf, transferir os embriões para 0,003% 1-fenil-2-tiouréia para inibir a pigmentação.
- Realizar descorionação manual usando agulhas de insulina para obtenção de imagens <48 hpf embriões.
- Para imobilizar embriões, tratá-los com tricaína 0,016%.
- Para montar embriões para aquisição de imagens, coloque alguns mL de metilcelulose a 1,5-2% na placa de Petri (60 mm) para que ela forme uma camada fina. Adicione os embriões à metilcelulose para restringir qualquer movimento adicional durante a aquisição de imagens. Coloque a placa de Petri contendo as amostras sob o microscópio. Usando uma ponta de pipeta, ajuste o animal na orientação desejada.
- Adquira imagens utilizando o software de aquisição. Para embriões <24 hpf, capturar todo o embrião de uma só vez sob aumento de 10x. Para estágios de >24 hpf, adquira vários campos de varredura e, posteriormente, monte-os (costurar) juntos.
- Repita isso com todos os peixes e certifique-se de que a configuração para aquisição permaneça constante durante todo o experimento.
- Quantificação
- Analise ainda mais a imagem usando o software ImageJ.
- Abra a imagem a ser quantificada no ImageJ usando a ferramenta Abrir .
- Use a ferramenta de forma à mão livre para delinear a área de análise (Figura 3E).
- Pressione M (ou Analisar | Medida) para adquirir uma medida de intensidade de área selecionada.
- Mantendo constante a área a ser analisada, calcule a intensidade média por área para cada animal separadamente.
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Representative Results
O fluxo de trabalho descrito na Figura 1 foi usado para realizar a perturbação genética baseada em morfolinos no estágio unicelular do peixe-zebra. A análise da pigmentação foi realizada por vários métodos, conforme mencionado a seguir. Para ilustrar os resultados representativos, volumes padronizados de morfolino antisenso visando os genes h2afv e ca14 foram injetados na gema ou no estágio unicelular do embrião do peixe-zebra. A fenotipagem inicial baseada na imagem de campo claro foi realizada 48 horas após a fertilização (hpf), quando todas as cinco listras pigmentadas do melanóforo (dorsal, ventral, gema, duas laterais) estavam evidentes.
A Figura 2A,B representa uma abordagem para analisar a pigmentação calculando o número de melanóforos laterais por embrião. Os melanóforos laterais foram contados manualmente no estágio de 48 hpf por zoom na região lateral do zebrafish inclinado. Um método alternativo para quantificar os melanóforos pigmentados (Figura Suplementar S1) envolve a contagem manual dos melanóforos da cabeça por imagem da visão dorsal do peixe-zebra.
O conteúdo de melanina por embrião é calculado medindo-se o valor médio de cinza, mantendo a região de interesse constante com o auxílio do software ImageJ. A Figura 2C-F mostra que o valor médio de cinza dos morfantes ca14 e h2afv foi maior do que nos morfantes controle. Como o valor médio de cinza é inversamente proporcional ao conteúdo de melanina, o knockdown dos genes ca14 e h2afv levou a uma diminuição no conteúdo de melanina por embrião. Outro método robusto para quantificar o conteúdo de melanina é um método de absorção espectrofotométrico baseado em NaOH. Como mostrado na Figura 2G, o conteúdo total de melanina nos morfantes ca14 foi menor do que nos morfantes controle.
Imagens fluorescentes revelaram dois estágios diferentes de desenvolvimento do melanóforo do peixe-zebra: melanóforos especificados precocemente (mitfa:gfp) e melanóforos diferenciadores (ftyrp:gfp). A alteração morfolínica foi avaliada por imagem fluorescente (Figura 3A e Figura 3C). Para validar ainda mais essas observações, a frequência de células positivas para GFP foi calculada usando FACS. O knockdown de h2afv, mas não de ca14, reduziu significativamente o número de melanóforos em relação ao controle (Figura 3A-D). Além disso, uma redução na intensidade/área média de fluorescência pode ser calculada usando o software ImageJ, mantendo a região de interesse constante. Os morfos H2afv mostram uma diminuição significativa na intensidade/área fluorescente média em relação aos morfontes controle (Figura 3E,F).
Figura 1: Fluxo de trabalho para uma abordagem genética reversa para identificar reguladores da biologia de melanócitos usando peixe-zebra. (A) Fluxograma descrevendo o fluxo de trabalho experimental desde a microinjeção até a avaliação da pigmentação por vários métodos. (B) O porta-agulhas de microinjeção e o micromanipulador, juntamente com um microscópio dissecante, são uma configuração típica para microinjeção de embriões de peixe-zebra em estágio unicelular. (C) Padrão embrionário de melanócitos em zebrafish a 3 dpf mostrando todas as cinco listras: dorsolateral, duas linhas médias laterais (apontadas por quatro setas vermelhas), listra ventral e faixa vitelandesa. (D) Para estudar o resultado da pigmentação após a injeção de morfolino, os melanóforos da linha média lateral podem ser contados em estereomicroscópio. Imagem de campo claro de uma região dorsal a 2 dpf; O conteúdo de melanina pode ser quantificado medindo-se o valor médio de cinza. (E) Os valores médios de cinza são inversamente proporcionais ao conteúdo de melanina do embrião. Meláforos preenchidos com melanina a 2 dpf em embriões selvagens. (F) O ensaio do conteúdo de melanina pode ser realizado para estimar a produção de melanina dentro desses melanóforos. Zebrafish transgênico marcando as células que expressam a proteína TYRP1 a 2 dpf. (G) As células fluorescentemente marcadas podem ser quantificadas usando FACS; barra de escala = 100 μm. Zebrafish transgênico marcando as células que expressam a proteína Mitfa a 1 dpf. A intensidade média de fluorescência por animal pode ser medida usando o software ImageJ. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: dpf = dias pós-fertilização; FACS = classificação celular ativada por fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Contagem dos melanóforos laterais da linha média, mensuração do valor médio de cinza e ensaio do conteúdo de melanina. Imagens microscópicas de campo claro da vista lateral dos morfantes foram utilizadas para quantificar o conteúdo de melanina utilizando o software ImageJ. (A) Morfontes h2afv (h2afv) de controle e variante de histona a 3 dpf; à direita estão as regiões do tronco desses embriões com zoom representando números de melanócitos. (B) O número de melanóforos em morfos h2afv é drasticamente reduzido em relação ao controle, n > 10 cada em 3 réplicas biológicas. (C) Imagem representativa de controle vs anidrase carbônica 14 morfantes a 2 dpf. (D) Quantificação de melanina de ca14 vs morfantes controle, n > 10 em 3 réplicas biológicas. (E) Vista lateral dos morfantes h2afv vs controle a 2 dpf. (F) Quantificação do conteúdo de melanina de h2afv vs morfantes controle. Os retângulos vermelhos representam o ROI escolhido para a análise baseada em ImageJ. (G) Ensaio do conteúdo de melanina realizado em embriões morfolino-injetados para quantificação do conteúdo total de melanina. Média de três experimentos independentes ± MEV.; **P < 0,01, **** P < 0,0001. Teste t de Student; barras de erro são média ± erro padrão da média (EPM). Barras de escala = 100 μm. Abreviações: MO = morpholino; dpf = dias pós-fertilização; ROI = região de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação de células marcadas fluorescentemente usando FACS e medição da intensidade média de fluorescência. (A) Imagens de fluorescência de ca14 e embriões morfontes de controle a 2 dpf da linha Tg (ftyrp1: GFP), onde os melanócitos diferenciadores são marcados pela expressão de GFP. (B) O número de melanóforos em ca14 e embriões morfos controle a 2 dpf permanecem inalterados, n = 3 réplicas biológicas. (C) Imagens de fluorescência a 2 dpf de h2afv e morfontes de controle da linha Tg(ftyrp1:GFP). (D) O número de melanóforos em morfos h2afv é significativamente reduzido em comparação com os embriões morfofantes controle a 2 dpf, n = 3 réplicas biológicas. (E) Imagens de fluorescência de embriões controle e h2afv morfos a 36 hpf de Tg(mitfa:GFP) com melanócitos marcados. (F) A IFM por animal é calculada utilizando o software ImageJ e representada como um gráfico de barras que representa conjuntos de dados individuais. A MFI é significativamente reduzida em morfontes h2afv em comparação com o controle. O retângulo vermelho representa o ROI escolhido para a análise baseada em software ImageJ. n = 3 réplicas biológicas; P < 0,001, ****P < 0,0001. Teste t de Student; barras de erro são média ± erro padrão da média (EPM); barras de escala = 100 μm. Abreviações: MO = morpholino; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; GFP = proteína fluorescente verde; dpf = dias pós-fertilização; ROI = região de interesse; IFM = intensidade média da fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Quantificação dos melanóforos da cabeça. (A) Vista dorsal do h2afv e morfantes controle a 48 hpf mostrando melanóforos da cabeça. A caixa vermelha representa o ROI. Mantendo a área de interesse constante, o número de melanóforos da cabeça pode ser quantificado manualmente. (B) O número de melanóforos da cabeça reduziu significativamente após o knockdown do h2afv. As barras representam a média geométrica com IC de 95% do número de melanóforos de cabeça por embrião com >30 embriões cada. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: MO = morpholino; IC = intervalo de confiança; HPF = horas pós-fertilização; ROI = região de interesse. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S2: Microarray de melanócitos humanos primários tratados com PTU. Mapa de calor mostra a expressão de genes de pigmentação (mitf, tirosinase, dct, mc1r) após o tratamento em melanócitos primários humanos. Abreviações: PTU = 1-fenil-2-tiouréia; tyr = tirosinase. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O fenótipo de pigmentação manifesta-se frequentemente como alterações no conteúdo de melanina ou no número de melanócitos portadores de pigmento. O método aqui descrito permite a dissecção dessa dicotomia e permite avaliar qualitativamente e quantitativamente o conteúdo de melanina e o número de melanóforos por embrião, independentemente do conteúdo de melanina. A alta fecundidade do peixe-zebra, a natureza visível dos melanócitos pigmentados e a falta de transferência de melanossomos permitem a dissecção da biologia dos melanócitos usando esta abordagem genética reversa que é passível de triagem de médio rendimento.
A escolha do silenciamento baseado em morfolinos emana da facilidade de silenciamento e da capacidade de testar vários candidatos paralelamente. Existem certas limitações do uso de uma abordagem de silenciamento baseada em morfolinos, e diretrizes para o uso e interpretação dessas valiosas ferramentas foram descritas anteriormente13. Essencialmente, a validação do fenótipo após knockdown usando múltiplas OMs fornece uma solução tangível para esse problema. Uma estratégia alternativa é o uso de perturbação genética baseada em CRISPR. A penetrância do fenótipo é limitada devido à frequência inerentemente menor de eventos genéticos e pode ser agravada por mutações heterogêneas. Isso limita seu uso para o rastreamento genético reverso14.
A avaliação fenotípica de perturbações seletivas de melanócitos frequentemente resulta em diminuição do conteúdo pigmentar devido à resposta melanogênica alterada. No entanto, existem vários genes que perturbam a especificação dos melanócitos e, portanto, causam uma redução na pigmentação devido a uma diminuição no número geral de melanócitos. Uma dissecção sistemática dos dois cenários é essencial para atribuir a função molecular do gene na pigmentação. A medida do conteúdo de melanina é agravada pela natureza complexa do polímero de melanina. Dos dois métodos disponíveis, a saber, solubilização de melanina por NaOH e detecção baseada em HPLC de produtos estáveis de oxidação de melanina ácido 1H-pirrol-2,3,5-tricarboxílico e pirrol-2,3-ácido dicarboxílico, o primeiro método pode ser realizado rotineiramente em laboratório, enquanto o segundo requer padrões específicos e instrumentação sofisticada15.
Além disso, o número de embriões requerido pelo método NaOH também é maior devido às várias etapas envolvidas na detecção. A hidrólise à base de NaOH solubiliza a melanina e permite a quantificação espectrofotométrica. Embora esse método seja robusto e possa ser adotado para uma tela de rendimento médio (10-15 candidatos por vez), a xantina presente nos xantóforos é uma substância potencialmente interferente devido à sua absorção inerente na faixa de 400-450 nm16. Assim, uma concordância entre a determinação do valor médio de cinza baseado na análise de imagem e o ensaio do conteúdo de melanina deve ser realizada para confirmar a redução no conteúdo de melanina.
O PTU oferece uma ferramenta fácil para reduzir a pigmentação e visualizar o embrião transparente. O uso poderia resultar em mudanças de feedback e invocar alterações nos melanócitos. Entretanto, observamos mínimas alterações na expressão dos genes de pigmentação (Figura Suplementar S2).
A contagem de melanócitos é mais fácil na linha média lateral e na região da cabeça, pois os melanócitos são relativamente distintos nessas regiões (Figura Suplementar S1). Os melanóforos da linha lateral surgem da população de células-tronco melanocíticas que reside próxima aos gânglios da raizdorsal18. A aquisição de imagens dessa população tem várias vantagens, como número fixo por embrião e distinção clara. No entanto, as duas linhas contralaterais precisam ser imageadas inclinando levemente o embrião; caso contrário, os dois se fundem devido à natureza transparente do embrião, dificultando a contagem (Figura 1C versus Figura 2C).
Os melanóforos do peixe-zebra são distintos das células pigmentadas do olho que são derivadas do neuro-ectoderma. Estes são distinguíveis por seu posicionamento dentro do embrião e são evidentes no olho versus o padrão corporal. No experimento baseado em FACS, as células derivadas do olho podem ser distinguidas por seu tamanho, pois são significativamente menores do que os melanóforos e podem ser fechadas usando critérios de tamanho ou dispersão.
Estimativas de melanócitos em diferentes estágios de maturação usando linhagens transgênicas são facilmente realizadas usando quantificação baseada em imagem. A quantificação do número de melanóforos da linha lateral é robusta, pois seu número varia em uma janela entre 2 dpf e 5 dpf em cada lado do embrião17. Entretanto, o número de melanóforos da linha lateral é determinado pela migração e estabelecimento de um pool de células-tronco associadas ao gânglio da raiz dorsal18. Assim, qualquer alteração nesses processos pode levar a uma observação semelhante. Para contornar esse fator de confusão, a estimativa baseada em FACS de todos os melanóforos é uma solução tangível.
Alternativamente, a quantificação de melanóforos da cabeça pode ser realizada conforme delineado na Figura Suplementar S1 como um substituto para o número de melanóforos. É interessante notar que as alterações nos níveis de estado estacionário do número de melanócitos podem significar duas funções opostas para o gene candidato em questão. Isso pode resultar na diminuição da especificação de melanócitos de precursores da crista neural ou causar morte específica de melanócitos e precisa ser abordada usando métodos como o ensaio do túnel. Variações como microinjeções seguidas de imagens de células vivas permitiriam monitorar outros fenótipos específicos de melanócitos, como migração e padronização. De interesse para os pesquisadores de células pigmentares seria o processo de transferência de melanossomos, que não é operacional no sistema de peixes. No entanto, o movimento concertado do melanossomo em melanóforos pode ser estudado com alterações em imagens de células vivas descritas aqui com modificações. Ao todo, o protocolo detalhado apresentado neste artigo em vídeo permitiria que os pesquisadores de biologia celular de pigmentos consultassem genes candidatos e avaliassem seu papel na biologia de melanócitos.
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Disclosures
Todos os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio financeiro do Council for Scientific and Industrial Research vide project MLP2008 e do Department of Science and Technology para o projeto GAP165 pelo apoio ao trabalho apresentado neste manuscrito. Agradecemos a Jeyashri Rengaraju e Chetan Mishra por sua ajuda com os experimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
References
- Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
- Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
- Hoekstra, H. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates. Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).
- Quigley, I. K., Parichy, D. M. Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).
- Meyers, J. R. Zebrafish: development of a vertebrate model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).
- Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos. Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).
- Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
- Carney, T. J., et al. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf. Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).
- Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores. Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).
- Xu, Q.
- Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery. Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).
- Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).
- Wu, N., et al. The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).
- Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction. PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).
- Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A.
- Hultman, K. A., Johnson, S. L. Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern. Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).
- Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142 (4), 620-632 (2015).
