Développement d’un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale pour la mesure de l’énergétique mitochondriale sur le terrain
Summary
Nous avons conçu et construit un laboratoire mobile pour mesurer les taux de respiration dans les mitochondries isolées d’animaux sauvages capturés sur le terrain. Nous décrivons ici la conception et l’aménagement d’un laboratoire mitochondrial mobile et les protocoles de laboratoire associés.
Abstract
L’énergétique mitochondriale est un thème central de la biochimie et de la physiologie animales, les chercheurs utilisant la respiration mitochondriale comme mesure pour étudier la capacité métabolique. Pour obtenir les mesures de la respiration mitochondriale, des échantillons biologiques frais doivent être utilisés et l’ensemble de la procédure de laboratoire doit être terminée dans un délai d’environ 2 heures. De plus, plusieurs pièces d’équipement spécialisé sont nécessaires pour effectuer ces tests de laboratoire. Cela crée un défi pour la mesure de la respiration mitochondriale dans les tissus d’animaux sauvages vivant loin des laboratoires de physiologie, car les tissus vivants ne peuvent pas être conservés très longtemps après le prélèvement sur le terrain. De plus, le transport d’animaux vivants sur de longues distances induit un stress, qui peut altérer l’énergétique mitochondriale.
Ce manuscrit présente le MitoMobile de l’Université d’Auburn (AU), un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale qui peut être emmené sur le terrain et utilisé sur place pour mesurer le métabolisme mitochondrial dans des tissus prélevés sur des animaux sauvages. Les caractéristiques de base du laboratoire mobile et les méthodes étape par étape pour mesurer les fréquences respiratoires mitochondriales isolées sont présentées. De plus, les données présentées valident le succès de l’équipement du laboratoire mobile de physiologie mitochondriale et de la réalisation de mesures de la respiration mitochondriale. La nouveauté du laboratoire mobile réside dans la possibilité de se rendre sur le terrain et d’effectuer des mesures mitochondriales sur les tissus d’animaux capturés sur place.
Introduction
À ce jour, les études conçues pour mesurer l’énergie mitochondriale ont été limitées aux animaux de laboratoire ou aux animaux capturés à proximité de laboratoires de physiologie établis, ce qui a empêché les scientifiques d’effectuer des études bioénergétiques mitochondriales dans des tissus prélevés sur des animaux au cours d’activités telles que la migration, la plongée et l’hibernation 1,2,3,4,5,6 . Bien que de nombreux chercheurs aient réussi à mesurer les taux métaboliques de base et de pointe et les dépenses énergétiques quotidiennes des animaux sauvages7,8, la capacité des chercheurs à mesurer la performance des mitochondries est restée limitée (mais voir 1,4,9). Cela est dû en partie au besoin de tissus frais pour isoler les mitochondries et d’une installation de laboratoire pour effectuer les isolements dans les 2 heures environ suivant l’obtention du tissu frais. Une fois les mitochondries isolées, les mesures de la respiration mitochondriale doivent également être effectuées dans un délai de ~1 h.
Les fréquences respiratoires mitochondriales isolées sont généralement effectuées en mesurant la concentration d’oxygène dans un récipient scellé connecté à une électrode Clark. La théorie qui sous-tend cette méthode est fondée sur l’observation fondamentale que l’oxygène est le dernier accepteur d’électrons de la respiration mitochondriale pendant la phosphorylation oxydative. Par conséquent, lorsque la concentration d’oxygène diminue au cours d’une expérience, on suppose que la production d’adénosine triphosphate (ATP) se produit10. L’oxygène consommé est un indicateur de l’ATP produit. Les chercheurs peuvent créer des conditions expérimentales spécifiques en utilisant différents substrats et initier une respiration stimulée par l’adénosine diphosphate (ADP) (état 3) en ajoutant des quantités prédéterminées d’ADP dans la chambre. Suite à la phosphorylation de l’ADP exogène en ATP, le taux de consommation d’oxygène diminue, et l’état 4 est atteint et peut être mesuré. De plus, l’ajout d’inhibiteurs spécifiques permet d’obtenir des informations sur la respiration par fuite et la respiration non couplée10. Le rapport entre l’état 3 et l’état 4 détermine le rapport de contrôle respiratoire (RCR), qui est l’indicateur du couplage mitochondrial global10,11. Des valeurs plus faibles de RCR indiquent un dysfonctionnement mitochondrial global, tandis que des valeurs de RCR plus élevées suggèrent une plus grande étendue de couplage mitochondrial10.
Comme indiqué précédemment, le prélèvement de matériel biologique, l’isolement mitochondrial et la mesure de la fréquence respiratoire doivent être effectués dans les 2 heures suivant l’obtention du tissu. Pour accomplir cette tâche sans transporter les animaux sur de grandes distances vers des laboratoires établis, un laboratoire mobile de physiologie mitochondriale a été construit pour être transporté sur le terrain où ces données peuvent être recueillies. Un véhicule récréatif Jayco Redhawk 2018 a été converti en laboratoire mobile de physiologie moléculaire et nommé MitoMobile de l’Université d’Auburn (AU) (figure 1A). Un véhicule récréatif a été choisi en raison du réfrigérateur, du congélateur, du réservoir de stockage d’eau et de la plomberie intégrés, de l’électricité alimentée par des batteries de 12 volts, de la génératrice de gaz, du réservoir de propane et du système d’autonivellement. De plus, le véhicule récréatif permet de passer la nuit sur des sites éloignés pour recueillir des données. L’avant du véhicule n’a pas été modifié et sert de poste de conduite et de couchage (figure 1B). Les commodités de la chambre à coucher (lit, téléviseur et armoire) précédemment installées à l’arrière du véhicule et sur la cuisinière ont été retirées.
Des étagères en acier inoxydable sur mesure et un comptoir en quartz sur mesure soutenu par un cadre en aluminium 80/20 ont été installés à la place des commodités de la chambre et de la cuisinière (figure 1C). Les paillasses de laboratoire offrent un espace suffisant pour la collecte de données (figure 1D). La consommation d’énergie de chaque pièce d’équipement (c’est-à-dire la centrifugeuse réfrigérée, les chambres de respiration mitochondriale, les lecteurs de plaques, les ordinateurs, les homogénéisateurs, les balances, l’ultra-congélateur portatif et d’autres fournitures de laboratoire générales) a été prise en considération. Pour répondre aux exigences élevées de tension et de courant de la centrifugeuse, le système électrique a été mis à niveau pour devenir un équipement de qualité aéronautique. Un compartiment externe à l’arrière du véhicule a été converti en baie de stockage d’azote liquide, ce qui répond aux directives du ministère des Transports des États-Unis pour le stockage et le transport de l’azote liquide. Cette unité de stockage a été construite en acier inoxydable et dispose d’une ventilation appropriée pour empêcher toute fuite d’azote gazeux en expansion dans l’habitacle du véhicule.
Pour confirmer que le laboratoire mobile peut être utilisé dans des études bioénergétiques mitochondriales, les mitochondries ont été isolées et les taux de respiration mitochondriale des muscles squelettiques des membres postérieurs de souris domestiques sauvages (Mus musculus) ont été mesurés. Parce que Mus musculus est un organisme modèle, les taux de respiration mitochondriale de cette espèce sont bien établis12,13,14. Bien que des études antérieures aient documenté l’isolement mitochondrial par centrifugation différentielle15,16,17, un bref aperçu des méthodes utilisées dans les méthodes mobiles de laboratoire de physiologie mitochondriale est décrit ci-dessous.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le laboratoire mobile de physiologie mitochondriale permet aux chercheurs d’isoler les mitochondries et de mesurer les fréquences respiratoires mitochondriales dans les 2 heures suivant le prélèvement de tissus sur des sites de terrain éloignés. Les résultats présentés ici suggèrent que les mesures de la respiration mitochondriale effectuées dans l’UA MitoMobile sont comparables aux mesures effectuées dans un laboratoire de recherche universitaire. Plus précisément, les valeurs pour l’état 3, l’éta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Mark Nelms et John Tennant du département de génie électrique et informatique du Samuel Ginn College of Engineering de l’Université d’Auburn pour leur aide dans l’équipement structurel et électrique de l’AU MitoMobile. De plus, les auteurs reconnaissent le financement pour équiper l’UA MitoMobile et la recherche d’une subvention de l’Université d’Auburn pour les prix présidentiels pour la recherche interdisciplinaire (PAIR).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
Referências
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
