Разработка мобильной лаборатории митохондриальной физиологии для измерения митохондриальной энергетики в полевых условиях
Summary
Мы спроектировали и построили мобильную лабораторию для измерения частоты дыхания в изолированных митохондриях диких животных, отловленных в полевых условиях. В этой статье мы опишем конструкцию и оснащение мобильной митохондриальной лаборатории и связанные с ней лабораторные протоколы.
Abstract
Митохондриальная энергетика является центральной темой в биохимии и физиологии животных, и исследователи используют митохондриальное дыхание в качестве показателя для изучения метаболических способностей. Для получения показателей митохондриального дыхания необходимо использовать свежие биологические образцы, и вся лабораторная процедура должна быть завершена в течение примерно 2 часов. Кроме того, для проведения этих лабораторных анализов требуется несколько единиц специализированного оборудования. Это создает проблему для измерения митохондриального дыхания в тканях диких животных, живущих вдали от физиологических лабораторий, поскольку живая ткань не может сохраняться в течение длительного времени после сбора в полевых условиях. Кроме того, транспортировка живых животных на большие расстояния вызывает стресс, который может изменить энергетику митохондрий.
Эта рукопись знакомит с MitoMobile Обернского университета (AU), мобильной лабораторией митохондриальной физиологии, которую можно взять с собой в полевых условиях и использовать на месте для измерения митохондриального метаболизма в тканях, полученных от диких животных. Представлены основные возможности мобильной лаборатории и пошаговые методы измерения частоты изолированного митохондриального дыхания. Кроме того, представленные данные подтверждают успешность оснащения мобильной лаборатории митохондриальной физиологии и проведения измерений митохондриального дыхания. Новизна мобильной лаборатории заключается в возможности выезжать в поле и проводить митохондриальные измерения на тканях животных, отловленных на месте.
Introduction
На сегодняшний день исследования, предназначенные для измерения митохондриальной энергии, были ограничены лабораторными животными или животными, пойманными рядом с установленными физиологическими лабораториями, что не позволяло ученым проводить митохондриальные биоэнергетические исследования в тканях, собранных у животных во время таких видов деятельности, как миграция, ныряние и спячка 1,2,3,4,5,6 . В то время как многие исследователи успешно измеряли базальную и пиковую скорость метаболизма и суточные энергетические затраты диких животных 7,8, возможности исследователей по измерению производительности митохондрий остаются ограниченными (см. 1,4,9). Отчасти это связано с потребностью в свежей ткани для изоляции митохондрий и лабораторном оборудовании для проведения выделения в течение примерно 2 часов после получения свежей ткани. После того, как митохондрии были изолированы, измерения митохондриального дыхания также должны быть завершены в течение ~1 часа.
Изолированные митохондриальные дыхательные циклы обычно измеряются путем измерения концентрации кислорода в герметичном контейнере, подключенном к электроду Кларка. Теория, лежащая в основе этого метода, основана на фундаментальном наблюдении, что кислород является последним акцептором митохондриального дыхания во время окислительного фосфорилирования. Поэтому, поскольку концентрация кислорода падает во время эксперимента, предполагается, что происходит выработка аденозинтрифосфата (АТФ)10. Потребляемый кислород является показателем выработанной АТФ. Исследователи могут создать определенные экспериментальные условия, используя различные субстраты, и инициировать дыхание, стимулированное аденозиндифосфатом (АДФ) (состояние 3), добавив в камеру заданное количество АДФ. После фосфорилирования экзогенного АДФ в АТФ скорость потребления кислорода снижается, и состояние 4 достигается и может быть измерено. Кроме того, добавление специфических ингибиторов позволяет получить информацию о негерметичном дыхании и несвязанном дыхании10. Отношение состояния 3 к состоянию 4 определяет коэффициент дыхательного контроля (RCR), который является показателем общей митохондриальной связи10,11. Более низкие значения RCR указывают на общую митохондриальную дисфункцию, в то время как более высокие значения RCR предполагают большую степень митохондриальной связи10.
Как указывалось ранее, сбор биологического материала, выделение митохондрий и измерение частоты дыхания должны быть завершены в течение 2 ч после получения ткани. Чтобы выполнить эту задачу без транспортировки животных на большие расстояния в существующие лаборатории, была построена мобильная лаборатория митохондриальной физиологии, которую можно было бы доставить в полевые места, где эти данные могут быть собраны. Рекреационный автомобиль Jayco Redhawk 2018 года выпуска был преобразован в мобильную лабораторию молекулярной физиологии и назван MitoMobile Обернского университета (AU) (рис. 1A). Рекреационный автомобиль был выбран из-за встроенного холодильника, морозильной камеры, резервуара для хранения воды и сантехники, электричества от 12-вольтовых аккумуляторов, газового генератора, баллона с пропаном и системы самовыравнивания. Кроме того, рекреационное транспортное средство обеспечивает возможность ночевки в отдаленных местах для сбора данных. Передняя часть автомобиля не была переделана и обеспечивает управление и спальные места (рис. 1Б). Ранее установленные удобства в спальне (кровать, телевизор и шкаф) в задней части автомобиля и на плите были удалены.
Изготовленные на заказ стеллажи из нержавеющей стали и изготовленная на заказ кварцевая столешница, поддерживаемая алюминиевым каркасом 80/20, были установлены вместо туалетных принадлежностей и плиты (рис. 1C). Лабораторные столы обеспечивают достаточное пространство для сбора данных (рис. 1D). Учитывалось энергопотребление каждой единицы оборудования (т.е. охлаждаемой центрифуги, митохондриальных дыхательных камер, планшетов, компьютеров, гомогенизаторов, весов, портативной ультраморозильной камеры и других общелабораторных принадлежностей). Чтобы удовлетворить высокие требования центрифуги к напряжению и току, электрическая система была модернизирована до уровня авиационного оборудования. Внешний отсек в задней части автомобиля был преобразован в отсек для хранения жидкого азота, что соответствует рекомендациям Министерства транспорта США по хранению и транспортировке жидкого азота. Этот накопитель изготовлен из нержавеющей стали и имеет надлежащую вентиляцию, чтобы предотвратить утечку расширяющегося газообразного азота в салон автомобиля.
Чтобы подтвердить, что мобильная лаборатория может быть использована в митохондриальных биоэнергетических исследованиях, были выделены митохондрии и измерена скорость митохондриального дыхания скелетных мышц задних конечностей диких домовых мышей (Mus musculus). Поскольку Mus musculus является модельным организмом, скорость митохондриального дыхания этого вида хорошо известна12,13,14. Несмотря на то, что в предыдущих исследованиях была задокументирована изоляция митохондрий с помощью дифференциального центрифугирования15,16,17, ниже описан краткий обзор методов, используемых в мобильных методах митохондриальной физиологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мобильная лаборатория митохондриальной физиологии позволяет исследователям изолировать митохондрии и измерять скорость митохондриального дыхания в течение 2 часов после забора ткани на удаленных полевых участках. Представленные здесь результаты позволяют предположить, что измере?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность Марку Нелмсу (Mark Nelms) и Джону Теннанту (John Tennant) с кафедры электротехники и вычислительной техники Инженерного колледжа Сэмюэля Гинна при Обернском университете за помощь в структурном и электрическом оснащении AU MitoMobile. Кроме того, авторы выражают признательность за финансирование оснащения AU MitoMobile и исследования в рамках гранта Президентской премии Обернского университета за междисциплинарные исследования (PAIR).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
Referências
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
