Desenvolvimento de um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial para medir a energia mitocondrial no campo
Summary
Projetamos e construímos um laboratório móvel para medir as taxas respiratórias em mitocôndrias isoladas de animais silvestres capturados em locais de campo. Aqui, descrevemos o projeto e o equipamento de um laboratório mitocondrial móvel e os protocolos laboratoriais associados.
Abstract
A energia mitocondrial é um tema central na bioquímica e fisiologia animal, com pesquisadores usando a respiração mitocondrial como uma métrica para investigar a capacidade metabólica. Para obter as medidas da respiração mitocondrial, amostras biológicas frescas devem ser usadas, e todo o procedimento laboratorial deve ser concluído dentro de aproximadamente 2 h. Além disso, vários equipamentos especializados são necessários para a realização desses ensaios laboratoriais. Isso cria um desafio para medir a respiração mitocondrial nos tecidos de animais selvagens que vivem longe dos laboratórios de fisiologia, já que os tecidos vivos não podem ser preservados por muito tempo após a coleta no campo. Além disso, o transporte de animais vivos a longas distâncias induz estresse, o que pode alterar a energia mitocondrial.
Este manuscrito apresenta o MitoMobile da Universidade de Auburn (AU), um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial que pode ser levado a campo e usado no local para medir o metabolismo mitocondrial em tecidos coletados de animais selvagens. São apresentadas as características básicas do laboratório móvel e os métodos passo a passo para medir as taxas de respiração mitocondrial isolada. Além disso, os dados apresentados validam o sucesso de equipar o laboratório móvel de fisiologia mitocondrial e fazer medidas da respiração mitocondrial. A novidade do laboratório móvel está na capacidade de ir a campo e realizar medições mitocondriais nos tecidos dos animais capturados no local.
Introduction
Até o momento, os estudos destinados a medir a energia mitocondrial têm sido limitados a animais de laboratório ou capturados perto de laboratórios de fisiologia estabelecidos, o que impediu os cientistas de realizar estudos bioenergéticos mitocondriais em tecidos coletados de animais durante atividades como migração, mergulho e hibernação 1,2,3,4,5,6 . Embora muitos pesquisadores tenham medido com sucesso as taxas metabólicas basais e de pico e o gasto energético diário de animais selvagens 7,8, a capacidade dos pesquisadores de medir o desempenho das mitocôndrias permaneceu limitada (ver 1,4,9). Isso se deve, em parte, à necessidade de tecido fresco para isolar as mitocôndrias e a uma instalação laboratorial para realizar os isolamentos dentro de cerca de 2 h após a obtenção do tecido fresco. Uma vez que as mitocôndrias tenham sido isoladas, as medidas de respiração mitocondrial também devem ser concluídas dentro de ~1 h.
Taxas de respiração mitocondrial isoladas são geralmente realizadas medindo a concentração de oxigênio em um recipiente selado conectado a um eletrodo de Clark. A teoria por trás deste método baseia-se na observação básica de que o oxigênio é o último aceptor de elétrons da respiração mitocondrial durante a fosforilação oxidativa. Portanto, à medida que a concentração de oxigênio cai durante um experimento, supõe-se que a produção de adenosina trifosfato (ATP) ocorra10. O oxigênio consumido é um proxy para o ATP produzido. Os pesquisadores podem criar condições experimentais específicas usando diferentes substratos e iniciar a respiração estimulada por difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) adicionando quantidades predeterminadas de ADP à câmara. Após a fosforilação do ADP exógeno para ATP, a taxa de consumo de oxigênio diminui, e o estado 4 é atingido e pode ser medido. Além disso, a adição de inibidores específicos permite obter informações sobre respiração de vazamento e respiração desacoplado10. A razão entre o estado 3 e o estado 4 determina a razão de controle respiratório (RCR), que é o indicador do acoplamento mitocondrial global10,11. Valores mais baixos de RCR indicam disfunção mitocondrial global, enquanto valores mais altos de RCR sugerem maior extensão do acoplamento mitocondrial10.
Como dito anteriormente, a coleta de material biológico, o isolamento mitocondrial e a medição das taxas respiratórias devem ser concluídos em até 2 h após a obtenção do tecido. Para realizar essa tarefa sem transportar animais a grandes distâncias para laboratórios estabelecidos, um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial foi construído para ser levado a locais de campo onde esses dados possam ser coletados. Um veículo recreativo Jayco Redhawk de 2018 foi convertido em um laboratório móvel de fisiologia molecular e nomeado MitoMobile da Universidade de Auburn (AU) (Figura 1A). Um veículo recreativo foi selecionado por causa da geladeira embutida, freezer, tanque de armazenamento de água e encanamento, eletricidade alimentada por baterias de 12 volts, gerador a gás, tanque de propano e sistema de autonivelamento. Além disso, o veículo recreativo fornece a capacidade de permanecer em locais remotos durante a noite para coleta de dados. A frente do veículo não foi alterada e fornece os quartos de condução e dormir (Figura 1B). Foram retirados os equipamentos de higiene pessoal (cama, TV e armário) instalados anteriormente na parte traseira do veículo e no fogão.
Estantes de aço inoxidável feitas sob medida e uma bancada de quartzo personalizada apoiada em estrutura de alumínio 80/20 foram instaladas no lugar das comodidades do quarto e do fogão (Figura 1C). As bancadas do laboratório oferecem espaço adequado para a coleta de dados (Figura 1D). O consumo de energia de cada equipamento (centrífuga refrigerada, câmaras de respiração mitocondrial, leitores de placas, computadores, homogeneizadores, balanças, ultrafreezer portátil e outros materiais gerais de laboratório) foi levado em consideração. Para suportar as grandes demandas de tensão e corrente da centrífuga, o sistema elétrico foi atualizado para o de equipamentos de nível aeronáutico. Um compartimento externo na parte traseira do veículo foi convertido em um compartimento de armazenamento de nitrogênio líquido, que atende às diretrizes do Departamento de Transporte dos Estados Unidos para armazenamento e transporte de nitrogênio líquido. Esta unidade de armazenamento foi construída com aço inoxidável e tem ventilação adequada para evitar que qualquer gás nitrogênio em expansão vaze para o habitáculo do veículo.
Para confirmar que o laboratório móvel pode ser usado em estudos bioenergéticos mitocondriais, as mitocôndrias foram isoladas e as taxas de respiração mitocondrial do músculo esquelético dos membros posteriores de camundongos domésticos selvagens (Mus musculus) foram medidas. Como Mus musculus é um organismo modelo, as taxas respiratórias mitocondriais dessa espécie estão bem estabelecidas12,13,14. Embora estudos anteriores tenham documentado o isolamento mitocondrial por centrifugação diferencial15,16,17, uma breve visão geral dos métodos utilizados nos métodos laboratoriais de fisiologia mitocondrial móvel é descrita a seguir.
Protocol
Representative Results
Discussion
O laboratório móvel de fisiologia mitocondrial permite aos pesquisadores isolar mitocôndrias e medir as taxas de respiração mitocondrial dentro de 2 h após a coleta de tecido em locais de campo remotos. Os resultados aqui apresentados sugerem que as medidas da respiração mitocondrial feitas no AU MitoMobile são comparáveis às medidas feitas em um laboratório de pesquisa da universidade. Especificamente, os valores do estado 3, estado 4 e RCR para Mus musculus de origem selvagem aqui apresentados são…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Mark Nelms e John Tennant, do departamento de Engenharia Elétrica e de Computação da Faculdade de Engenharia Samuel Ginn da Universidade de Auburn, por ajudarem com o equipamento estrutural e elétrico do AU MitoMobile. Além disso, os autores reconhecem o financiamento para equipar o AU MitoMobile e a pesquisa de uma bolsa do Prêmio Presidencial da Universidade de Auburn para Pesquisa Interdisciplinar (PAIR).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
Referências
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
