בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים
Summary
חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.
Abstract
מיני חיידקים מגוונים מפרישים ~20-300 ננומטר שלפוחית חוץ-תאית (EVs), המורכבת מליפידים, חלבונים, חומצות גרעין, גליקנים ומולקולות אחרות שמקורן בתאי ההורים. כלי רכב חשמליים מתפקדים כווקטורים לתקשורת תוך-מינית ובין מינים, תוך שהם תורמים גם לאינטראקציה בין חיידקים לאורגניזמים מארחים בהקשר של זיהום והתיישבות. בהתחשב בריבוי התפקודים המיוחסים לרכבים חשמליים בבריאות ובמחלות, יש עניין גובר בבידוד כלי רכב חשמליים למחקרי in vitro ו-in vivo . ההשערה הייתה כי הפרדת כלי רכב חשמליים על בסיס תכונות פיזיקליות, כלומר גודל, תקל על בידוד שלפוחיות מתרביות חיידקים מגוונות.
תהליך הבידוד מורכב מצנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) לבידוד כלי רכב חשמליים מתרביות חיידקים. שלב סינון זרימה משיק מונע משאבה (TFF) שולב כדי לשפר את המדרגיות, ולאפשר בידוד של חומר מליטרים של תרבית תאים מתחילים. Escherichia coli שימשה כמערכת מודל המבטאת ננו-לוציפראז הקשור ל-EV ו-mCherry שאינו קשור ל-EV כחלבונים מדווחים. הננולוציפראז היה מכוון לרכבים החשמליים על ידי מיזוג ה-N-טרמינל שלו עם ציטוליזין A. שברים כרומטוגרפיים מוקדמים המכילים 20-100 ננומטר EVs עם ציטוליזין A – nanoLuc הקשורים היו שונים מן השברים המאוחרים יותר המכילים את החלבונים החופשיים. נוכחותו של ננולוציפראז הקשור ל- EV אושרה על ידי תיוג אימונוגולד ומיקרוסקופיית אלקטרונים. תהליך עבודה זה של בידוד EV ישים על מינים אחרים של חיידקים גראם-שליליים וגראם-חיוביים הקשורים למעי אנושיים. לסיכום, שילוב של צנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון/TFF ו-SEC מאפשר בידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים ממיני חיידקים מגוונים. שימוש בתהליך בידוד סטנדרטי יאפשר מחקרים השוואתיים של כלי רכב חשמליים מיקרוביאליים בין מינים.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים דמויי ליפוזום בגודל ננומטרי, המורכבים מליפידים, חלבונים, גליקנים וחומצות גרעין, המופרשים הן על ידי תאים פרוקריוטים והן על ידי תאים אאוקריוטים1. מאז המחקרים המוקדמים הממחישים את שחרורם של כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם שליליים2, מספר הפונקציות הביולוגיות המיוחסות לרכבים חשמליים חיידקיים (בקוטר 20-300 ננומטר) גדל בהתמדה בעשורים האחרונים. תפקידיהם כוללים העברת עמידות לאנטיביוטיקה3, היווצרות ביופילם4, חישת מניין5 והעברת רעלנים6. יש גם עניין גובר בשימוש ברכבים חשמליים חיידקיים כטיפולים, במיוחד בחיסון7 ובטיפול בסרטן8.
למרות העניין הגובר בחקר כלי רכב חשמליים, עדיין קיימים אתגרים טכניים בנוגע לשיטות בידוד. באופן ספציפי, יש צורך בשיטות בידוד הניתנות לשחזור, מדרגיות ותואמות לאורגניזמים מגוונים המייצרים EV. כדי ליצור מערכת עקרונות אחידה לתכנון ודיווח על בידוד ושיטות מחקר של כלי רכב חשמליים, האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות מפרסמת ומעדכנת את נייר העמדה של MISEV9. יתר על כן, קונסורציום EV-TRACK מספק פלטפורמה פתוחה לדיווח על מתודולוגיות מפורטות לבידוד EV המשמשות בכתבי יד שפורסמו כדי לשפר את השקיפות10.
בפרוטוקול זה הותאמו11,12 מתודולוגיות קודמות ששימשו לבידוד כלי רכב חשמליים מתרבית תאי יונקים, כדי לאפשר בידוד של כלי רכב חשמליים מתרבית תאי חיידקים. ביקשנו להשתמש בשיטות המאפשרות בידוד של כלי רכב חשמליים ממגוון מיקרובים, הניתנים להרחבה, ולאזן את הטוהר והתפוקה של EV (כפי שנדון בנייר העמדה של MISEV9). לאחר הסרת תאי חיידקים ופסולת על ידי צנטריפוגה וסינון, מדיום התרבית מרוכז על ידי אולטרה-סינון של מכשיר צנטריפוגלי (בנפח של עד ~100 מ”ל) או TFF מונע משאבה (לנפחים גדולים יותר). לאחר מכן, כלי רכב חשמליים מבודדים על ידי SEC באמצעות עמודות הממוטבות לטיהור כלי רכב חשמליים קטנים.
איור 1: סקירה סכמטית של זרימת עבודה של בידוד ר”ח חיידקי. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; TFF = סינון זרימה משיק; SEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל; MWCO = חיתוך משקל מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
זן עכבר-קומנסאלי של Escherichia coli (כלומר, E. coli MP113) שימש כאורגניזם מודל ושונה כדי לבטא ננולוציפראז הקשור ל-EV על ידי היתוך לציטוליזין A, כפי שדווח בעבר14. השיטות המשמשות כאן יכולות לעבד לפחות עד כמה ליטרים של תרביות חיידקים ולהפריד ביעילות בין חלבונים הקשורים ל-EV לבין חלבונים שאינם קשורים ל-EV. לבסוף, שיטה זו יכולה לשמש גם עבור מינים אחרים של חיידקים גראם חיוביים וגרם שליליים. כל הנתונים הרלוונטיים של הניסויים המדווחים הוגשו למאגר הידע EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול לעיל מתוארת שיטה הניתנת להרחבה ומבודדת באופן אמין כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם-שליליים/חיוביים ואירוביים/אנאירוביים שונים. יש לו כמה נקודות עצירה פוטנציאליות לאורך ההליך, אם כי עדיף להימנע מלקחת יותר מ 48 שעות כדי לבודד כלי רכב חשמליים ממדיה תרבית חיידקים מותנה.
…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שתואר לעיל נתמך על ידי מענק ההכשרה NIH TL1 TR002549-03. אנו מודים לד”ר ג’ון טילטון וזכארי טרוייר (אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב) על שהקלו על הגישה למכשיר ניתוח גודל החלקיקים; לו בראון (ספקטרדין) לסיוע טכני בניתוח נתוני התפלגות גודל החלקיקים; ד”ר דיוויד פוטנאם מאוניברסיטת קורנל על אספקת פלסמיד pClyA-GFP14; וד”ר מארק גוליאן מאוניברסיטת פנסילבניה על שסיפק לנו את ה- E. coli MP113.
Materials
| 0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | 3430 | it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter | Beckman Coulter | 392077 | Allows Vivacell to fit in rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI centrifuge | Beckman Coulter | No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brain Heart infusion (BHI) broth | Himedia | M2101 | After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains. |
| C-300 microfluidics cartridge | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (gift) | commensal bacteria derived from mouse gut | |
| Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter | ThermoFisher | 010-0151-05 | used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture |
| Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor | ThermoFisher | F12-6×500-LEX | fits 6 x 500 mL bottles |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper | Electron microscopy sciences | FCF-400-CU | |
| Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) | Electron microscopy sciences | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as 1.2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Microplate reader | Tecan | This equibment was used to measure the mCherry fluorescence | |
| In-Fusion HD Cloning Plus | Takara | 638909 | For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) broth, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-08 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer – special | HV-30800-24 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | low-binding/low-leaching tubing |
| Menadione (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 | R&D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysis software for particle size distribution | |
| OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482 | DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking |
| Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning |
| qEV original, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 0.5 mL | |
| qEV rack | Izon | for use with the qEV-original SEC columns | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 2 mL | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher | Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238) | |
| Qubit protein assay kit | ThermoFisher | Q33211 | Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C. |
| Sorvall Lynx 4000 centrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Microplate reader | Molecular Devices | This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence | |
| Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE |
One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size. |
| Uranyl acetate | Electron microscopy sciences | 22400 | |
| Vinyl anaerobic chamber | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | to filter MRPS diluent |
Referências
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Chatterjee, S. N., Das, J. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).
- Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).
- Yonezawa, H., et al. Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation. BMC Microbiology. 9, 197 (2009).
- Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Petousis-Harris, H., et al. Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study. Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).
- Kim, O. Y., et al. Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response. Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -. T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Watson, D. C., et al. Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles. Biomaterials. 105, 195-205 (2016).
- Watson, D. C., et al. Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).
- Lasaro, M., et al. Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts. Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).
- Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).
- Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).
