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Neuroscience

6-Hydroxydopamine-प्रेरित वयस्क Zebrafish-आधारित पार्किंसंस रोग मॉडल के लोकोमोटर मूल्यांकन

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63355
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1, 2, 1
1Collaborative Drug Discovery Research (CDDR) Group and Brain Degeneration and Therapeutics Group, Faculty of Pharmacy, Universiti Teknologi MARA (UiTM), Cawangan Selangor, Kampus Puncak Alam, 2Department of Medicine, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल वेंट्रल डायनेसेफलन (डीएन) पर न्यूरोटॉक्सिक 6-हाइड्रॉक्सीडोपामाइन (6-ओएचडीए) के साथ वयस्क ज़ेब्राफ़िश के इंट्रासेरेब्रोवेंट्रिकुलर (आईसीवी) इंजेक्शन का वर्णन करता है और खुले टैंक परीक्षण का उपयोग करके तैराकी व्यवहार पोस्टलेशन की हानि और बाद की वसूली का आकलन करता है, जो एक वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण के साथ होता है।

Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) में डोपामिनर्जिक न्यूरोनल हानि में देरी करने में वर्तमान उपचार की सीमाएं वैकल्पिक उपचारों की आवश्यकता को बढ़ाती हैं जो इन न्यूरॉन्स को बहाल कर सकती हैं। वर्तमान में विवो मॉडल में प्रीक्लिनिकल का उपयोग करके न्यूरोरिजेनेरेशन की बेहतर समझ की ओर बहुत प्रयास किया जाता है। स्व-मरम्मत के लिए यह पुनर्योजी क्षमता, हालांकि, स्तनधारियों में अक्षम है। ज़ेब्राफ़िश जैसे गैर-स्तनधारी जानवर इस प्रकार लगातार आत्म-नवीनीकरण करने की अपनी क्षमता के कारण एक उत्कृष्ट न्यूरोरेजेनेरेटिव मॉडल के रूप में उभरे हैं और मनुष्यों के लिए एक करीबी मस्तिष्क होमोलॉजी है। विवो में न्यूरोरजनरेशन में शामिल सेलुलर घटनाओं को स्पष्ट करने के प्रयास के हिस्से के रूप में, हमने 6-hydroxydopamine (6-OHDA) -प्रेरित वयस्क ज़ेब्राफ़िश-आधारित पीडी मॉडल की स्थापना की है। यह 99.96 mM 6-OHDA के अनुकूलित intracerebroventricular (ICV) microinjection के माध्यम से प्राप्त किया गया था, विशेष रूप से zebrafish मस्तिष्क के वेंट्रल diencephalon (Dn) में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (DpN) ablate करने के लिए। Immunofluorescence दिन तीन postlesion में DpN एब्लेशन के 85% से अधिक और घाव साइट पर DpN की पूर्ण बहाली 30 दिनों के postlesion का संकेत दिया। वर्तमान अध्ययन ने खुले क्षेत्र परीक्षण का उपयोग करके घाव के बाद जेब्राफ़िश तैराकी व्यवहार की हानि और बाद की वसूली को निर्धारित किया, जिसके माध्यम से दो पैरामीटर, यात्रा की गई दूरी (सेमी) और औसत गति (सेमी / एस) को परिमाणित किया गया था। वीडियो ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक समूह (एन = 6) की व्यक्तिगत मछली की रिकॉर्डिंग का विश्लेषण करके लोकोमोशन का मूल्यांकन किया गया था। निष्कर्षों ने एक महत्वपूर्ण (पी < 0.0001) गति (सेमी / एस) में कमी और शाम की तुलना में 3 दिन के बाद घाव वाले ज़ेब्राफ़िश की दूरी (सेमी) की यात्रा (सेमी) को दिखाया। घाव वाले ज़ेबराफ़िश ने तैराकी व्यवहार की पूर्ण वसूली का प्रदर्शन किया 30 दिनों के बाद। वर्तमान निष्कर्षों से पता चलता है कि 6-OHDA घाव वाले वयस्क ज़ेबराफ़िश पीडी में न्यूरोरिजेनेरेशन के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए पुन: प्रस्तुत करने योग्य गुणवत्ता के साथ एक उत्कृष्ट मॉडल है। न्यूरोरजनरेशन के साथ-साथ आंतरिक और बाह्य कारकों के अंतर्निहित तंत्र पर भविष्य के अध्ययन जो प्रक्रिया को संशोधित करते हैं, पीडी के खिलाफ नए सेल प्रतिस्थापन उपचार रणनीतियों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी), एक बीमारी जो मांसपेशियों की कठोरता, आराम करने वाले कंपन और ब्रैडीकिनेसिया की विशेषता है, दुनिया में सबसे तेजी से बढ़ती न्यूरोलॉजिकल बीमारी है1,2। पीडी का जोखिम और प्रसार उम्र के साथ तेजी से बढ़ता है, खासकर 50 वर्ष और उससे अधिक आयु के व्यक्तियों में। पीडी के एटियलजि और रोगजनन अब तक खराब रूप से समझे जाते हैं। इसने अक्सर पीडी की शुरुआती शुरुआत को अनियंत्रित छोड़ दिया है। वर्तमान में, डोपामाइन की कमी और पीडी रोगियों में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (डीपीएन) का नुकसान मोटर लक्षणों की अभिव्यक्ति से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है4। इस रिश्ते को भुनाते हुए, कई उपचारों को या तो डोपामाइन प्रतिस्थापन (यानी, लेवोडोपा) के रूप में सीधे कार्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया है या डीपीएन (यानी, गहरी मस्तिष्क उत्तेजना) के नुकसान की भरपाई करने के लिए। यद्यपि ये उपचार रोगसूचक लाभ के बारे में लाते हैं, वे रोग 5 के बिगड़ते पाठ्यक्रम को संशोधित नहीं करते हैं। इस महत्वपूर्ण कमजोरी को ध्यान में रखते हुए, सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी का प्रस्ताव किया गया है। इस दृष्टिकोण की प्रभावकारिता, हालांकि, ग्राफ्ट तैयारी, सेल विकास नियंत्रण और फेनोटाइप अस्थिरता की चुनौतियों को देखते हुए असंगत है। सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी, जिसने नैतिक चिंताओं को उठाया था, मस्तिष्क ट्यूमर और अवांछित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने का जोखिम भी पैदा करता है6,7।

वर्तमान चिकित्सीय रणनीतियों की सीमाओं ने पीडी के इलाज में एक संभावित दृष्टिकोण के रूप में डीपीएन के उत्थान पर अधिक जोर दिया है। डीपीएन या न्यूरोरिजेनेरेशन का उत्थान पीडी के प्रबंधन में आशाजनक सफलताओं में से एक के रूप में उभरा है, न केवल एक नई चिकित्सीय विधि के रूप में इसकी क्षमता के कारण, बल्कि रोग के तंत्र को समझने के साधन के रूप में भी, ९ । यह दृष्टिकोण विभेदन, प्रवास, और मौजूदा पूर्वज कोशिकाओं के एकीकरण के माध्यम से न्यूरोनल फ़ंक्शन की बहाली पर केंद्रित है घाव circuitry10। न्यूरोरजनरेशन का और पता लगाने के लिए, विवो अध्ययनों में विभिन्न किए गए हैं। यह पाया गया कि स्तनधारियों, उभयचरों और सरीसृपों जैसे कशेरुकी चोट 11,12 के बाद नई मस्तिष्क कोशिकाओं को उत्पन्न करते हैं। कशेरुकियों के बीच, स्तनधारी जानवरों को मनुष्यों के लिए उनकी आनुवंशिक समानता को देखते हुए अधिक मांग की जाती है। स्तनधारी, हालांकि, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सीमित और खराब पुनरावृत्ति क्षमता प्रदर्शित करते हैं जो मस्तिष्क के घाव के बाद वयस्कता के माध्यम से रह सकते हैं। सामान्य तौर पर, स्तनधारियों को न्यूरोरिजेनेरेशन को समझने के लिए पशु मॉडल के रूप में अनुपयुक्त किया जाता है, यह देखते हुए कि उत्पादित न्यूरॉन्स की कम संख्या पीडी में देखे गए क्षतिग्रस्त तंत्रिका सर्किट को बहाल करने के लिए पर्याप्त नहीं होगी। इस प्रकार, teleost-आधारित मॉडल, विशेष रूप से ज़ेबराफ़िश में, इसकी उच्च proliferative दर, लगातार आत्म-नवीनीकरण करने की क्षमता, और मनुष्यों के साथ मस्तिष्क होमोलॉजी को बंद करने के लिए बहुत पसंद किया जाता है14,15।

ज़ेबराफ़िश का उपयोग आमतौर पर PD16 में अव्यवस्थित आंदोलन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। ज़ेब्राफ़िश-आधारित पीडी मॉडल आमतौर पर न्यूरोटॉक्सिन द्वारा प्रेरित होता है, जिसमें 1-मिथाइल-4-फिनाइल-1,2,3,6-टेट्राहाइड्रोपायरिडीन (एमपीटीपी) और 6-हाइड्रॉक्सीडोपामाइन (6-ओएचडीए)17 शामिल हैं। हालांकि डीपीएन के विशिष्ट नुकसान और डोपामाइन के स्तर में कमी को प्रेरित करने में प्रभावी, एमपीटीपी-आधारित मॉडल पीडी की स्थितियों की बारीकी से नकल नहीं करते हैं क्योंकि डीपीएन हानि पूरी तरह से सीएनएस 18 तक सीमित नहीं है। रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने के लिए 6-OHDA की असमर्थता ने मस्तिष्क के भीतर सेलुलर और कार्यात्मक परिवर्तनों पर इसके प्रभावों को प्रतिबंधित कर दिया जब इसे इंट्रामस्क्युलर 19 के विपरीत इंट्राक्रैनियल रूप से प्रशासित किया जाता है। 6-OHDA के परिधीय प्रशासन ने तंत्रिका तंत्र 20 में डोपामाइन के स्तर में वैश्विक कमी का कारण बना। जबकि मस्तिष्कमेरु द्रव में 6-OHDA के प्रशासन ने पूरे CNS21 में DpN के एब्लेशन का कारण बना, जो PD में देखी गई स्थिति की नकल नहीं करता है जिससे DpN का नुकसान विशेष रूप से मानव मस्तिष्क के substantia nigra पर होता है। 6-OHDA के ICV प्रशासन, इसके विपरीत, विशेष रूप से zebrafish मस्तिष्क में ventral Dn के क्षेत्र में DpN के महत्वपूर्ण ablation प्रेरित, जो बारीकी से substantia nigra22 जैसा दिखता है। दिलचस्प बात यह है कि डीपीएन की वसूली 6-ओएचडीए-प्रेरित घाव के बाद 30 दिनों की सूचना दी गई थी और ये न्यूरॉन्स जीवन 23,24 के दौरान बच गए थे। DpN की कार्यात्मक वसूली को 6-OHDA-प्रेरित वयस्क ज़ेब्राफ़िश-आधारित PD model22 का उपयोग करके यात्रा की गई दूरी (सेमी) और माध्य गति (सेमी / एस) के लोकोमोटर मूल्यांकन के माध्यम से प्रदर्शित किया गया था।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन को पशु अनुसंधान और नैतिकता (CARE), Universiti Technologi MARA (UITM) पर समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है [संदर्भ संख्या: UITM CARE 346/2021, दिनांक 7 मई 2021]।

नोट: 6-OHDA-घाव वाले वयस्क ज़ेब्राफ़िश PD मॉडल के मानक पशुपालन और रखरखाव के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल22,25,26 का उपयोग किया गया था। 3.2-3.7 सेमी की मानकीकृत लंबाई के साथ पांच महीने से अधिक उम्र के वयस्क पुरुष ज़ेबराफ़िश (डैनियो रेरियो) के साथ प्रयोग किए गए थे।

1. ज़ेबराफ़िश रखरखाव और पूर्व आईसीवी microinjection तैयारी

  1. मछली को 28 ± 1.0 डिग्री सेल्सियस के नियंत्रित तापमान के तहत एक वातित पानी की टंकी में बनाए रखें। ज़ेब्राफ़िश पशुपालन और रखरखाव के लिए, पूरे प्रयोग के दौरान वाणिज्यिक समुद्री नमक (1 ग्राम / एल) के साथ खनिजीकृत आसुत जल का उपयोग करें27।
  2. 45 एल टैंक प्रति अधिकतम 25 मछली या 1.8 एल पानी में एक मछली रखें और उन्हें 14 घंटे के प्रकाश और 10 घंटे के अंधेरे फोटोपीरियड के शेड्यूल में उजागर करें। फ्रीज-सूखे कीड़े के साथ पूरक खाद्य छर्रों के साथ प्रति दिन कम से कम दो बार मछली को खिलाएं।
  3. आसुत जल के 250 मिलीलीटर में 2.5 ग्राम एमएस -222 और 5 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट को भंग करके ट्राइकेन मीथेनसल्फोनेट (एमएस -222) का एक केंद्रित स्टॉक समाधान तैयार करें। काम कर रहे संज्ञाहरण समाधान के 200 मिलीलीटर का उत्पादन करने के लिए स्टॉक समाधान के 2 मिलीलीटर पतला।
  4. 6-OHDA के 99.96 mM को पहले 0.9% w / v बाँझ-फ़िल्टर NaCl के 1 mL में एस्कॉर्बिक एसिड के 0.2 मिलीग्राम को भंग करके तैयार करें। समाधान में पाउडर के रूप में 6-OHDA के 25 मिलीग्राम जोड़ने से पहले 0.2-माइक्रोन फिल्टर के साथ समाधान को फ़िल्टर करें। प्रत्येक इंजेक्शन से पहले समाधान को ताजा तैयार करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।
    सावधानी: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (यानी, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, और फेस मास्क) पहनें और रसायनों को संभालते समय अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं का अभ्यास करें। रसायनों के सभी हैंडलिंग एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर किया जाना चाहिए।

2. जेब्राफ़िश के एनेस्थेटाइजेशन और आईसीवी इंजेक्शन

  1. संज्ञाहरण के दौरान regurgitation से बचने के लिए 24 घंटे के लिए मछली फास्ट. मछली को लगभग 1 मिनट के लिए एमएस -222 समाधान के 0.01% डब्ल्यू / वी युक्त कंटेनर में डुबोकर या जब तक कि सभी दृश्यमान मांसपेशियों की गति बंद नहीं हो जाती है, तब तक एनेस्थेटाइज़ करें।
  2. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखे गए पानी से लथपथ स्पंज पर एनेस्थेटिक मछली की स्थिति और नियमित रूप से मछली को गीला करें।
  3. मेटोपिक सीवन (एमएस), कोरोनल सीवन (सीएस), और सैजिटल सीवन (एसएस) के बीच चौराहे के आधार पर इंजेक्शन की स्थिति की पहचान करें जो ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क के ललाट और पार्श्विका खोपड़ी को जोड़ता है।
  4. जेबराफ़िश खोपड़ी पर विशिष्ट शारीरिक स्थिति द्वारा निर्देशित खोपड़ी में एक तेज 27 जी सुई का उपयोग करके 1.0 मिमी 2 क्षेत्र का एक छोटा सा छेद करें (चित्रा 1 ए, बी)।
  5. माइक्रोकेशिका इंजेक्टर को 60° कोण पर कम करें जब तक कि यह ज़ेब्राफ़िश खोपड़ी की कपाल छत से 1,200 μm की गहराई तक न पहुंच जाए (चित्रा 1 C)। स्थिति को ठीक करने के लिए Z सीमा दबाएँ.
  6. प्रारंभिक इंजेक्शन दबाव को 4000 hPa और मुआवजे के दबाव को 10 hPa पर सेट करें। इंजेक्शन की अवधि को 0.3 सेकंड पर सेट करें। प्रत्येक बाद के इंजेक्शन के साथ इंजेक्शन की तीव्रता को कम करें।
  7. इंजेक्ट 0.5 μL के 99.96 mM neurotoxin 6-OHDA (या 0.9% w / v शाम नियंत्रण समूह के लिए खारा) और माइक्रोकेशिका 20 s के लिए आराम करते हैं। सूखने से रोकने के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान आसुत पानी के साथ मछली को गीला करना जारी रखें।
  8. धीरे-धीरे माइक्रोकेशिका को हटा दें और बहते आसुत पानी के नीचे मछली को पुनर्जीवित करें। मछली को एक अलग रिकवरी टैंक में रखें और किसी भी विकर्षण को हटा दें जो संभावित रूप से वसूली प्रक्रिया को परेशान कर सकता है।
  9. रुकावट को साफ करने के लिए अगले इंजेक्शन से पहले माइक्रोकेशिका को फ्लश करें और सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन की तीव्रता 6-OHDA के 0.5 μL की वांछित मात्रा उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है।

Figure 1
चित्रा 1: न्यूरोटॉक्सिन की इंजेक्शन साइट, 6-OHDA. (A) माइक्रोकैपिलरी प्रविष्टि का बिंदु मेटोपिक टांके (एमएस), कोरोनल सीवन (सीएस), और सैगिटल सीवन (एसएस) के बीच चौराहे द्वारा निर्देशित होता है जो ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क के ललाट और पार्श्विका खोपड़ी को जोड़ता है (योजना दृश्य)। (बी) ज़ेब्राफ़िश खोपड़ी और मस्तिष्क का एक योजनाबद्ध ड्राइंग (योजना दृश्य) माइक्रोकेशिका को दिखाता है, जिसे सीधे हैबेनुला (हब) के ऊपर उतारा जाता है, और गोलार्धों के बीच चौराहे पर इसके प्रवेश के बिंदु को दर्शाया जाता है। (सी) ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क का एक योजनाबद्ध ड्राइंग (सैगिटल सेक्शन) इंजेक्शन के कोण और प्रवेश की गहराई को दर्शाता है। काला बिंदु उस घाव वाली साइट का प्रतिनिधित्व करता है जो लक्षित क्षेत्र, वेंट्रल डायनेसेफलन के ऊपर स्थित है। संक्षिप्त रूप: 6-OHDA: 6-hydroxydopamine, सीएस: कोरोनल टांका, Dn: diencephalon, Hab: habenula, Hyp: hypothalamus, MS: metopic टांका, OB: घ्राण बल्ब, POA: preoptic क्षेत्र, PT: पश्चवर्ती ट्यूबरकुलम, एसएस: sagittal सीवन, Tectum, और टेल: telencephalon. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. लोकोमोटर मूल्यांकन

नोट: ज़ेब्राफ़िश के लोकोमोटर मूल्यांकन (एन = छह / समूह; शाम बनाम घाव) का मूल्यांकन स्थापित प्रोटोकॉल 28,29 का उपयोग करके खुले टैंक परीक्षण के माध्यम से व्यक्तिगत रूप से मूल्यांकन किया गया था, जो तीसरे दिन और दिन 30 पोस्ट-6-ओएचडीए घाव पर था।

  1. वीडियो रिकॉर्डिंग
    1. प्रयोगात्मक टैंक (लंबाई 20 सेमी, चौड़ाई 11.5 सेमी, ऊंचाई 13 सेमी) को एक उठाए गए मंच (चित्रा 2 ए) पर सफेद कागज के साथ कवर की गई अपनी दीवारों के साथ रखें।
    2. एक प्रकाश स्रोत का उपयोग करके नीचे से टैंक को रोशन करें। आसुत पानी (80% -90% पूर्ण) के साथ टैंक को भरें और तापमान को 28 ± 1.0 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। एक थर्मामीटर का उपयोग करके तापमान को मापें और इसे वाणिज्यिक मछलीघर हीटर का उपयोग करके विनियमित करें।
    3. acclimatization के कम से कम 2 मिनट के बाद, 5 मिनट (चित्रा 2 बी) के लिए एक वीडियो कैमरे का उपयोग करके प्रयोगात्मक क्षेत्र के 2-आयामी (2 डी) विमान पर एक योजना दृश्य से मछली तैराकी व्यवहार रिकॉर्ड करें। रिकॉर्डिंग के पहले और अंतिम बैच के तैराकी व्यवहार में असंगतता से बचने के लिए, 10 min30 द्वारा acclimatization से अधिक न करें।
    4. प्रत्येक विषय की यात्रा की गई दूरी (सेमी) और माध्य गति (सेमी / एस) के अधिग्रहण के लिए ओपन-टैंक प्रोटोकॉल के साथ वीडियो ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके वीडियो का विश्लेषण करें।

Figure 2
चित्र 2: ज़ेबराफ़िश लोकोमोटर व्यवहार के मूल्यांकन के लिए एक खुले टैंक परीक्षण का प्रयोगात्मक सेटअप। (A) प्रयोगात्मक टैंक (सामने का दृश्य) एक उभरे हुए मंच पर रखा गया है जो नीचे से प्रकाशित होता है। टैंक की चार दीवारों को सफेद कागज के साथ कवर किया गया है और रिकॉर्डिंग को अक्षीय रूप से कैप्चर किया गया है। तापमान को एक थर्मामीटर का उपयोग करके मापा जाता है और एक वाणिज्यिक मछलीघर हीटर का उपयोग करके 28 ± 1.0 डिग्री सेल्सियस पर विनियमित किया जाता है। (बी) स्क्रीनशॉट (योजना दृश्य) वीडियो रिकॉर्डिंग है कि सेटअप का उपयोग कर कब्जा कर लिया है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. डेटा विश्लेषण
    1. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर खोलने के लिए आइकन पर डबल क्लिक करें। फ़ाइल टैब पर क्लिक करें और नया खाली प्रयोग बनाएँ का चयन करें। यह उपयोगकर्ता को जांच के उद्देश्यों के अनुसार प्रयोग पैरामीटर को अनुकूलित करने की अनुमति देगा।
    2. प्रोटोकॉल टैब पर क्लिक करें, वीडियो स्रोत का चयन करें, और नया वीडियो स्रोत जोड़ें पर क्लिक करें। उपलब्ध ड्रॉप-डाउन सूची पर क्लिक करें और वीडियो फ़ाइल विकल्प का चयन करें। यह फ़ाइल ब्राउज़िंग पॉप-अप को संकेत देगा जिसमें से ब्याज की वीडियो रिकॉर्डिंग का चयन किया जा सकता है।
    3. उपकरण सबटैब पर क्लिक करें और उपकरण स्थापित करने के लिए आयताकार आइकन का चयन करें। पूरे प्रयोगात्मक क्षेत्र को कवर करने के लिए आयताकार आइकन खींचें। तदनुसार स्केल बार सेट करें और मापनी अनुभाग की लंबाई में उपयोग किए जाने वाले पैमाने माप के संख्यात्मक मान को इनपुट करें। वर्तमान प्रयोग ने खुले टैंक परीक्षण के लिए 10 मिमी पैमाने का उपयोग किया।
    4. जानवरों का चयन करके पशु रंग सेट उपकरण पृष्ठभूमि की तुलना में गहरा कर रहे हैं. ट्रैकिंग में अन्य उपलब्ध विकल्पों को पूर्व निर्धारित डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स पर छोड़ दें.
    5. ज़ोन सबटैब में, पहले से तैयार किए गए उपकरण पर क्लिक करें। इस क्षेत्र को मानक क्षेत्र के रूप में सेट किया गया है जिसमें से स्थिति सभी परीक्षणों के लिए समान है।
    6. परीक्षण शेड्यूलिंग और परीक्षण डेटा रिपोर्ट के अंतर्गत निम्न विकल्पों का चयन करें: परीक्षण अवधि, यात्रा की गई कुल दूरी, और औसत गति. सूची में अन्य उपलब्ध परीक्षण वैकल्पिक हैं और शोधकर्ता की खोजी रुचि पर निर्भर करते हैं।
    7. प्रयोग टैब में, नाम अनुभाग के अंतर्गत समूह के नाम में टाइप करके और पशुओं की संख्या अनुभाग में प्रति समूह जानवरों की संख्या टाइप करके जानवरों को उनके परीक्षण समूह के अनुसार असाइन करें.
    8. प्रयोग चलाने के लिए परीक्षण टैब पर जाएँ. स्टार्ट टेस्ट आइकन पर क्लिक करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी वीडियो का विश्लेषण नहीं किया जाता है।
    9. परिणाम टैब में, लोकोमोटर डेटा को पाठ रिपोर्ट प्रपत्र में देखने के लिए रिपोर्ट देखें चिह्न पर क्लिक करें.

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Representative Results

वर्तमान प्रयोग ने 6-OHDA के साथ ICV microinjection के बाद वयस्क ज़ेब्राफ़िश तैराकी व्यवहार में परिवर्तन का आकलन किया। पसंद के न्यूरोटॉक्सिन के रूप में 6-ओएचडीए का उपयोग करने का कारण रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने में असमर्थता के कारण था, जिसने ब्याज-वेंट्रल डायनेसेफेलॉन (डीएन) 16 के क्षेत्र में डीपीएन के विशिष्ट और लक्षित एब्लेशन का उत्पादन किया। DpN subpopulation यहाँ मानव के substantia nigra pars compacta31 में DpN उप-जनसंख्या के लिए शारीरिक समानता रखती है।

हमारे पिछले work22 के अनुसार, वयस्क ज़ेब्राफ़िश के DpN के खिलाफ 6-OHDA ICV माइक्रोइंजेक्शन के सेलुलर प्रभाव की पुष्टि DpN मार्कर-टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज़ (TH) के इम्यूनोहिस्टोस्टेनिंग के माध्यम से की गई थी। ब्याज का मुख्य मस्तिष्क क्षेत्र डीएन था, जो प्रीऑप्टिक क्षेत्र (पीओए), पश्चवर्ती ट्यूबरकुलम (पीटी), और हाइपोथैलेमस (हाइप) से बना था। यह पाया गया कि 99.96 mM 6-OHDA के परिणामस्वरूप Dn में TH-immunoreactive (TH-ir) की सबसे कम संख्या के साथ वयस्क ज़ेबराफ़िश की 100% जीवित रहने की दर हुई। यह भी पाया गया कि डीएन में टीएच-आईआर डीपीएन के 85% से अधिक (पी < 0.01) को तीसरे दिन पोस्टलेशन पर एब्लेटेड किया गया था। TH-ir DpN की संख्या तब पूर्ण पुनर्जनन 30 दिनों के postlesion (चित्रा 3) को प्राप्त करने से पहले दिन 14 postlesion पर 50% से अधिक की वृद्धि हुई। यह डेटा एब्लेशन 32 के बाद वयस्क ज़ेब्राफ़िश के डीएन में डीपीएन उप-जनसंख्या की पुनर्योजी क्षमताओं का समर्थन करता है।

Figure 3
चित्रा 3: ज़ेब्राफ़िश के Dn क्षेत्र में DpN का पुनर्जनन 99.96 mM 6-OHDA द्वारा घायल हो गया है। (A) Dn क्षेत्र के तीन मुख्य क्षेत्रों, POA, PT, और Hyp में TH-ir DpN की संख्या, चार डेटा बिंदुओं पर: शाम, 3, 14, और 30 दिनों के बाद 99.96 mM 6-OHDA न्यूरोटॉक्सिन द्वारा घाव के बाद। प्रत्येक बार n = 6 स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है; * पी < 0.05. (बी) शाम (I, I', और I'), 3 दिन के बाद घाव (II, II', और II'), 14 दिनों के बाद घाव (III, III', और III'), और 30 दिनों के बाद के घाव (IV, IV', और IV') टीएच (DpN; हरे) और DAPI (नाभिक; नीले) के साथ दाग वाले 30 दिनों के बाद के घाव (IV, IV', और IV') की प्रतिनिधि confocal माइक्रोस्कोप छवियां। स्केल बार = 50 μm. संक्षिप्त रूप- DAPI: 4', 6-diamidino-2-phenylindole, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine, Dn: diencephalon, DpN: डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स, Hyp: हाइपोथैलेमस, POA: preoptic क्षेत्र, PT: पश्चवर्ती ट्यूबरकुलम, एसडी: मानक विचलन, और TH-ir: tyrosine hydroxylase immunoreactive। Vijayanathan et al.22 से अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फिर हमने खुले टैंक परीक्षण का उपयोग करके लोकोमोटर मूल्यांकन किया ताकि 6-OHDA और शाम के ICV माइक्रोइंजेक्शन के बाद वयस्क ज़ेब्राफ़िश की दूरी (सेमी) और माध्य गति (सेमी / एस) में परिवर्तन की जांच की जा सके। प्रयोगात्मक मछली का मूल्यांकन तब तीसरे दिन के पोस्टलेशन (कम से कम संख्या में TH-ir DpN मनाया गया) और दिन 30 postlesion (घाव स्थल पर रिपोर्ट की गई पूरी तरह से बहाल DpN) पर किया गया था। एक वीडियो ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ज़ेब्राफ़िश तैराकी व्यवहार के विश्लेषण से संकेत मिलता है कि दिन तीन पोस्टलेशन पर घायल समूह की औसत गति (सेमी / एस) और यात्रा की गई दूरी (सेमी) दोनों को काफी कम कर दिया गया था (पी < 0.001) <45% जब शाम की तुलना में (चित्रा 4)। घाव वाले समूह ने मोटर फ़ंक्शन की वसूली का प्रदर्शन किया 30 दिन पोस्टलेशन दोनों की तुलना में औसत गति (सेमी / एस) और यात्रा की गई दूरी (सेमी) दोनों का कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है।

Figure 4
चित्रा 4: 6-OHDA द्वारा intracerebroventricular इंजेक्शन के बाद तैराकी व्यवहार में परिवर्तन। वयस्क ज़ेब्राफ़िश के तैराकी व्यवहार का आकलन घाव से पहले किया गया था, दिन तीन और दिन 30 पोस्टलेशन पर 99.96 mM 6-OHDA द्वारा। जिन मापदंडों का मूल्यांकन किया गया था, उनमें शामिल थे: (ए) औसत गति (सेमी / एस) और (बी) यात्रा की गई दूरी (सेमी)। प्रत्येक बार छह मछलियों के माध्य ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है; पी < 0.0001 (छात्र टी-टेस्ट)। संक्षेप: 6-OHDA: 6-hydroxydopamine, एसडी: मानक विचलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान कार्य ने स्थापित 6-OHDA-प्रेरित, वयस्क ज़ेब्राफ़िश-आधारित पीडी मॉडल के लोकोमोटर मूल्यांकन का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया। पूरे प्रयोग में तीन प्रमुख चरण शामिल थे: पूर्व-आईसीवी माइक्रोइंजेक्शन तैयारी, जेब्राफ़िश के आईसीवी माइक्रोइंजेक्शन, और लोकोमोटर मूल्यांकन। आईसीवी माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया और अच्छे प्रयोगात्मक परिणाम के बाद वयस्क ज़ेब्राफ़िश की स्वस्थ वसूली सुनिश्चित करने के लिए, वर्तमान अध्ययन में प्रत्येक चरण के लिए कुछ अच्छी प्रथाओं की सिफारिश की गई है।

पूर्व-आईसीवी माइक्रोइंजेक्शन तैयारी: पशु चयन प्रयोग से एक दिन पहले सबसे अच्छा प्रदर्शन किया गया था। लिंग की पहचान की गई थी और मछली की लंबाई को मापा गया था। 3.2-3.7 सेमी की मानकीकृत लंबाई के साथ पुरुष वयस्क ज़ेबराफ़िश को एक अलग प्रयोगात्मक टैंक में रखा गया था। इसके अतिरिक्त, मछली को एनेस्थीसिया 33 के दौरान पुनरुत्थान से बचने के लिए 24 घंटे की उपवास अवधि से गुजरना चाहिए। बाहरी तनाव को कम करने और ज़ेब्राफ़िश की वसूली प्रक्रिया में मदद करने के लिए प्रयोग से पहले एक मछली टैंक (सफेद कागज के साथ कवर की गई इसकी चार दीवारों के साथ) एक खड़े पानी के टैंक के साथ तैयार किया जाना चाहिए। सभी रसायनों को प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत से पहले ताजा तैयार किया गया था क्योंकि वे समय के साथ तेजी से खराब हो सकते थे और कमरे के तापमान 34,35 पर अस्थिर हो सकते थे।

6-OHDA का माइक्रोइंजेक्शन: मछली को अनावश्यक चोट और संक्रमण की शुरुआत को रोकने के लिए ज़ेब्राफ़िश की स्वच्छ और कोमल हैंडलिंग पूरी प्रक्रिया के दौरान की जानी चाहिए। मछली को गीले स्पंज के शीर्ष पर रखा जाना चाहिए और सूखने से बचने के लिए नम स्थिति में रखा जाना चाहिए36। एक छोटा सा चीरा अतिरिक्त दबाव से बचने के लिए फर्म और उचित बल के साथ एक बाँझ सुई का उपयोग करके बनाया गया था जो ज़ेबराफ़िश खोपड़ी को तोड़ सकता है। इस चीरा को मस्तिष्क गुहा में माइक्रोकेशिका के प्रवेश की अनुमति देनी चाहिए। माइक्रोकेशिका को तब प्रवेश बिंदु से 1,200 μm की गहराई तक कम किया गया था, जो दो गोलार्धों के बीच में है- टेलेन्सेफेलन और टेक्टम (चित्रा 1 बी, सी)। न्यूरॉन्स 37 के किसी भी अतिरिक्त क्षरण को रोकने के लिए इन गोलार्धों के बीच प्रवेश बिंदु चुना गया था। इस तकनीक में एक माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग शामिल था, न्यूरोटॉक्सिन के 0.5 μL के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए डिलीवरी के दबाव और समय को कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। यह अंशांकन फ़िल्टर paper38 पर गठित बूंद के आकार को मापने के द्वारा किया जा सकता है। हमारे अभ्यास में आमतौर पर प्रोग्राम करने योग्य मापदंडों का निम्नलिखित सेट शामिल होता है जिससे इंजेक्शन की तीव्रता को प्रत्येक बाद के इंजेक्शन (इंजेक्शन दबाव: 4000 एचपीए, इंजेक्शन की अवधि: 0.3 एस, और मुआवजे का दबाव: 10 एचपीए) के साथ कम किया गया था। न्यूरोटॉक्सिन को मस्तिष्क गुहा से बाहर निकलने से रोकने के लिए, इंजेक्शन और माइक्रोकेशिका 35 की वापसी के बीच 20 एस अंतराल लागू किया गया था। केशिका के छोटे आकार के कारण, प्रत्येक इंजेक्शन के बाद माइक्रोकेशिका को अवरुद्ध किया जा सकता है। इस प्रकार, माइक्रोकेशिका को अगले इंजेक्शन से पहले अनिवार्य रूप से फ्लश किया जाना चाहिए ताकि रुकावट को साफ किया जा सके और यह सुनिश्चित किया जा सके कि इंजेक्शन की तीव्रता 6-OHDA के 0.5 μL की वांछित मात्रा उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है। मछली को तब 28 ± 1.0 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने वाले रिकवरी टैंक में स्थानांतरित कर दिया जाएगा। यदि मछली 30 सेकंड के भीतर ठीक होने में विफल रहती है, तो मांसपेशियों के आंदोलनों की पूर्ण वसूली होने तक आसुत पानी के साथ अपने गिल और मुंह को बाहर निकालें।

लोकोमोटर मूल्यांकन: 6-ओएचडीए-प्रेरित वयस्क ज़ेब्राफ़िश पर अच्छे लोकोमोटर मूल्यांकन को सुनिश्चित करने के लिए, व्यवहार अध्ययन प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक ही समय सीमा के भीतर आयोजित किया जाना चाहिए। प्रत्येक व्यवहार अध्ययन को कम से कम 2 मिनट की अनुकूलन अवधि के लिए अनुमति देनी चाहिए और इसे 4 h39 के भीतर किया जाना चाहिए। वर्तमान प्रयोग सुबह 8 बजे से दोपहर 12 बजे के बीच किया गया था क्योंकि इस अवधि के दौरान ज़ेबराफ़िश अधिक सक्रिय थे। एक लंबी अनुकूलन अवधि आवश्यक है यदि ज़ेबराफ़िश तनाव और चिंता (ठंड और अनियमित व्यवहार) के स्पष्ट संकेतों के साथ किसी भी असामान्य व्यवहार को दिखाते हैं। हालांकि, रिकॉर्डिंग के पहले और अंतिम बैच के तैराकी व्यवहार में असंगतता से बचने के लिए, acclimatization 10 min30 से अधिक नहीं होना चाहिए। खुले क्षेत्र परीक्षण के लिए, किसी भी आकार, रंग, आकार और बनावट के एक प्रयोगात्मक टैंक का उपयोग रिकॉर्डिंग के लिए किया जा सकता है जो न्यूनतम 5 से 30 मिनट 42,43 तक होता है। ज़ेबराफ़िश व्यवहार अपने परिवेश के तापमान से बहुत प्रभावित होता है। 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक के छोटे उतार-चढ़ाव तैराकी की गति को बहुत प्रभावित कर सकते हैं44। इसलिए, प्रयोगात्मक टैंक में पानी के तापमान को एक वाणिज्यिक हीटर का उपयोग करके 28 ± 1.0 डिग्री सेल्सियस के नियंत्रित तापमान के तहत सख्ती से बनाए रखा जाना चाहिए, और पूरे प्रयोग के दौरान पानी के स्तर को लगभग 12 सेमी गहरा रखा गया था। टैंक की दीवारों को परीक्षण विषय और प्रयोगात्मक क्षेत्र के बीच इसके विपरीत बनाने के साथ-साथ बाहरी उत्तेजनाओं को कम करने के लिए सफेद कागज के साथ कवर किया गया था जो परीक्षण विषयों से एक अनपेक्षित प्रतिक्रिया का कारण बन सकता है। प्रत्येक समूह से मछली को ज़ेबराफ़िश न्यूरोबिहेवियरल रिसर्च 23,37,46 के लिए वर्तमान मानक अभ्यास के अनुसार व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया गया था। सामाजिक बातचीत के लिए ज़ेब्राफ़िश प्रवृत्ति को देखते हुए, चिंता है कि परीक्षण अवधि के दौरान अलगाव उनके व्यवहार को प्रभावित कर सकता है। हालांकि, वर्तमान प्रयोगात्मक सेटअप प्रति परीक्षण अधिकतम 10 मिनट तक सीमित था और अलगाव की इस छोटी अवधि का वयस्क ज़ेब्राफ़िश 48 की लोकोमोटर गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा था। व्यवहार अध्ययन के लिए सटीक डेटा संग्रह प्रदान करने के लिए, मूल्यांकन को विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों से ज़ेब्राफ़िश का यादृच्छिक रूप से चयन करके किया गया था (यानी, खुले टैंक परीक्षण 49 के दौरान या तो शाम और 6-OHDA घाव वाले समूह से दो ज़ेब्राफ़िश को बारी-बारी से एन = 6 तक)। रिकॉर्ड किए गए वीडियो का विश्लेषण एक वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम का उपयोग करके किया गया था जो आमतौर पर कृन्तकों के व्यवहार ट्रैकिंग के लिए उपयोग किया जाता है। चूंकि ज़ेबराफ़िश एक उभरता हुआ पशु मॉडल है, इसलिए ज़ेबराफ़िश का उपयोग करके किए गए व्यवहार परीक्षण आमतौर पर कृन्तकों 50 पर स्थापित वैज्ञानिक साहित्य से अनुकूलित होते हैं। यहां, हमने प्रयोगात्मक क्षेत्र में ज़ेब्राफ़िश को स्वचालित रूप से ट्रैक करने और वांछित मापदंडों की प्रभावी ढंग से गणना करने के लिए वीडियो ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर की क्षमता का प्रदर्शन किया। वीडियो ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर सॉफ़्टवेयर द्वारा समर्थित वीडियो फ़ाइलों की विविधता, नियमित रूप से अपडेट पैकेज रिलीज़ और विभिन्न ऑपरेटिंग सिस्टम 51 के लिए प्रदान किए गए समर्थन के कारण अन्य उपलब्ध सॉफ़्टवेयर से बाहर खड़ा था।

मौजूदा पशु-आधारित पीडी मॉडल की सीमाओं में से एक यांत्रिक समानताओं की कमी है जो मोटर हानि की नकल करती है जैसा कि मानव मस्तिष्क के सबस्टेंसिया निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा में डोपामिनर्जिक न्यूरोनल हानि के बाद मनाया जाता है। वयस्क ज़ेब्राफ़िश-आधारित पीडी मॉडल का उद्भव, हालांकि, इस विशेष सीमा को संबोधित कर सकता है। जैसा कि वर्तमान अध्ययन में देखा गया है, कम तैराकी की गति हमारे पिछले सेलुलर निष्कर्षों से मेल खाती है जिससे 6-OHDA-प्रेरित वयस्क ज़ेब्राफ़िश मॉडल के वेंट्रल डायनेसेफेलॉन में 85% से अधिक डोपामिनर्जिक न्यूरोनल हानि तीन दिन postlesion22। ऐसा प्रतीत होता है कि मस्तिष्क से अवरोही मोटर सिग्नलिंग को बाधित करने के लिए ब्याज के इस क्षेत्र में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के विशिष्ट एब्लेशन की आवश्यकता होती है, जिससे आंदोलन में धीमापन होता है53। L. J. Caldwell, et al.23 जिन्होंने ऑप्टिक टेकटम (प्रवेश के बिंदु) पर 6-OHDA के ICV इंजेक्शन का प्रदर्शन किया, उदाहरण के लिए, केवल ज़ेब्राफ़िश शोलिंग और संभोग व्यवहार में परिवर्तन देखा। वेंट्रल डीएन में डीपीएन का एब्लेशन महत्वपूर्ण है क्योंकि वयस्क ज़ेबराफ़िश के डीएन में डीपीएन की आबादी ज़ेबराफ़िश मोटर न्यूरॉन्स के लिए एकमात्र डोपामाइन स्रोत के रूप में कार्य करती है। यह मानव substantia nigra54 के अनुरूप है। वर्तमान अध्ययन ने बाद के पोस्टलेशन समय बिंदुओं में घायल जेब्राफ़िश द्वारा यात्रा की गई तेज तैराकी की गति और लंबी दूरी को भी देखा, जो ज़ेबराफ़िश तैराकी व्यवहार को नियंत्रित करने वाले डोपामाइन सिग्नलिंग की निरंतर और अंततः पूर्ण बहाली का संकेत देता है। इस प्रकार इन निष्कर्षों ने घाव वाले वयस्क ज़ेबराफ़िश में अपनी कार्यात्मक गतिविधियों को फिर से हासिल करने में नए पुनर्जीवित डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की क्षमता को मान्य किया।

6-OHDA के वर्तमान आवेदन मार्ग में थोड़ा इनवेसिव इंजेक्शन प्रतिमान शामिल था, जिसके लिए मस्तिष्क में गहराई से माइक्रोकेशिका के सम्मिलन की आवश्यकता होती थी, वेंट्रल डीएन के घाव क्षेत्र की ओर। यह विधि परिधीय इंजेक्शन की तुलना में थोड़ी श्रमसाध्य है और इंजेक्शन के बाद मृत्यु दर के जोखिम को कम करने के लिए प्रति मछली 3 मिनट के भीतर प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। इस प्रकार, आईसीवी इंजेक्शन के पूर्व अभ्यास को यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि विधि को लक्षित क्षेत्र (डीएन) पर महत्वपूर्ण अवधि के भीतर किया जा सकता है। वयस्क ज़ेबराफ़िश के वैध लोकोमोटर मूल्यांकन को प्राप्त करने के लिए, खुले टैंक परीक्षण प्रति दिन मूल्यांकन अवधि के केवल 4 घंटे तक सीमित है। इसलिए, एक प्रयोगात्मक ढांचे में पूर्व योजना की आवश्यकता होती है जिसमें बड़ी संख्या में जानवर शामिल होते हैं जिससे यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त समय आवंटित किया जाना चाहिए कि सेटअप प्रत्येक रिकॉर्डिंग के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं को पूरा करता है (उदाहरण के लिए, तापमान और पानी की गहराई)। यह योजना समय-आधारित प्रयोगों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जैसे कि वर्तमान अध्ययन, क्योंकि प्रत्येक रिकॉर्डिंग को इच्छित समय बिंदु पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रयोगात्मक सेटअप दो तैराकी मापदंडों के अध्ययन तक सीमित था जो विशेष रूप से ज़ेब्राफ़िश मोटर फ़ंक्शन का मूल्यांकन करते थे। हालांकि, शोलिंग और चिंता जैसे व्यवहार जैसे अन्य व्यवहार मापदंडों को अन्य प्रयोगात्मक सेटअप और विभिन्न विश्लेषणात्मक तरीकों की आवश्यकता होती है। संक्षेप में, यह 6-OHDA-प्रेरित वयस्क ज़ेब्राफ़िश में DpN न्यूरोरजनरेशन प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक पुनरुत्पादक और उपयोगी विधि है जो पीडी के खिलाफ सेल प्रतिस्थापन उपचार रणनीतियों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को मौलिक अनुसंधान अनुदान योजना [600-IRMI / FRGS 5/3 (033/2019)] के तहत उच्च शिक्षा मंत्रालय मलेशिया द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) Sigma-Aldrich, Missouri, USA 162957
Ascorbic acid Thermo Fisher Scientific, California, USA FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL Thermo Fisher Scientific, California, USA FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL Eppendorf, Hamburg, Germany 30124332
Nice conical flask, 100 mL Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Missouri, USA P4417
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Missouri, USA S5761
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 106404
Stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich, Missouri, USA E10521
Equipment
ANY-maze software Stoelting Co., Illinois, USA - version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance Sartorius, Göttingen, Germany SE 2
FemtoJet IV microinjector Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary Eppendorf, Hamburg, Germany 5242957000
InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000027
LED Portable Lamp MR. DIY, Selangor, Malaysia 9023251 20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips Ted Pella, California, USA 5367-12NM
Shanda aquarium heater Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia SDH-228
Thermometer Sera Precision, Heinsberg, Germany 52525
Video camera Nikon, Tokyo, Japan D3100

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तंत्रिका विज्ञान अंक 178
6-Hydroxydopamine-प्रेरित वयस्क Zebrafish-आधारित पार्किंसंस रोग मॉडल के लोकोमोटर मूल्यांकन
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Md Hamzah, N., Lim, S. M.,… More

Md Hamzah, N., Lim, S. M., Vijayanathan, Y., Lim, F. T., Abdul Majeed, A. B., Tan, M. P., Ramasamy, K. Locomotor Assessment of 6-Hydroxydopamine-induced Adult Zebrafish-based Parkinson's Disease Model. J. Vis. Exp. (178), e63355, doi:10.3791/63355 (2021).

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