Summary
Presentiamo qui un protocollo su come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia da cortecce di ratto per l'imaging video time-lapse di Ca2+ intracellulare per la ricerca sulla fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica nel modello di ratto hSOD1G93A .
Abstract
Questo protocollo dimostra come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare queste cellule allo scopo di studiare la fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) nel modello di ratto hSOD1G93A . In primo luogo, il protocollo mostra come isolare e coltivare astrociti e microglia da cortecce postnatali di ratto, e quindi come caratterizzare e testare queste colture per la purezza mediante immunocitochimica utilizzando il marcatore glial fibrillary acidic protein (GFAP) degli astrociti e il marcatore microgliale ionizzato della molecola adattatore legante il calcio 1 (Iba1). Nella fase successiva, vengono descritti i metodi per il caricamento del colorante (Fluo 4-AM sensibile al calcio) delle cellule coltivate e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video su cellule vive.
Gli esempi di registrazioni video consistono in: (1) casi di imaging Ca2+ di astrociti in coltura acutamente esposti all'immunoglobulina G (IgG) isolata da pazienti affetti da SLA, che mostrano una risposta caratteristica e specifica rispetto alla risposta all'ATP come dimostrato nello stesso esperimento. Gli esempi mostrano anche un aumento transitorio più pronunciato della concentrazione intracellulare di calcio evocato da ALS IgG negli astrociti hSOD1G93A rispetto ai controlli non transgenici; (2) Imaging Ca 2+ di astrociti in coltura durante un esaurimento delle riserve di calcio da parte di thapsigargin (Thg), un inibitore non competitivo del reticolo endoplasmatico Ca 2+ ATPasi, seguito da ingresso di calcio operato dal magazzino indotto dall'aggiunta di calcio nella soluzione di registrazione, che dimostra la differenza tra il funzionamento del magazzino Ca 2+ in hSOD1G93A e negli astrociti non transgenici; (3) L'imaging Ca 2+ della microglia in coltura mostra prevalentemente una mancanza di risposta alle IgG di SLA, mentre l'applicazione di ATP ha provocato un cambiamento di Ca2+. Questo documento sottolinea anche possibili avvertimenti e precauzioni riguardanti la densità cellulare critica e la purezza delle colture, scegliendo la corretta concentrazione del colorante Ca2+ e le tecniche di caricamento del colorante.
Introduction
Le tecniche di coltura cellulare hanno dato origine a numerosi progressi in diversi campi della neurofisiologia cellulare in salute e malattia. In particolare, le colture cellulari primarie, appena isolate dal tessuto neuronale di un animale da laboratorio, consentono allo sperimentatore di studiare da vicino il comportamento di diverse cellule in diversi mezzi biochimici e configurazioni fisiologiche. L'utilizzo di diversi indicatori fisiologici fluorescenti come i coloranti sensibili al Ca2+ in combinazione con la microscopia video time-lapse fornisce una migliore comprensione dei processi biofisici e biochimici cellulari in tempo reale.
La SLA è una malattia neurodegenerativa devastante che colpisce i motoneuroni superiori e inferiori1. La malattia presenta una patogenesi complessa di tipo familiare ma soprattutto della forma sporadica (90% dei casi)2. È noto che i meccanismi autonomi non cellulari contribuiscono alla fisiopatologia della SLA, principalmente a causa del ruolo essenziale delle cellule gliali3. La SLA è anche ben caratterizzata come una malattia neuroinfiammatoria con coinvolgimento di fattori umorali e cellulari di infiammazione.
L'immunoglobulina G è ampiamente usata come marcatore molecolare nella SLA e in altre malattie neurodegenerative. Studiare il livello sierico di questo marcatore può indicare la presenza e lo stadio della neuroinfiammazione nella malattia 4,5,6, mentre la sua presenza nel liquido cerebrospinale può indicare una rottura della barriera ematoencefalica7. Le IgG sono state anche identificate come depositi nei motoneuroni del midollo spinale dei pazienti con SLA7. Tuttavia, questo approccio ha mostrato alcune incongruenze nella correlazione del livello di IgG con lo stadio e le caratteristiche della malattia6.
Le IgG isolate dai sieri dei pazienti affetti da SLA (SLA IgG) possono indurre una risposta al calcio negli astrociti naïve8 e il rilascio di glutammato nei neuroni, indicando un effetto eccitotossico, un segno distintivo della patologia della SLA9. Tuttavia, gli studi sul modello di ratto hSOD1G93A ALS (contenente copie multiple della mutazione umana SOD110) hanno mostrato un numero di marcatori di stress ossidativo in cellule neurogliali in coltura11, tessuti 12,13,14 o animali vivi 13. È interessante notare che gli astrociti coltivati dal modello di ratto SLA erano più inclini allo stress ossidativo indotto dal perossido rispetto agli astroglia dei compagni di cucciolata non transgenici11.
Le cellule microgliali in coltura sono influenzate dalla SLA IgG in modo meno evidente. Vale a dire, una linea cellulare microgliale BV-2 ha mostrato un aumento del segnale dai marcatori fluorescenti dello stress ossidativo in risposta all'applicazione di soli 4/11 campioni di pazienti IgG ALS15. È noto che le microglia partecipano a molte patologie neuroinfiammatorie, aggiungendo stress ossidativo e fase di progressione tardiva nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA16,17. Tuttavia, i dati con le IgG della SLA hanno indicato che queste cellule potrebbero non essere reattive come gli astrociti a questi fattori umorali dell'infiammazione della SLA. Diversi studi sono stati condotti con astrociti primari da modelli murini di SLA, non solo nei cuccioli ma anche in animali sintomatici, sia sul cervello che sul midollo spinale 18,19,20,21. Questo vale anche per le colture primarie microgliali, anche se in misura minore rispetto agli astrociti e per lo più dalle regioni del cervello allo stadio embrionale22,23,24.
Usiamo l'imaging video time-lapse di Ca2+ su cellule in coltura principalmente come mezzo per seguire i transitori intracellulari di questo ione come marker fisiologico di eccitotossicità. Pertanto, mediante la caratterizzazione biofisica di questi transitori (ampiezza, area sotto transitoria, tempo di salita, frequenza) il ricercatore può ottenere parametri diagnostici sperimentali da diversi modelli cellulari di neurodegenerazione. Questa tecnica offre quindi il vantaggio di una valutazione fisiologica quantitativa delle IgG come biomarcatori della malattia. Esiste un ampio corpus di letteratura sul ruolo delle IgG e del Ca2+ nell'induzione della SLA. La maggior parte di questi studi sono stati condotti inducendo la SLA iniettando IgG del paziente in animali da esperimento 25,26,27,28,29, che hanno poi mostrato elevazione intracellulare di Ca 2+ e deposizioni di IgG. Una linea di studi ha esplorato l'effetto delle IgG di SLA sulla sinapsi motoria in vitro30,31,32. Nel contesto di cui sopra, la tecnica qui presentata pone l'attenzione sulle cellule gliali come attori importanti nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA e quantifica la loro potenziale risposta eccitotossica alle IgG come fattori umorali della neuroinfiammazione. Questo approccio può avere un'applicazione più ampia nel testare altri fattori umorali come sieri interi, liquori o citochine in diversi sistemi di coltura cellulare e in modelli cellulari di infiammazione generale.
Questo articolo descrive come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare ulteriormente queste cellule per studiare la fisiopatologia della SLA con IgG derivate dai sieri dei pazienti. I protocolli sono dettagliati per il caricamento del colorante delle cellule in coltura (Figura 1) e le registrazioni dei cambiamenti di Ca2+ negli esperimenti di imaging video time-lapse. Esempi di registrazioni video mostreranno come le cellule gliali reagiscono alle IgG della SLA rispetto all'ATP, quest'ultimo attivando i recettori purinergici della membrana. Viene mostrato per la prima volta un esempio di come gli astrociti isolati dal cervello del ratto hSOD1G93A ALS reagiscono con una risposta Ca 2+ più pronunciata alle IgG di SLA rispetto ai controlli non transgenici e come correlare questo processo alle differenze nel funzionamento del negozio Ca2+. Viene anche mostrato un esempio di imaging del calcio nelle cellule microgliali acutamente sfidate con SLA IgG, con solo una modesta risposta di calcio intracellulare.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le direttive UE sulla protezione degli animali per scopi scientifici e con il permesso della Commissione etica della Facoltà di Biologia, Università di Belgrado (numero di approvazione EK-BF-2016/08). Per quanto riguarda il materiale del paziente (sieri per IgG), è stato raccolto per l'esame clinico di routine con il consenso informato del paziente in conformità con il Codice etico dell'Associazione medica mondiale (Dichiarazione di Helsinki) per gli esperimenti che coinvolgono esseri umani. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico del Centro clinico della Serbia (n. 850/6).
1. Preparazione della coltura cellulare primaria
- Isolamento del tessuto cerebrale
NOTA: l'isolamento deve essere eseguito su ghiaccio, utilizzando soluzioni ghiacciate.- Utilizzare cuccioli appena nati di 1-3 giorni per la coltura cellulare neonatale primaria33.
NOTA: Per lo studio qui presentato, sono stati utilizzati Sprague Dawley hSOD1G93A e ratti non transgenici. Per la genotipizzazione, le code di ratto sono state utilizzate per la successiva estrazione del DNA e la PCR. - Cospargere la testa del cucciolo con etanolo al 70% e decapitarlo immediatamente velocemente usando le forbici.
- Tagliare la pelle usando forbici ad angolo piccolo per esporre il cranio. Apri il cranio facendo un taglio dal forame magno verso le orbite . Quindi, esegui un taglio perpendicolare della linea mediana. Rimuovere il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri contenente soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
NOTA: Pulire gli strumenti tra i cuccioli per evitare la contaminazione incrociata tra cuccioli transgenici e non transgenici. L'isolamento delle cortecce dal resto del cervello dovrebbe essere fatto sotto uno stereomicroscopio. - Usando la punta della pinza, strappare le connessioni tra i due emisferi. Quindi, separare gli emisferi con una pinza curva spingendo delicatamente un emisfero dal centro verso il lato.
- Rimuovere le meningi strappandole con cura con una pinza dritta e curva.
- Rimuovere l'ippocampo pizzicandolo con una pinza curva. Scartare l'ippocampo o usarlo per un'altra preparazione di coltura cellulare.
NOTA: Ulteriori passaggi devono essere eseguiti sotto la cappa a flusso laminare per garantire condizioni sterili.
- Utilizzare cuccioli appena nati di 1-3 giorni per la coltura cellulare neonatale primaria33.
- Omogeneizzazione e dissociazione dei tessuti
- Trasferire una corteccia in un tubo da 15 mL riempito con 3 mL di PBS freddo. Pipet la sospensione su e giù con una punta da 1 ml, completando 10-15 colpi fino a quando la sospensione diventa omogenea.
NOTA: Prestare molta attenzione a non produrre bolle in questo processo. - Centrifugare a 500 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di PBS freddo pipettandolo su e giù con una punta da 1 ml. Ripetere la fase di centrifugazione.
NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate da questo punto devono essere preriscaldate a 37 °C. - Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di DMEM (Modified Eagle Medium) completo di Dulbecco integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10% e antibiotici (penicillina e streptomicina). Trasferire l'omogenato in una provetta da 2 ml.
- Passare l'omogenato attraverso aghi da 21 G e 23 G (tre volte ciascuno) per fare una sospensione di singole cellule.
NOTA: Prestare molta attenzione a non produrre bolle in questo processo.
- Trasferire una corteccia in un tubo da 15 mL riempito con 3 mL di PBS freddo. Pipet la sospensione su e giù con una punta da 1 ml, completando 10-15 colpi fino a quando la sospensione diventa omogenea.
- Versare la sospensione cellulare preparata da una corteccia in una capsula di Petri di 60 mm di diametro o in un matraccio T25 (con la superficie pretrattata con un rivestimento polipeptidico per la crescita di cellule aderenti) contenente 3 ml di DMEM completo. Agitare leggermente la capsula di Petri in modo che la sospensione sia uniformemente distribuita.
- Far crescere le cellule nell'incubatore in atmosfera umidificata al 5% di CO2/95% di aria a 37 °C.
- Cambiare il mezzo 48 ore dopo l'isolamento e sostituire il mezzo ogni 3 giorni.
- Per promuovere la crescita degli astrociti, quando le cellule raggiungono il 70% -80% di confluenza, lavarle con PBS preriscaldato per rimuovere le cellule gliali debolmente attaccate e le tracce di FBS nel mezzo.
- Tripsinizzare lo strato sottostante di astrociti aggiungendo 1 ml di soluzione di tripsina preriscaldata (0,25% tripsina, 0,02% EDTA in PBS, filtrata sterile).
- Posizionare il piatto nell'incubatrice a 37 °C per 2-5 min.
- Controlla le cellule al microscopio. Quando iniziano a staccarsi, aggiungere 4 ml di DMEM completo.
- Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 500 × g per 5 min.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo. Contare le cellule usando un emocitometro.
- Riplaccare le celle ad una densità di 104 cellule/cm2 in 5 ml di DMEM completo fresco.
- Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Per ridurre al minimo la presenza di altri tipi di cellule gliali, dopo che gli astrociti hanno raggiunto il 50% di confluenza e prima di ogni sostituzione del mezzo, lavare le cellule con DMEM completo.
- Aspirare il mezzo surnatante con una pipetta da 1 mL e erogarlo delicatamente sullo strato di cellule più volte. Assicurarsi che l'intera superficie dello strato cellulare sia coperta durante questa fase di lavaggio.
- Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza (di solito dopo 14 giorni), ripetere la tripsinizzazione e la raccolta di astrociti come descritto al punto 1.6.
- Seme 5 × 103 di astrociti su un coprislip circolare di vetro di 7 mm rivestito con poli-L-lisina (50 μg/ml). Usali in esperimenti dopo 48 ore.
- Per promuovere la microglia, dopo il passaggio 1.7, consentire alle cellule gliali di raggiungere uno strato confluente34. Quando le cellule microgliali appaiono sopra lo strato di astrociti (dopo 10-15 giorni, riconosciute dai loro corpi più piccoli e più ovali e dai processi più brevi), agitare la capsula di Petri su uno shaker orbitale per 2 ore a 220 giri / min.
- Disperdere e seminare cellule microgliali
- Lavare leggermente le cellule staccate e attaccate liberamente aspirando il mezzo surnatante con una punta di pipetta da 1 mL e erogarlo delicatamente sullo strato di cellule più volte. Assicurarsi di coprire l'intera superficie dello strato cellulare durante questa fase di lavaggio, raccogliere il mezzo con le celle staccate e trasferirlo in un tubo da 15 ml.
- Centrifugare a 500 × g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno.
- Far passare la sospensione cellulare attraverso un ago da 21 G per ottenere una sospensione a cellula singola.
NOTA: La maggior parte dei metodi pubblicati utilizza tripsina o papaina per dissociare il tessuto; tuttavia, gli aghi 21 G hanno il vantaggio di prevenire la sovradigestione delle cellule, consentendo una dissociazione più delicata. - Contare le cellule usando un emocitometro. Seme 5 × 103 cellule microgliali su un coprislip circolare di vetro di 7 mm rivestito con poli-L-lisina (50 μg/ml). Usali in esperimenti dopo 48 ore.
NOTA: È difficile ottenere una coltura microgliale pura agitando, poiché le cellule precursori degli oligodendrociti e gli astrociti possono essere ancora presenti in numero variabile a seconda dell'esperienza dello sperimentatore. Il protocollo immunocitochimico utilizzato per stimare la presenza di diverse popolazioni cellulari in colture gliali è stato descritto altrove35.
2. Immunocitochimica
- Risciacquare le celle placcate su coprivetrini in PBS, 2 x 1 min.
- Fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Lavare in PBS 3 x 5 min.
- Incubare in una soluzione bloccante contenente il 10% di siero normale d'asina (NDS)/l'1% di albumina sierica bovina (BSA)/lo 0,1% di Triton X-100 per 45 minuti a RT.
- Aggiungere 50 μL di una soluzione bloccante per coprislip di 10 mm di diametro.
- Preparare anticorpi primari in 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 nelle seguenti diluizioni: mouse anti-GFAP 1:300, capra anti-Iba1 1:500. Incubare le cellule con anticorpi primari durante la notte a +4 °C.
- Risciacquare in PBS, 3 x 10 min.
- Incubare con gli anticorpi secondari coniugati con un fluoroforo: asino anti-topo (eccitazione 488 nm [1:200)) o asino anti-capra (eccitato a 647 nm [1:200)). Incubare le cellule per 2 ore a RT al buio.
- Lavare in PBS, 7 x 5 min.
- Incubare le cellule con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1:4.000) per 10 minuti a RT.
- Lavare in PBS 5 x 5 min.
- Montare i vetrini sui vetrini del microscopio utilizzando una soluzione di montaggio; Usane una goccia per ogni foglietto.
NOTA: le diluizioni degli anticorpi possono variare a seconda del produttore. Gli utenti devono determinare le diluizioni ottimali per i loro esperimenti.
3. Imaging video time-lapse
NOTA: Le soluzioni contenenti il colorante fluorescente devono essere protette dalla luce diretta. Prima di iniziare l'esperimento di imaging, assicurarsi che il vetrino di copertura non si muova quando si attiva la perfusione.
- Preparazione di soluzioni e celle
- Preparare la soluzione extracellulare (ECS) per l'imaging: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal 2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucosio e 10 mM HEPES. Regolare il pH a 7,4. Assicurarsi che l'osmolarità sia 280-300 mOsm/kg e preparare ECS senza Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucosio, 10 mM HEPES e 0,1 mM EGTA.
- Preparare le soluzioni di prova: 100 μM di ATP disciolto in ECS, 1 μM Thg in ECS senza Ca2+ e 0,1 mg/mL di ALS IgG in ECS8.
- Trasferire un foglietto su un piatto con ECS per lavare il DMEM completo. Preparare la soluzione di caricamento del colorante diluendo 1 mM di soluzione madre di Fluo-4 AM con ECS fino alla concentrazione finale di 5 μM Fluo-4 AM.
- Posizionare il coprislip con le celle nella soluzione di caricamento del colorante per 30 minuti a RT al buio. Lavare le celle in ECS per 20 minuti.
- Se le celle non sono adeguatamente caricate (cioè se il livello basale di fluorescenza è troppo basso, <5% della gamma dinamica della telecamera con tempo di esposizione superiore a 400 ms), aumentare il tempo di caricamento fino a 45 minuti a 1 ora a 37 °C. In alternativa, miscelare la soluzione madre di Fluo-4 AM con un volume uguale di detergente al 20% (p/v) (Pluronico) in DMSO prima di diluire in ECS, ottenendo la concentrazione Pluronica finale ~0,02%.
NOTA: Gli esempi sperimentali di questo studio sono stati eseguiti con IgG umane isolate da sieri sanguigni di pazienti affetti da SLA come descritto in precedenza 4,5,11. Ogni esperimento è stato eseguito con campioni di IgG di un singolo paziente.
- Immagini video
NOTA: In questo protocollo, il sistema di imaging video è stato combinato con una lampada ad arco corto allo xeno, un sistema policromatore e un microscopio a epifluorescenza invertita dotato di acqua, glicerina e obiettivo ad immersione in olio. L'imaging timelapse è stato eseguito utilizzando un sistema di fotocamere digitali.- Accendere i componenti della configurazione di imaging 15 minuti prima dell'esperimento per consentire al sistema di raggiungere la temperatura di lavoro.
- Introdurre il coprislip nella camera di registrazione con 1 mL di soluzione di lavoro (ECS o ECS senza Ca2+).
- Per scegliere il protocollo di imaging corretto, aprire il software di imaging e nel pannello Acquisizione, scegliere le coppie di filtri per Fluo4-AM con una lunghezza d'onda di eccitazione a 480 nm, uno specchio dicroico a 505 nm e una lunghezza d'onda di emissione a 535 nm.
- Scegli il campo visivo avendo cura di avere un numero consistente di celle durante tutto l'esperimento. Regolare il tempo di esposizione e il guadagno del rilevatore in modo appropriato, in modo tale che il segnale non sia saturo. Scegliere la modalità pseudocolore per l'acquisizione. Per istruzioni più dettagliate, fare riferimento al manuale fornito dal produttore.
- Regolare la frequenza di campionamento su 1 Hz (1 fotogramma al secondo).
- Iniziare l'imaging acquisendo il livello basale di fluorescenza per 3-5 minuti per la determinazione basale (F0). Garantire un flusso costante della soluzione di lavoro.
- Arrestare il flusso della soluzione di lavoro e passare alla soluzione di prova per il periodo di tempo desiderato (vedere anche le barre temporali negli esempi della Figura 2 e della Figura 3). Tra una soluzione di prova e l'altra, lavare le celle con un flusso costante della soluzione di lavoro per 3-5 minuti.
- Mantenere il volume della soluzione nella camera di registrazione a ~1 mL organizzando un'aspirazione costante dalla parte superiore della soluzione (vedere Figura 2E).
NOTA: Per applicare il trattamento direttamente alle celle riprese, è stato posizionato un sistema di erogazione personalizzato costituito da una pipetta di vetro (diametro interno 0,8 mm) a ~350 μm di distanza e ~1 mm sopra le celle, con un angolo di 45° combinato con il sistema di scambio della soluzione contenente valvole a manicotto e un controller elettronico della valvola (vedere Figura 2E).
4. Analisi dei dati
- Definire un'area di interesse (ROI) corrispondente alla singola cella.
- Scegli il fotogramma con la più alta intensità di segnale (cioè dall'applicazione di ATP) e cerchia una cella utilizzando l'applicazione Polygonal Tool. Ripetere l'operazione per tutte le celle nel campo acquisito. Scegli cinque ROI in background utilizzando lo strumento Cerchio.
- Per misurare l'intensità media del segnale di una singola cella e lo sfondo per ogni intervallo di tempo, selezionare tutti i ROI e utilizzare il comando Multi Measure in ROI Manager in ImageJ o qualsiasi comando equivalente nel software commerciale (vedere la tabella dei materiali).
- Esporta i valori medi di intensità del segnale dei ROI come foglio di calcolo.
- Calcola la media di cinque ROI di sfondo e sottrai lo sfondo medio di ciascun fotogramma dall'intensità media del ROI del fotogramma acquisito contemporaneamente.
- Per normalizzare i dati ottenuti al segnale di base, utilizzare l'equazione (1):
ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
dove F è l'intensità del segnale di ogni intervallo di tempo dopo la sottrazione dello sfondo e F0 è la fluorescenza Fluo-4 di base.
NOTA: in questo studio è stato utilizzato un codice personalizzato. - Per analizzare l'attività del calcio, determinare diversi parametri4: l'ampiezza del picco del calcio (ΔF/F 0), la variazione integrata (integrale temporale, superficie sotto la registrazione della risposta) del transitorio di calcio (ΔF/F 0 × s), tempo trascorso dal momento al picco dall'inizio della stimolazione al massimo del transitorio di calcio (s), tempo di aumento trascorso dall'inizio della stimolazione al valore di ΔF/F 0 che raggiunge il 50%-80% dell'ampiezza massima (s), mezza larghezza-larghezza completa di un transitorio a metà ampiezza massima (s), frequenza delle risposte se sono ripetitive (Hz).
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Representative Results
Caratterizzazione di diversi tipi di cellule gliali in coltura
Di solito ci vogliono 15-21 giorni per produrre astrociti per gli esperimenti, mentre le cellule microgliali impiegano 10-15 giorni per crescere. L'immunocolorazione è stata eseguita per valutare la purezza cellulare della coltura. La Figura 1 mostra l'espressione della doppia marcatura del marcatore astrocitico GFAP e del marcatore microgliale Iba1 nelle rispettive colture.
L'imaging del calcio è noto per rivelare le differenze nella fisiologia cellulare degli astrociti sani e malati. In precedenza negli astrociti wild type, abbiamo dimostrato che le IgG di SLA influenzano il Ca2+ cellulare mobilizzando pool intra ed extracellulari nel citosol8. Il seguente protocollo ha determinato se ci fossero differenze tra i transitori di calcio in hSOD1G93A e gli astrociti in coltura non transgenici acutamente esposti a campioni di IgG SLA da pazienti. Gli astrociti caricati con Fluo4-AM sono stati perfusi con ECS per 3 minuti per ottenere una linea basale stabile. Successivamente, 100 μg / mL di ALS IgG sono stati applicati nel bagno per 5 minuti. Gli astrociti sono stati lavati con ECS e quindi 100 μM di ATP sono stati applicati alla fine di ogni registrazione per testare la salute di ciascuna cellula e osservare la risposta del calcio a uno stimolo standard.
Tracce rappresentative nella Figura 2A,B mostrano che gli astrociti hSOD1G93A rispondono alle IgG di SLA con una maggiore ampiezza del transitorio di calcio, un cambiamento integrato complessivo più ampio e un tempo di picco più breve rispetto agli astrociti non transgenici. Qui, tuttavia, si dovrebbe prestare attenzione nell'interpretare i dati quantitativi quando vengono utilizzate sonde Ca2+ a lunghezza d'onda singola come Fluo4-AM (vedere la sezione di discussione). Inoltre, la forma della risposta alle IgG di SLA è distinguibile dalla risposta all'ATP (notare un transitorio più veloce con una maggiore ampiezza nelle tracce e sincronicità cellulare nelle immagini pseudocolorate in risposta all'ATP, Figura 2A,B).
Con l'obiettivo di studiare ulteriormente l'origine delle differenze nella risposta del calcio alla SLA IgG e ATP tra hSOD1G93A e astrociti non transgenici, abbiamo utilizzato un approccio farmacologico per manipolare le riserve interne di Ca 2+ durante l'imaging del calcio utilizzando 1 μM Thg. Thg è un inibitore non selettivo del reticolo endoplasmatico Ca2+ ATPasi (SERCA), esaurire le riserve intracellulari di Ca2+ quasi immediatamente, che si riflette in un transitorio di calcio che dura per diversi minuti. Per escludere l'effetto di Ca2+ esterno nei fenomeni osservati, durante l'esperimento è stato utilizzato ECS privato di Ca2+. Dopo aver registrato il livello basale della fluorescenza per 3 minuti, 1 μM Thg è stato applicato nel bagno per 2 minuti. Dopo la deplezione di calcio indotta da Thg, gli astrociti sono stati perfusi con ECS contenente Ca2+ per indurre e monitorare il riempimento delle scorte. Tracce rappresentative dell'esperimento descritto sono mostrate nella Figura 2C,D. Come previsto, gli astrociti hSOD1G93A avevano un livello più alto di Ca2+ nei depositi, come rivelato dall'esaurimento delle scorte, indicando un sovraccarico di questo ione. Un meccanismo simile è stato dimostrato in astrociti in coltura da topi transgenici SOD1G93A 36.
Imaging del calcio delle cellule microgliali in coltura
L'imaging timelapse della microglia marcata con Fluo-4 AM è stato eseguito nello stesso modo descritto per gli astrociti (Figura 3B). Le cellule microgliali sono state perfuse con ECS con 2 mM Ca2+ per 3 minuti per ottenere una linea di base stabile, seguita dall'applicazione in bagno di 100 μg / mL di IgG ALS per 5 minuti, lavaggio con ECS e stimolazione con ATP 100 μM. È interessante notare che, mentre gli astrociti rispondono prontamente alle IgG della SLA, la stragrande maggioranza delle cellule microgliali non ha risposto alle IgG della SLA (come illustrato da una sola cellula microgliale che reagisce con un transitorio di calcio; traccia rossa nell'esempio della Figura 3A). Tuttavia, hanno sempre risposto all'ATP e in modo simile agli astrociti (Figura 3A). Si noti anche un caso di transitoria spontanea di Ca2+ nella traccia cellulare 2 (Figura 3A) che non deve essere confusa con una risposta indotta.
Figura 1: Astrociti e microglia in una coltura primaria. Immagini confocali rappresentative di astrociti (a sinistra) in coltura marcata utilizzando GFAP (rosso) e microglia (destra) in una coltura colorata con Iba1 (verde). La doppia etichettatura (GFAP/Iba1) è stata utilizzata per indicare la purezza della coltura. DAPI è stato utilizzato per etichettare i nuclei (blu). Barre della scala = 50 μm. Abbreviazioni: GFAP = proteina acida fibrillare gliale; LBA1 = molecola adattatore legante il calcio ionizzato 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Un esempio di applicazione dell'imaging del calcio in uno studio di fisiopatologia degli astrociti. (A) Un esempio rappresentativo di un esperimento di imaging del calcio in cui gli astrociti hSOD1G93A sono stati ripresi per 5 minuti per raccogliere la fluorescenza basale ("basale"), seguita da un'applicazione acuta di IgG di SLA (0,1 mg/ml) per 5 minuti ("risposta alle IgG di SLA") e da un trattamento con 100 μM di ATP ("risposta all'ATP"). Il pannello superiore mostra immagini pseudocolorate (l'intensità della fluorescenza è codificata a colori, dove il nero corrisponde a un'intensità molto bassa, mentre il bianco segna i pixel con la massima intensità; la relazione colore-intensità è rappresentata in una barra di colore a destra nel pannello superiore di B che corrisponde all'intensità di fluorescenza di una singola cellula in ciascuno dei segmenti dell'esperimento ("linea di base", «risposta alle IgG di SLA» e «risposta all'ATP»). Le linee tratteggiate grigie indicano le immagini pseudocolorate di punti temporali specifici per la traccia di calcio rappresentativa (in arancione). La scatola grigia al centro della traccia di calcio segna l'applicazione di 5 minuti di ALS IgG. La barra nera sotto la traccia di calcio segna l'applicazione di ATP. (B) Come in (A) ad eccezione degli astrociti non transgenici (traccia in blu). (C) Una traccia rappresentativa di calcio (arancione) nell'astrocita hSOD1G93A sfidata con 1 μg/mL di tapsigargina (barra nera sotto la traccia) in ECS senza calcio, seguita dall'aggiunta di 2 mM Ca 2+ ('2 mM Ca2+', barra nera sotto la traccia). (D) Come in (C) tranne che per l'astrocita non transgenico (la traccia è in blu). Scala di ampiezza = 100% ΔF/F0. Scala temporale = 200 s. Barre della scala = 50 μm. (E) Schema della configurazione sperimentale che illustra la modalità personalizzata di scambio della soluzione e il posizionamento della pipetta per l'applicazione dell'agente biochimico. Abbreviazioni: SLA = sclerosi laterale amiotrofica; IgG = immunoglobuline G; Thg = thapsigargin. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Un esempio di imaging del calcio di microglia coltivata. (A) A sinistra: immagine in campo chiaro della microglia coltivata. Poiché è difficile ottenere una coltura microgliale pura, qui sono presenti anche astrociti (cellule poligonali piatte più grandi, vedi esempio indicato dalla punta di freccia). Sia la microglia ramificata (piccolo soma, processi prominenti) che quella ameboide (indicate rispettivamente con caselle verdi e gialle) sono presenti nella coltura. Al centro: caselle gialle e ciano ingrandite da sinistra. Le linee rosse, blu e viola segnano i ROI da cui viene estratta l'intensità media della fluorescenza nel tempo. A destra: tracce di calcio di tre cellule nel pannello centrale. Il colore della traccia corrisponde al colore dei ROI nel pannello centrale. Dopo aver illustrato la fluorescenza del calcio al basale ("fluorescenza basale") per 200 s, le cellule sono state esposte a un'applicazione acuta di IgG di SLA (0,1 mg/ml) per 5 minuti ("risposta alle IgG di SLA"), seguita da 100 μM di ATP ("risposta all'ATP"). La scatola grigia al centro della traccia di calcio segna l'applicazione di 5 minuti di ALS IgG. La barra nera sotto la traccia di calcio segna l'applicazione di ATP. Si noti che solo la cellula 1 (traccia rossa) che rappresenta una grande minoranza di cellule, ha risposto alla SLA IgG, mentre tutte le cellule hanno risposto all'ATP. (B) Le immagini pseudocolorate rappresentano l'intensità della fluorescenza in ciascuno dei segmenti delle registrazioni ("linea di base", "risposta alla SLA IgG" e "risposta all'ATP") dove le linee tratteggiate arancioni indicano i punti temporali specifici nelle tracce rappresentative del calcio (A, pannello di destra). Le scatole verdi e arancioni segnano la microglia ameboide (come in A). La relazione colore-intensità è rappresentata in una barra dei colori sulla destra. Scala di ampiezza = 100% ΔF/F0. Scala temporale = 100 s. Barre della scala = 50 μm. Abbreviazioni: SLA = sclerosi laterale amiotrofica; IgG = immunoglobuline G; ROI = regione di interesse. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo articolo presenta il metodo di coltura cellulare primaria come uno strumento veloce e "economico" per studiare diversi aspetti della fisiologia cellulare (pato) come la SLA nel modello di ratto hSOD1G93A . La tecnica è quindi adatta per studi a livello di singola cellula che possono essere estrapolati e ulteriormente studiati a un livello superiore di organizzazione (cioè in fette di tessuto o in un animale vivo). La coltura cellulare come tecnica, tuttavia, ha alcuni avvertimenti. È fondamentale eseguire l'isolamento del tessuto cerebrale e la dissociazione delle cellule sul ghiaccio e eseguire queste e successive fasi di isolamento e preparazione nel più breve tempo possibile. La contaminazione è un ostacolo sempre presente che può essere superato utilizzando apparecchiature ben sterilizzate e prestando particolare attenzione nell'eseguire la dissociazione dei tessuti nella cappa laminare37. È anche fondamentale seminare la corretta densità delle cellule. Se il numero di cellule seminate è inferiore al numero desiderato, questo non supporterà la crescita e la propagazione delle cellule nel piatto. Tuttavia, se le cellule sono troppo dense, ci sarà competizione tra loro per i nutrienti nel mezzo di crescita e, quindi, più morte cellulare. Questo è il motivo per cui è consigliabile contare le cellule dissociate prima della semina, almeno prima di acquisire una certa esperienza riguardo alla corretta relazione tra il tessuto di partenza e il volume di dissociazione.
GFAP è un marcatore astrocitario ampiamente utilizzato ed è spesso usato per valutare la purezza della coltura cellulare38,39. Tuttavia, solo GFAP non è sufficiente quando si studia la reattività degli astrociti. Si consiglia di combinarlo con un marcatore di proliferazione come Ki67 o altri marcatori astrocitari (glutammina sintetasi, aldolasi-C o aldeide deidrogenasi-1)18,38. Sebbene queste tecniche tendano a produrre colture di cellule gliali pure, è necessario prestare attenzione nel valutare la purezza delle cellule di coltura. Ciò è di particolare importanza per le colture cellulari microgliali che di solito contengono alcuni precursori degli oligodendrociti o astrociti34. I marcatori specifici per le cellule microgliali attirano molto interesse. Il marcatore più utilizzato è Iba1, ma altri marcatori spesso usati, come i recettori di differenziazione (CD68, CD45) e il recettore della fractalkina (CX3CR1), possono essere rilevati anche in altre cellule (per maggiori dettagli, vedere40). Attualmente, i marcatori più specifici per la microglia sono TMEM119 e il recettore purinergico P2Y1241, anche se un recente articolo ha sollevato preoccupazioni riguardo alla specificità TMEM11942.
L'introduzione dell'imaging timelapse delle cellule vive offre il vantaggio di monitorare i processi cellulari, come la segnalazione Ca2+, in tempo reale. Inoltre, la modulazione del comportamento cellulare mediante l'applicazione di diversi agenti chimici (ad esempio, Thg qui) fornisce ulteriori informazioni per la descrizione dei percorsi e dei messaggeri di segnale attivati in una cellula sana o in un modello di malattia cellulare (isolato e coltivato qui dal ratto hSOD1G93A SLA). Quando si lavora con coloranti fluorescenti permeabili alla membrana cellulare come Fluo-4 AM, è fondamentale trovare la concentrazione e il tempo di incubazione corretti affinché il colorante riempia l'interno della cellula. Se ci vuole troppo tempo, l'assorbimento del colorante può essere aumentato mantenendo le cellule in un incubatore a 37 ° C. Nei casi più gravi, nella soluzione di carico può essere utilizzato un detergente delicato (ad esempio, Pluronic F-127). Inoltre, non è consigliabile ottenere quanto sopra aumentando la concentrazione del colorante oltre 10 μM. Infatti, a concentrazioni più elevate, il colorante può agire come tampone Ca 2+ e smorzare l'ampiezza del segnale Ca2+.
Vale anche la pena ricordare che oltre al Fluo-4 e coloranti simili a lunghezza d'onda singola, esistono coloranti raziometrici sensibili al Ca 2+ (ad esempio, Fura-2) che emettono a una misura e a una lunghezza d'onda di riferimento insensibile a Ca2+. Tali misurazioni sono quindi insensibili alla distorsione causata dalla distribuzione irregolare del colorante nella cellula e ai cambiamenti nel percorso ottico. Tuttavia, l'uso di coloranti a lunghezza d'onda singola, specialmente con indicatori ad alta affinità come Fluo-4, è consigliabile nei casi in cui le misurazioni relative sono fatte all'interno dello stesso campione, o dove si segue principalmente la dinamica del processo e non le reali variazioni di concentrazione di Ca2+ 43. Tuttavia, queste misurazioni non possono essere utilizzate per i dati quantitativi in termini di concentrazione di Ca2+ ed è necessaria cautela quando si interpretano le ampiezze dai dati presentati nella Figura 2.
Abbiamo dimostrato qui come l'uso di questa funzione di imaging su cellule viventi - astrociti in coltura - possa rivelare sottili meccanismi intracellulari di fisiopatologia come il rifornimento di riserve di Ca 2+ e l'ingresso di Ca2+ gestito dal negozio, che sono disturbati nel modello SLA, in accordo con i risultati precedenti sulle cellule murine36. Questo potrebbe quindi spiegare una maggiore sensibilità degli astrociti hSOD1G93A alle IgG di SLA, come suggerito qui, che potrebbe potenziare la progressione della patologia. Per confrontare le misurazioni in tali esperimenti, è consigliabile avere una densità cellulare simile nel campo visivo e che gli stessi compartimenti cellulari siano presi per i ROI (ad esempio, soma vs processi).
Un esempio è stato mostrato qui che le cellule microgliali non hanno risposto alla SLA IgG con lo stesso vigore degli astrociti. Ciò è in linea con la scoperta della scarsa generazione di perossido nella linea cellulare microgliale durante il trattamento con SLA IgG15. Nel complesso, questo approccio indica una risposta cellula-specifica alle IgG correlate alla SLA, anch'essa un fatto importante realizzato attraverso l'uso di colture cellulari pure di microglia rispetto all'astroglia. L'utilizzo delle cellule gliali dai modelli di neurofisiopatologia o derivate dalle cellule staminali pluripotenti inducibili dei pazienti ha il futuro del biomarking fisiologico in gravi malattie neurali come la SLA. Sarebbe quindi essenziale comprendere la segnalazione fine Ca2+ come l'impronta digitale del particolare stato della malattia o distinguere tra diverse malattie eccitotossiche. A tal fine, è necessario sviluppare una procedura di apprendimento automatico e classificare le registrazioni dei dati. Inoltre, queste cellule possono essere coltivate in coltura e seminate in un dispositivo microfluidico per essere utilizzate per la diagnosi o per la stratificazione del paziente di malattie neurodegenerative mediante l'evocazione di una risposta a diversi fattori umorali di neuroinfiammazione (ad esempio, sieri, IgG, CSF).
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e dello Sviluppo Tecnologico Repubblica di Serbia Contratto n. 451-03-9/2021-14/ 200178, dal progetto FENS - NENS Education and Training Cluster "Corso Trilaterale sulla Glia nella Neuroinfiammazione" e dalla sovvenzione EC H2020 MSCA RISE #778405. Ringraziamo Marija Adžić e Mina Perić per aver fornito le immagini di immunoistochimica e Danijela Bataveljić per l'aiuto nella scrittura di articoli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tube | Sarstedt, Germany | 62 554 502 | |
| 2 mL tube | Sarstedt, Germany | 72.691 | |
| 21 G needle | Nipro, Japan | HN-2138-ET | |
| 23 G needle | Nipro, Japan | HN-2338-ET | |
| 5 mL syringe | Nipro, Japan | SY3-5SC-EC | |
| 6 mm circular glass coverslip | Menzel Glasser, Germany | 630-2113 | |
| 60 mm Petri dish | ThermoFisher Sientific, USA | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, Germany | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss, Germany | ||
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, Germany | B6917 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 2110 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, Germany | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich, Germany | D5648 | |
| Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21447 | |
| Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibody | Invitrogen, USA | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, Germany | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, Germany | E4378 | |
| ”evolve”-EM 512 Digital Camera System | Photometrics, USA | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific, USA | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | Open source under the GNU General Public Licence | ||
| FITC filter set | Chroma Technology Inc., USA | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes, USA | F14201 | |
| Goat anti-Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals, USA | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest, France | P5455 | |
| HighSpeed Solution Exchange System | ALA Scientific Instruments, USA | ||
| Incubator | Memmert GmbH + Co. KG, Germany | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | M2393 | |
| Matlab software | Math Works, USA | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore, USA | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich, Germany | 324590 | |
| Normal donkey serum | Sigma-Aldrich, Germany | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, Germany | 158127 | |
| Penicilin and Streptomycin | ThermoFisher Sientific, USA | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich, Germany | P5899 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | P5405 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Carlo Erba Reagents, Spain | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies, USA | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Germany | S3817 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S5886 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich, Germany | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience, UK | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich, Germany | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich, Germany | T4799 | |
| Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520 | Wescor, ELITechGroup Inc., USA | ||
| ViiFluor Imaging System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| VisiView high performance setup | Visitron System Gmbh, Germany | ||
| Xenon Short Arc lamp | Ushio, Japan |
References
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