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Bioengineering

Inactivation d’agents pathogènes par photolyse en lumière visible de la riboflavine-5′-phosphate

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour inactiver les bactéries pathogènes avec des espèces réactives de l’oxygène produites lors de la photolyse de flavine mononucléotide (FMN) sous irradiation en lumière bleue et violette de faible intensité. La photolyse FMN s’est avérée être une méthode simple et sûre pour les processus sanitaires.

Abstract

Riboflavine-5'-phosphate (ou flavine mononucléotide; FMN) est sensible à la lumière visible. Divers composés, y compris les espèces réactives de l’oxygène (ROS), peuvent être générés par photolyse FMN lors de l’irradiation avec la lumière visible. Les ROS générés par la photolyse FMN sont nocifs pour les micro-organismes, y compris les bactéries pathogènes telles que Staphylococcus aureus (S. aureus). Cet article présente un protocole de désactivation de S. aureus, à titre d’exemple, par des réactions photochimiques impliquant du FMN sous irradiation en lumière visible. L’anion radical superoxyde () généré lors de la photolyse FMN est évalué par réduction du tétrazolium bleu nitro (Equation 1NBT). La viabilité microbienne de S. aureus attribuée aux espèces réactives Equation 1 a été utilisée pour déterminer l’efficacité du processus. Le taux d’inactivation bactérienne est proportionnel à la concentration de FMN. La lumière violette est plus efficace pour inactiver S. aureus que l’irradiation par lumière bleue, tandis que la lumière rouge ou verte ne conduit pas la photolyse FMN. Le présent article démontre que la photolyse FMN est une méthode simple et sûre pour les processus sanitaires.

Introduction

La riboflavine-5′-phosphate (FMN) est formée par phosphorylation à la position riboflavine 5′ de la chaîne latérale ribityle et est requise par toutes les flavoprotéines pour que de nombreux processus cellulaires génèrent de l’énergie. Il joue également le rôle de vitamine pour certaines fonctions dans le corps humain1. La FMN est environ 200 fois plus soluble dans l’eau que la riboflavine2.

L’inactivation photodynamique antibactérienne (aPDI) des bactéries est un moyen efficace de contrôler la résistance aux bactéries 3,4 car elle ne dépend pas du mode de résistance bactérienne. Cliniquement, l’aPDI est utilisé pour traiter les infections des tissus mous afin de diminuer l’infection de la peau nosocomiale due aux bactéries multirésistantes 5,6,7,8,9. aPDI produit également la mort cellulaire en générant des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les ROS, tels que les radicaux superoxydes (), l’oxygène singulet, les radicaux hydroxyles (Equation 1•OH) et les radicaux peroxyles, sont des radicaux libres ou des molécules qui contiennent de l’oxygène réactif 10,11,12 et sont normalement réactifs 13. Semblable aux dommages à l’ADN causés par les ROS, la peroxydation membranaire et la destruction des cellules endothéliales sont également des réactions biochimiques indésirables attribuées aux ROS dans les cellules12.

L’utilisation de l’aPDI pour les bactéries pathogènes implique une source de lumière visible ou UV pour inactiver les microorganismes en présence de composés chimiques, tels que le chlorure de méthylthioninium 14, le conjuguéPEI-c e6 15, la porphyrine 16, le dioxyde de titane 17, le bleu de toluidine O 18 et les nanoparticules d’oxyde de zinc 19. Le bleu de toluidine O et le bleu de méthylène sont des colorants phénothiazinium et le bleu de méthylène a des propriétés toxiques. Les nanoparticules d’oxyde de zinc et l’irradiation UV sont liées à des effets néfastes sur la santé et l’environnement. En tant que telle, l’exploitation d’un photosensibilisateur fiable, sécurisé et simple par photolyse sous irradiation visible mérite une étude plus approfondie.

Le micronutriment, la riboflavine ou FMN, n’est pas toxique et est effectivement utilisé pour la fabrication ou l’alimentation des aliments20. La FMN et la riboflavine sont très sensibles à l’irradiation lumineuse2. Sous UV 1,2,21,22,23 et irradiation en lumière bleue 10,24, ces deux composés atteignent un état excité. La riboflavine ou FMN activée qui est produite par photolyse est promue à son état triplet et les ROS sont générés simultanément 2,25. Kumar et coll. ont signalé que la riboflavine activée par la lumière UV provoque sélectivement des lésions accrues de la fraction guanine de l’ADN dans les microorganismes pathogènes26. Sous irradiation par la lumière UV, il est démontré que la riboflavine activée par photodynamique favorise la génération de 8-OH-dG, qui est un biomarqueur du stress oxydatif, dans l’ADN double brin27. Il est rapporté que S. aureus et E. coli sont désactivés par ROS pendant la riboflavine ou la photolyse FMN10,24,28. Une étude antérieure des auteurs a montré que les réactions photolytiques impliquant la riboflavine et la FMN réduisent le cristal violet, un colorant triarylméthane et un agent antibactérien qui génère Equation 1et élimine la majeure partie de la capacité antimicrobienne du cristal28. Lorsque la flavine adénine dinucléotide ou FMN est irradiée par la lumière bleue, les ROS résultants produisent une apoptose dans les cellules HeLa pour leur empoisonnement in vitro29. En utilisant un traitement photochimique en présence de riboflavine, Cui et al. lymphocytes inactivés en inhibant leur prolifération et la production de cytokines30.

La photolyse de la riboflavine est utilisée pour l’inactivation de l’agent pathogène du sang par UV 10,24, mais les composants sanguins peuvent être altérés sous irradiation à la lumière UV30. Il est également rapporté que les plaquettes exposées aux UV améliorent progressivement la performance des marqueurs d’activation P-sélectine et LIMP-CD63 sur leurs membranes. La cytotoxicité des UV et de l’irradiation à haute intensité doit être étudiée et un photosensibilisateur simple et sûr lors d’une photoréaction FMN impliquant la lumière visible serait d’une grande utilité.

La lumière de longueurs d’onde plus courtes a plus d’énergie et est beaucoup plus susceptible de causer de graves dommages aux cellules. Cependant, en présence d’un photosensibilisant approprié, l’irradiation avec une lumière violette de faible intensité peut inhiber les micro-organismes pathogènes. La photosensibilisation et la génération de FMN lorsqu’ils sont irradiés avec de la lumière violette sont donc importantes à étudier, afin de déterminer la voie par laquelle les ROS de la photolyse FMN augmentent l’inactivation Equation 1 des bactéries.

Le contrôle antimicrobien est un problème courant et la mise au point de nouveaux antibiotiques prend souvent des décennies. Après irradiation à la lumière violette, la photoinactivation intermédiée par la FMN peut annihiler les bactéries pathogènes environnementales. Cette étude présente un protocole antimicrobien efficace in vitro utilisant la lumière violette pour conduire la photolyse FMN et ainsi générer Equation 1 pour une PDI. La viabilité microbienne de S. aureus est utilisée pour déterminer la faisabilité d’une IPa induite par la FMN.

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Protocol

1. Configuration du système de photolyse

  1. Monter six diodes électroluminescentes (DEL) (DC 12 V) à l’intérieur d’un gobelet en plastique opaque (8 cm x 7 cm) comme le montre la figure 1 pour établir un système de photolyse31.
  2. Ajouter des réactifs (voir ci-dessous) dans les tubes à essai en verre (13 mm de diamètre et 100 mm de hauteur) et fixer les tubes en haut de la coupelle comme indiqué à la figure 1. Placer l’installation expérimentale dans une pièce à température constante de 25 ± 3 °C.
  3. Surveiller et enregistrer la température des unités d’essai tout au long des réactions photolytiques à l’aide d’un thermomètre infrarouge.
    REMARQUE : La figure 2 montre les spectres d’émission pour les lumières bleue, verte, rouge et violette, tels qu’enregistrés à l’aide d’un spectromètre optique UV-Vis étalonné. Les longueurs d’onde correspondant à l’absorbance maximale pour les lumières LED bleues, vertes, rouges et violettes utilisées dans l’étude sont respectivement de 465, 529, 632 et 405 nm. Les puces LED peuvent chauffer l’appareil pendant les expériences d’irradiation. L’ensemble du système de photoréaction de chaque expérience a donc été placé dans une pièce où la température a été maintenue constante à 25 ± 3 °C.

2. L’effet de la longueur d’onde lumineuse sur la photolyse de FMN (Figure 3)

  1. Préparer une solution FMN 0,1 mM dans un tampon phosphate de potassium (PB) de 100 mM (pH 7,8). Exposer les échantillons FMN (3 mL chacun) à une lumière bleue, verte, rouge ou violette à une intensité de 10 W/m2 pendant 5 min. Conserver 3 mL de solution FMN dans l’obscurité comme témoin.
  2. Enregistrer l’absorbance des échantillons FMN irradiés dans la plage de 250 à 750 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV/visible.

3. Méthode de réduction du tétrazolium bleu nitro (NBT) à détecter Equation 1 (figure 4).

NOTE: La méthode de réduction NBT utilisée ici a été légèrement modifiée par rapport au test de photoréaction de la riboflavine. La méthode de réduction NBT est utilisée pour évaluer le niveau de Equation 1 généré par la photolyse FMN. Le FMN photochimiquement excité est d’abord réduit par la L-méthionine en une semiquinone, qui donne ensuite un électron à l’oxygène donnant naissance à Equation 131. Le tel que généré Equation 1 réduit NBT en formazan, qui a une absorbance caractéristique à 560 nm32.

  1. Ajouter 109,3 mg de L-méthionine à 73,3 mL de PB (100 mM; pH 7,8). Vortex la solution pour dissoudre la L-méthionine.
  2. Une fois la L-méthionine complètement dissoute, ajouter 10 mg de poudre NBT et 1,53 mL de 0,117 mM FMN à la solution. Pour chaque 1 mL de la solution réactionnelle (c.-à-d. un mélange de FMN, de L-méthionine et de NBT) appliqué, les concentrations finales de FMN, de méthionine et de NBT sont de 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M et 1,6 x 10-4 M, respectivement.
  3. Exposer la solution réactionnelle (1 mL) à une irradiation à la lumière LED bleue ou violette à 10 W/m2 pendant 1 à 5 min.
  4. Détecter les Equation 1 espèces (à partir de l’absorbance à 560 nm) produites par la réaction photochimique, qui réduit la NBT et produit du formazan.

4. Viabilité de S. aureus après photolyse FMN (figure 5)

  1. Transmettez une colonie de S. aureus (BCRC 10451) d’une plaque cultivée à 10 mL de bouillon de lysogénie prélevé dans un tube à essai à bouchon vissé de 15 mL. Culture dans un shaker à 37 °C pendant 16 h.
  2. Transférer 0,5 mL de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Ajouter de l’eau stérilisée dans le tube à centrifuger pour diluer la culture à une densité optique de 0,5 à 600 nm (OD600) (~6 x 107 UFC/mL).
  3. Transvaser 0,5 mL de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 mL, centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et décanter le surnageant pour obtenir une pastille cellulaire.
  4. Ajouter 1 mL de solution tamponnée FMN (30, 60 et 120 μM FMN en PB) aux pastilles cellulaires obtenues comme à l’étape 4.3, et vortex. Pour le contrôle irradié, ajouter 1 mL de PB seul.
  5. Transférer 1 mL chacune de solutions cellulaires bactériennes viables contenant 30 μM de FMN et de PB seuls dans des tubes de verre et les irradier avec une lumière violette à 10 W/m2 pendant 30 min.
  6. Transvaser 1 mL chacune de solutions cellulaires bactériennes viables contenant 30, 60 et 120 μM de FMN et de PB seuls dans des tubes de verre et les irradier avec de la lumière bleue à 20 W/m2 pendant 120 min. Mettre en place un autre tube de verre avec 1 mL de solution cellulaire bactérienne viable contenant 120 μM FMN et l’irradier avec de la lumière bleue à 20 W/m2 pendant 60 min.
  7. Installer les tubes à essai comme décrit aux étapes 4.5 et 4.6 et les recouvrir de feuilles d’aluminium épaisses. Ces tubes servent de commandes sombres.
  8. Conserver la chambre d’irradiation (ainsi que les témoins sombres) dans une chambre froide à 9 ± 1 °C pendant la période d’irradiation de 30 à 120 minutes.
    REMARQUE: La chaleur dégagée par les lumières LED ne peut pas être ignorée car les puces LED placées à l’intérieur de la tasse peuvent chauffer le système de photoréaction pendant les expériences d’irradiation. Les expériences ont donc été menées dans une chambre froide maintenue à 9 ± 1 °C.
  9. Après irradiation, transférer 0,2 mL de chacune des solutions réactionnelles sur une plaque de gélose Luria (LA). Étaler les bactéries sur la plaque à l’aide d’une tige de verre en forme de L et incuber pendant une nuit à 37 °C.
  10. Calculer la numération sur plaque viable et les taux d’inactivation de S. aureus après une croissance nocturne.
    NOTE: Le taux d’inactivation de S. aureus est calculé comme le pourcentage de réduction, qui est égal à [1 -I / D] ×100%, où I et D désignent, respectivement, le nombre d’UFC dans l’échantillon irradié et le témoin foncé. Le pourcentage de réduction est défini comme une valeur négative du taux d’inactivation.

5. Détection de Equation 1chez S. aureus (figure 6) 

  1. Préparez les échantillons de S. aureus comme décrit à l’étape 4.
  2. Diluer la densité bactérienne des échantillons avec de l’eau stérilisée à une densité optique de 0,5 à 600 nm (DO600, ~6 x 106 UFC/mL). Transférer 0,5 mL de la culture dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et décanter le surnageant pour obtenir une pastille de cellule.
  3. Ajouter 0,1093 g de L-méthionine, 0,1 g de NBT et 25 mL de FMN (400, 240 ou 120 μM) à 75 mL de PB. Pour chaque 1 mL du réactif appliqué, les concentrations finales de FMN, de méthionine et de NBT sont de 100 (60 ou 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M et 1,2 x 10-3 M, respectivement.
  4. Ajouter 1 mL de chaque solution réactive (c.-à-d. avec des concentrations variables de FMN) aux pastilles de cellules obtenues comme à l’étape 5.2. Irradier les solutions par lumière violette à 10 W/m2 pendant 10 min.
  5. Centrifuger le mélange à 14 000 x g pendant 10 min et décanter le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour extraire le NBT réduit. Détecter les espèces produites Equation 1 à partir de l’absorbance à 560 nm.

6. Analyse statistique

  1. Exprimer les données sous forme de moyenne ±écart type (ET) de trois essais indépendants.
  2. Appliquer un test t homoscédastique à deux échantillons pour évaluer si deux mesures sont différentes. Les valeurs de p < 0,05 sont considérées comme statistiquement significatives.

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Representative Results

Effet de la longueur d’onde lumineuse sur FMN
Les spectres d’absorbance de 0,1 mM FMN irradiés à l’aide de LED bleues, vertes, rouges et violettes sont illustrés à la figure 3. Il y a deux pics pour FMN (372 nm et 444 nm) pour le contrôle de l’obscurité. La lumière verte et la lumière rouge n’ont aucun effet car les changements dans les spectres sont insignifiants. D’autre part, l’absorbance respective de FMN à 444 nm est réduite d’environ 19% et 34%, respectivement, après irradiation en lumière bleue et violette à 10 W/m2 pendant 5 min, ce qui suggère que l’irradiation avec la lumière bleue/violette augmente la photolyse FMN.

Détection de Equation 10 de FMN irradié à l’aide d’une lumière bleue ou violette
La réduction NBT a été utilisée pour déterminer la formation de Equation 132. FMN est très sensible à la lumière visible et UV, même pendant de courtes périodes de rayonnement. Equation 1 est formé à partir des réactions photochimiques intermédiaires lors de la photolyse de la FMN. La figure 4 montre que l’effet photochimique du FMN sur la réduction du NBT dépend du temps d’irradiation, tel qu’il se forme à partir du FMN exposé à une irradiation à la lumière bleue ou violette d’une Equation 1 manière dépendante du temps. L’effet photolytique moyen de la lumière bleue et de la lumière violette est cependant similaire, comme le montre la figure 4.

Effet de la photolyse FMN sur la viabilité de S. aureus
L’effet de l’exposition au FMN à l’irradiation à la lumière violette ou bleue sur la viabilité de S. aureus a été déterminé. La photolyse FMN par irradiation à la lumière bleue ou violette entraîne une inactivation significative de S. aureus. Plus la concentration de FMN est élevée, plus le taux d’inactivation de S. aureus exposé à une irradiation à la lumière bleue à 20 W/m2 pendant 120 min est élevé, comme le montre la figure 5A. Des taux d’inactivation de 26 %, 39 %, 43 % et 97 % ont été atteints pour S. aureus en utilisant 0, 30, 60 et 120 μM FMN, respectivement, sous 20 W/m2 d’irradiation à la lumière bleue pendant 120 min. Comme le montre la figure 5A, il n’y a pas de différence significative (valeur p = 0,20) dans le taux d’inactivation de S. aureus par irradiation à la lumière bleue avec 60 μM FMN à 20 W/m 2 pendant 120 min (dose d’énergie, 14,4 J/cm2) ou 120 μM FMN à 20 W/m2 pendant 60 min (dose d’énergie, 7,2 J/cm2). D’autre part, comme le montre la figure 5B, des taux d’inactivation de 53 % et 96 % ont été atteints pour S. aureus sans et avec 30 μM FMN, respectivement, sous irradiation en lumière violette à 10 W/m2 pendant 30 min (dose énergétique de 1,8 J/cm2). Par conséquent, la FMN exposée à l’irradiation en lumière bleue ou violette a un effet plus important sur la viabilité de S. aureus en augmentant l’inactivation bactérienne. La FMN traitée par irradiation à la lumière violette est plus efficace dans l’inactivation de S. aureus.

Détection de Equation 10 chez S. aureus traité par FMN sous irradiation à la lumière violette
La production de S. aureus traité au FMN sous irradiation à la lumière violette a été déterminée à l’aide de la méthode de Equation 1 réduction NBT. La valeur d’absorbance à 560 nm a été utilisée pour évaluer l’étendue de Equation 1 la production. L’effet photochimique du FMN sur Equation 1 la production chez S. aureus est proportionnel à la concentration de FMN (figure 6). Les valeurs d’absorbance de 560 nm pour S. aureus sans traitement FMN sont respectivement de 0,31 et 0,07 sous 10 W/m2 d’irradiation à la lumière violette pendant 10 min et dans l’obscurité (figure 6). Cela suggère que peu de choses Equation 1 ont été produites chez S. aureus non traité après irradiation à la lumière violette. Les valeurs d’absorbance respectives de 560 nm pour S. aureus traité avec 100 μM FMN sont de 1,36 et 0,08 sous 10 W/m2 d’irradiation à la lumière violette pendant 10 min et dans l’obscurité, respectivement. Par conséquent, l’effet photochimique sur la réduction NBT chez S. aureus traité au FMN augmente sous irradiation violette, car il Equation 1 est produit en abondance.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique du système de photoréaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les spectres d’émission des lumières LED bleues, vertes, rouges et violettes dans cette étude. Les maxima d’émission pour les lumières bleue, verte, rouge et violette sont respectivement de 465, 529, 632 et 405 nm, et les largeurs spectrales à mi-hauteur (W1/2) sont de 26, 31, 14 et 12 nm, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Spectres d’absorbance de FMN traités avec des LED de différentes longueurs d’onde à 10 W/m2 pendant 5 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Réduction de la NBT pour déterminer l’effet de l’irradiation de la lumière bleue et violette à 10 W/m2 pendant 1 à 5 min sur la photolyse FMN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Effet de la photolyse FMN sur la viabilité de S. aureus. Le pourcentage de réduction est défini comme une valeur négative du taux d’inactivation pour S. aureus traité avec (A) FMN sous irradiation à la lumière bleue à 20 W/m2 pendant 120 min et (B) FMN sous irradiation à lumière violette à 10 W/m2 pendant 30 min. Les concentrations de FMN et les temps d’irradiation sont indiqués en haut de la figure. Il est à noter qu’il n’y a pas de différence significative (p = 0,20) dans le taux d’inactivation de S. aureus en utilisant 60 μM FMN à 20 W/m 2 irradiation en lumière bleue pendant 120 min ou 120 μM FMN à 20 W/m2 irradiation en lumière bleue pendant 60 min (A). Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± écart-type, où n = 3. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Effet de la concentration de FMN sur Equation 10 la production chez S. aureus soumise à une irradiation à la lumière violette à 10 W/m2 pendant 10 min. Dans l’ensemble, peu Equation 1 de choses sont produites chez S. aureus en l’absence de FMN, bien que l’irradiation à la lumière violette augmente Equation 1 légèrement dans l’échantillon irradié (PB (lumière violette)) par rapport au témoin à l’obscurité (PB (foncé)). Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± écart-type, où n = 3. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Un photosensibilisant augmente la réaction photochimique des composés chimiques pour générer des ROS. Les microorganismes pathogènes peuvent être inactivés par irradiation lumineuse en présence de photosensibilisants. Cette étude détermine l’aPDI de S. aureus due aux ROS générés par l’irradiation en lumière violette d’un photosensibilisateur exogène, FMN.

Comme le montre la figure 3, pour la FMN, l’absorbance à 444 nm est réduite de manière significative après 5 min d’irradiation à l’aide de la lumière violette ou bleue et il n’y a pas de changement significatif de l’absorbance FMN sous irradiation avec lumière verte ou rouge. La réduction NBT est utilisée pour déterminer la formation de via un processus de transfert de Equation 1 charge10,33. Une étude antérieure des auteurs a utilisé FMN sous irradiation à la lumière bleue, verte ou rouge pour déterminer la formation de l’utilisation de la réduction NBTEquation 1. L’irradiation de la lumière bleue produit une énorme quantité de alors que l’efficacité photolytique de la lumière verte et rouge est inférieure à 3% de Equation 1 celle obtenue par la lumière bleue10. Ces résultats montrent qu’un processus de transfert de charge est produit lorsque le FMN est exposé à une irradiation à la lumière bleue ou violette et qu’il n’y a pas de changement significatif lors de l’irradiation par lumière verte ou rouge.

Une étude antérieure des auteurs34 a montré que le mécanisme de la photolyse FMN peut être décrit avec des réactions photolytiques FMN primaires (Équation 1):

Equation 2 (1),

où 1FMN* et 3FMN* sont respectivement les états singulet et triplet du FMN excité. Les mécanismes de réaction photolytique de ces FMN photoinduites sont peut-être initiés par une annihilation triplet-triplet ou un processus d’extinction à l’état triplet-fondamental35,36,37,38. L’état fondamental de FMN (FMN0) est un donneur d’électrons qui fournit un électron à 3FMN* et génère les formes semi-réduites (FMN•-) et semi-oxydées (FMN•+), comme le montre l’équation 2

Equation 3 (2)

Les voies de photodégradation de la FMN résultent de la photosensibilisation. FMN est promu à l’état électroniquement excité, FMN•, via une réaction photolytique, puis un FMN neutre est réduit lorsque FMN• perd un électron, comme le montrent les équations 3-8 ci-dessous:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

où FMN•+ est une espèce de cation radicalaire.

L’interaction de FMN•- avecO2 (3Σg-) produit le radical superoxyde réactif, suivi du radical hydroperoxyle, HOO•, Equation 1qui est généré dans la réaction entre Equation 1 et un proton et conduit finalement à la dégradation de FMN0:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

où FMN•- est un anion radical.

Dans la présente étude, en l’absence de FMN, le taux d’inactivation dans le cas de S. aureus est de 53 % sous irradiation en lumière violette à 10 W/m2 pendant 30 min et de 26 % sous irradiation en lumière bleue à 20 W/m2 pendant 120 min, ce qui suggère que l’irradiation par la lumière bleue désactive moins de bactéries que la lumière violette (figure 5). Il a été rapporté précédemment que l’irradiation à des longueurs d’onde supérieures à 430 nm sans photosensibilisateur exogène n’inactive pas les cellules de S. aureus, bien que les porphyrines de S. aureus aient une absorbance maximale à 405 ± 5 nm et provoquent une inactivation bactérienne après irradiation39.

Une étude antérieure menée par les auteurs actuels a montré que E. coli et S. aureus sont désactivés par le clivage de l’ADN induit par la formation par photolyse de riboflavine ou FMN10,24,40. Les taux d’inactivation respectifs pour S. aureus sont respectivement de 97 % et 96 %, en utilisant 120 μM de FMN sous 20 W/m 2 d’irradiation en lumière bleue (dose énergétique de 14,4 J/cm2) pendant 120 min et 30 μM de FMN sous 10 W/m2 d’irradiation à la lumière violette (dose énergétique de 1,8 J/cm2) pendant 30 min (figure 5). Par conséquent, l’irradiation par la lumière violette est plus efficace pour désactiver S. aureus, car des doses de faible énergie de lumière violette peuvent désactiver S. aureus en présence de concentrations de FMN plus faibles et de périodes d’éclairage plus courtes par rapport à la lumière bleue. Bien que l’étendue de la photolyse FMN obtenue par la lumière violette soit plus élevée que celle de la lumière bleue (Figure 3), les effets photolytiques moyens de la FMN sur la réduction de la NBT sous irradiation en lumière bleue et violette sont similaires (Figure 4).

E. coli est une bactérie commune à Gram négatif. La riboflavine ou la photolyse FMN par irradiation à la lumière bleue inactive E. coli via ROS 10,24,41 avec un taux d’inactivation de 96% lors de l’utilisation de FMN 10,24. S. aureus, d’autre part, est une bactérie à Gram positif, qui est effectivement inactivée par photolyse FMN sous irradiation en lumière violette, comme démontré ici (Figure 5). Par conséquent, la réaction photolytique FMN sous irradiation en lumière bleue ou violette peut produire des ROS et inactiver les bactéries à Gram négatif et à Gram positif.

En l’absence de FMN, cependant, peu Equation 1 de produits sont produits chez S. aureus qui est exposé à l’irradiation à la lumière violette (figure 6); par conséquent, les photosensibilisateurs endogènes ne diminuent que légèrement la viabilité de S. aureus sous irradiation à la lumière violette, par rapport à l’effet en présence de photosensibilisateurs exogènes tels que le FMN. Dans les mêmes conditions, la FMN exposée à l’irradiation par lumière violette diminue la viabilité de S. aureus pour entraîner un taux d’inactivation de 96%, ce qui est beaucoup plus élevé que celui des photosensibilisateurs intracellulaires endogènes seuls. La production de Equation 1 S. aureus traité au FMN sous irradiation en lumière violette a considérablement augmenté, comme le montre la figure 6. Ces résultats montrent que la FMN lorsqu’elle est exposée à une irradiation à la lumière violette provoque un niveau élevé d’inactivation bactérienne.

FMN peut atteindre un état photo-excité lorsqu’il est irradié en utilisant UV 1,2,21,22,23, bleu 10,24 et violet 31; cependant, la cytotoxicité causée par le rayonnement UV et l’irradiation de courte longueur d’onde de haute intensité doit être prise en compte42. D’autre part, les radiations rouges et vertes avec des longueurs d’onde plus longues ne produisent pas de quantités significatives de ROS pendant la photolyse FMN10. Par conséquent, l’aPDI induite par ROS de S. aureus nécessite l’irradiation de FMN avec une lumière violette qui a une longueur d’onde intermédiaire. La largeur spectrale à mi-hauteur (W1/2) pour la lumière violette doit être étroite pour éviter tout chevauchement avec l’absorption UV et inhiber le risque dû au rayonnement UV31. Le micronutriment, FMN, est en tant que tel inoffensif, étant une vitamine essentielle pour le corps humain. À l’aide d’un photosensibilisateur approprié tel que le FMN, l’irradiation à la lumière violette à basse énergie peut supprimer les bactéries pathogènes, fournissant un moyen sûr et efficace du processus sanitaire. En plus de la réaction photolytique de la FMN sur S. aureus, d’autres questions méritent d’être étudiées plus avant, telles que la phototoxicité de la FMN sur les microbes, résultant du stress causé par , qui peut être étudiée à Equation 1 l’aide d’une technique de séquençage de l’ARN avec qPCR.

La photolyse FMN par irradiation à la lumière violette conduit à une oxydation photochimique par laquelle les ROS sont générés et améliore à son tour l’inactivation des bactéries pathogènes. L’utilisation de la lumière violette est considérée comme une étape critique de la photodécomposition FMN. La limite de la technique actuelle est que l’intervalle de longueur d’onde de la lumière violette doit être assez étroit pour éviter le risque dû à l’irradiation UV. La méthode actuelle a le potentiel pour de futures applications médicales, telles que le traitement des infections de la peau de surface ainsi que des tissus sous-cutanés profonds ou des muscles en insérant une fibre optique pour diriger la lumière violette vers les zones infectées. Le traitement photochimique à l’aide de FMN est donc un moyen sûr et simple d’assurer des pratiques d’hygiène efficaces.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs sont reconnaissants au Dr Tak-Wah Wong et à M. Zong-Jhe Hsieh pour leur soutien dans les expériences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

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Bioengineering numéro 182 FMN photolyse ROS S. aureus lumière violette
Inactivation d’agents pathogènes <em>par</em> photolyse en lumière visible de la riboflavine-5′-phosphate
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Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T. Y., Yuann, J. M. P., Chiu, C. M., Huang, S. T., Liang, J. Y. Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5′-Phosphate. J. Vis. Exp. (182), e63531, doi:10.3791/63531 (2022).

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