Summary
我们提出了一种使用宽带受激拉曼散射（SRS）显微镜获取化学图像的方案。基于与差分多通道锁相检测一起工作的SRS显微镜，该协议描述了样品制备，SRS设备的调整以及化学计量学以解开化学非均质样品的不同成分。
Abstract
受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种用于无标记化学成像的非线性光学技术。该分析工具通过直接询问薄样品的分子振动，高速提供化学图和高空间分辨率。在其标准实现中，SRS显微镜是窄带的，一次仅形成单个振动频率的图像。然而，这种方法不仅阻碍了SRS的化学特异性，而且还忽视了振动光谱中编码的大量信息。
宽带SRS可以克服这些限制，宽带SRS是一种能够并行提取图像每个像素的振动频谱的实现。这提供了高光谱数据，当与化学计量分析相结合时，可以最大限度地提高从标本中检索到的信息量。因此，宽带SRS提高了系统的化学特异性，允许定量测定样品中不同成分的浓度。在这里，我们报告了一种使用宽带SRS显微镜进行化学成像的方案，该协议基于自制的SRS显微镜，该显微镜具有定制的差分多通道锁相放大器检测功能。它讨论了样品制备，SRS设备的对准和化学计量分析。通过获取振动拉曼光谱，该协议说明了如何识别混合物中的不同化学物质，确定它们的相对浓度。
Introduction
拉曼显微镜是一种强大的成像技术，通过测量拉曼散射1（一种非弹性辐射过程，起源于响应入射光2，3的分子振动）来提供丰富的化学图谱。拉曼图的每个像素都包含一个光谱，该光谱携带有关样品化学成分和结构的直接信息，从而产生具有固有振动对比度的图像。迄今为止，拉曼显微镜是分子振动显微光谱研究的参考立场，因为没有其他成像技术可以产生具有高化学特异性和高空间分辨率的图像4。尽管拉曼散射具有出色的化学特异性，但其生成效率较低，需要延长像素停留时间或高功率激发，分别导致采集速率低且与敏感样品不兼容。
拉曼显微镜的这种单一缺陷导致研究人员应用相干拉曼散射5，6，7，8，9 作为显微镜的对比源。这是一种非线性光学过程，可将振动响应提高几个（最多七个）数量级，从而允许高速化学成像10，11，12，13。特别是，两种最常用的相干拉曼散射技术是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）14 和受激拉曼散射（SRS）15。与CARS相比，SRS表现出对谐振分子浓度的线性依赖性。它对非共振背景免疫，非线性效应与任何振动跃迁无关，但对分子振动16，17的拉曼光谱特征的洛伦兹形状特征具有扭曲性。因此，SRS显微镜产生真实的拉曼信息，允许直接进行定量图像分析。
SRS是一种三阶非线性光学工艺，可提供有关样品化学键的直接信息。它起源于两个光学场的时空叠加，一般在近红外光谱区域，即频率分别为10、11、18的泵和斯托克斯。这种叠加在泵-斯托克斯频率失谐Ω = ωpu-ω S处产生跳动。当Ω与分子振动ΩR相匹配时，分子产生共振，导致光场和分子之间的相干能量转移。结果，分子达到振动激发态。这个过程可以通过测量泵光子的湮灭（一种称为受激拉曼损失[SRL]的信号）或斯托克斯光子的伴随放大（这一过程称为受激拉曼增益[SRG]）来监测。SRG和SRL是位于强烈和波动背景（I）之上的小信号（ΔI）。由于SRS信号（ΔI/I）的典型值在10-6-10-4范围内，激光噪声很容易掩盖它。为了减轻激光噪声对信噪比（SNR）的不利影响，从而降低成像速度，SRS检测依赖于调制传输技术（例如，锁相放大器、谐振电路或箱式平均器），在高调制频率（>1 MHz）下，激光噪声达到其最小值15，19，20。
传统的SRS显微镜采用窄带（≈10 cm−1）泵浦和斯托克斯脉冲以单一振动频率产生化学图像，允许视频速率成像，像素停留时间低至≈100 ns21，22。然而，由于窄带SRS显微镜通过仅以几个振动频率顺序扫描样品来形成化学图谱，因此其信息有限23。具有一个或两个振动对比的SRS图像可能不足以区分具有重叠拉曼条带的化学物质，特别是在非均相系统中。因此，范式窄带SRS显微镜没有充分利用SRS的潜力，因为研究少量振动频率会阻碍其化学特异性，并忽略振动光谱中编码的大量信息。此外，以不同频率对样品进行顺序扫描会导致像素停留时间延长，从而触发光损伤并阻止连续图像之间的严格空间聚构，从而导致运动伪影。
与其窄带显微镜相反，宽带SRS显微镜在每次样品扫描10，12，24时检索每个像素的振动光谱。因此，宽带SRS提供高光谱成像，对不同的振动对比度进行严格的空间归聚，允许严格的数据分析。这不仅通过拉曼光谱揭示了样品的化学成分，还有助于确定它们的相对浓度。根据光谱的获取方式，宽带SRS显微镜分为高光谱SRS或多重SRS。在高光谱SRS中，按顺序采集样品每个扫描点的SRS频谱（即，通过扫描频率失谐Ω来检索），通过在连续的拉曼位移处将SRS信号堆叠在一起来构建SRS频谱。在多路复用SRS中，在几种振动模式下同时测量拉曼光谱。因此，多路复用SRS方法将调制窄带脉冲与宽带脉冲相结合，以驱动不同频率的SRS信号，并使用灵敏度与窄带SRS相当的多通道检测器来检测SRS频谱。
本文提出了一种使用多重SRS显微镜生成异质样品化学图谱的方案。该协议中采用的SRS显微镜的方案如图1所示，并在其他25，26，27处详细描述。简而言之，商用锁模Yb光纤激光器，产生以1040 nm为中心的140 fs脉冲，平均功率为10 W，重复频率为80 MHz，驱动宽带SRS显微镜。偏振分束器（PBS）将基本波束分成两个分支。为了产生窄带斯托克斯脉冲，将一个具有4 W基波束的分支发送到产生窄带（≈15 cm-1）光束的etalon，然后使用声光调制器（AOM）以1.6 MHz调制该光束。具有6 W基波束的剩余部分使用2.8毫米厚的摩擦酸锂（LBO）晶体进行频率倍增，切割以进行I型相位匹配（θ = 90°，φ = 13.8°）。由此产生的520 nm处产生的二次谐波传播到X折叠腔体以泵送光学参数振荡器（OPO），该器件使用3.0 mm厚的LBO晶体（I型相位匹配，θ = 90°，φ = 9.8°）作为有源介质，以在680-910 nm光谱区域内提供可调谐的宽带光辐射（图2）。这些宽带脉冲在SRS实验中充当泵浦，并传播到棱镜压缩机以预补偿显微镜物镜引起的色散效应。
在压缩阶段之后，λ/2波片与YVO4 双折射板相结合，产生两个正交极化复制品，其检测平面处的电子减法消除了宽带泵的噪声。二向色镜将泵和斯托克斯光束组合在一起，并将它们发送到正置显微镜。数值孔径（NA）为1.27的水浸物镜将光聚焦到样品上，而NA为1.4的油浸物镜则收集光。在检测阶段之前，短通滤波器（SPF）去除调制的斯托克斯，而以Littrow配置工作的衍射光栅分散传输的宽带泵。第二个PBS2 将泵浦复制品分开，一个透镜将它们聚焦到两个光电二极管阵列上。来自这些光电二极管阵列的信号被电子方式减去并发送到自制多通道锁相放大器（M-LIA）。然后，解调信号通过其中一个光电二极管阵列的直流（DC）读数归一化，从而产生SRL频谱。
作为一个示例性实验，我们对几种众所周知的拉曼散射体的混合物进行成像，每种散射体都具有独特的拉曼光谱。因此，该协议首先描述如何制备参考样品。当我们检测SRL时，我们将继续解释如何获得窄带斯托克斯脉冲并设置提供宽带（≈250 cm-1）泵浦脉冲的光源，即自制的OPO。该协议显示了光束的对准和优化，描述了关键参数，例如窄带斯托克斯和宽带泵浦的功率和光谱。该协议详细描述了宽带泵浦的光路，因为它需要特殊的光学元件。它还解释了如何找到泵浦斯托克斯脉冲之间的时空重叠，并展示了确定相对强度噪声（RIN）的实用方法，这反过来又有助于定义SRS实验的最佳调制频率。然后，我们解释检测链的工作原理和校准。最后，该协议显示了数据采集过程，化学计量学和图像处理管道。
Protocol
1. 样品制备
注意：该协议描述了化学非均相混合物的浓度图和特征SRS光谱的检索。
- 为了制备样品，从聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微珠的水悬浮液中提取2μL（参见 材料表），并将2μL级分倒入显微镜盖玻片上。
- 使用干净的移液器吸头，从聚苯乙烯（PS）微珠的水悬浮液中提取2μL，并将其与盖玻片上的PMMA悬浮液结合。使用移液器吸头，轻轻混合悬浮液，使其干燥24小时。
注意：重要的是要仔细匹配微珠悬浮液的浓度，以避免样品表面上出现不成比例的微珠。PS和PMMA磁珠的直径分别为10和6 μm。这些尺寸允许在不影响SRS生成效率的情况下展示显微镜的高空间分辨率。
- 使用干净的移液器吸头，从聚苯乙烯（PS）微珠的水悬浮液中提取2μL，并将其与盖玻片上的PMMA悬浮液结合。使用移液器吸头，轻轻混合悬浮液，使其干燥24小时。
- 在水干涸时会出现的平坦的白色珠子层上，加入20μL二甲基亚砜（DMSO），然后加入20μL纯橄榄油。
- 在第二个显微镜盖玻片的边缘涂抹指甲油。将盖玻片放在混合物上，指甲油朝下，施加足够的压力将其密封。让它干燥。
注： 图3 显示了通过这些步骤获得的示例性结果。如果密封得当，该样品应持续长达三个月。
2. 优化泵和斯托克斯梁
- 打开激光器，让它达到热平衡。将 GDD = -6，000 fs2 的负群延迟色散 （GDD） 应用于基波束。
注意：此 GDD 值对于成功驱动 OPO 至关重要，并且是此设置的最佳值，但在不同的系统中可能会有所不同。负GDD可以通过光栅对、棱镜压缩器或基于空间光调制器28的脉冲整形器引入。 - 使用偏振分光镜（PBS1）将基波激光器分成两个分支。要获得窄带斯托克斯脉冲，请将一个4 W的分支引导到一个etalon。稍微旋转etalon，直到获得一条狭窄的光谱线，并在脉冲光谱的峰值处居中（参见 图2中的红色曲线）。
注意：该etalon在1，040 nm处的有效精细度为29，自由光谱范围为29.8 nm。 - 要获得调制的斯托克斯脉冲，请将窄带光束发送到声光调制器。
注意：如图 4A所示，一阶衍射光束经历100%调制，而零阶光束仅50%。因此，优选采用一阶以避免用强烈的未调制光束照亮样品，这可能会在不产生任何SRS信号的情况下诱导样品光损伤。- 为了优化调制效率，请更改镜头f1 和f2 之间的距离（图4B）。用光电二极管测量调制光束，并用示波器记录其轮廓。
- 更改 f1 和 f2 之间的距离，直到幅度和示波器读数基线之间达到最大对比度。
注意：这对镜头不作为准直器工作，而是在AOM晶体处产生有效的焦点。 - 放置第三个透镜f3 以微调斯托克斯光束的腰部，从而改变显微镜焦平面处的相互作用体积，从而优化SRS信号。
注意：在此协议中，斯托克斯波束以1.6 MHz调制。
- 将基波束剩余的6 W光功率聚焦到摩擦酸锂（LBO）晶体（LBO1， θ = 90°，φ = 13.8°）上，通过产生二次谐波（SHG）使基波束变频两倍（图5A）。
- 为了最大限度地提高SHG效率，请稍微旋转晶体，改变φ角度（图5B）。优化 LBO1 以获得至少 2.5 W 的 SHG。
- 调整LBO2 的φ角度，最大限度地提高信号束的产生效率。
注：镜头f1、f2和f3 的焦距经过精心选择，以将SHG光束与OPO腔体进行模式匹配。因此，这些镜头的焦距在不同的设置中会有所不同。由于OPO腔中的残余色散，腔体长度的微小变化会引起信号束频谱的偏移。- 调整腔体长度以获得泵频谱，该频谱与1，040nm处的窄带斯托克斯一起，可以在1，373-5，090 cm-1范围内产生频率失谐。该范围涵盖了CH拉伸光谱区域（2，800-3，050 cm-1）中的振动。参见 图2中的蓝色光谱。
- 为了补偿激发显微镜物镜引起的色散效应，将宽带泵送至棱镜压缩机。将泵通过其顶点进入棱镜A，并将分散的泵引导到棱镜B的顶点，定义所需的负色散量，然后相应地设置棱镜顶端L之间的距离。
注： 图6 显示了棱镜29的排列方式。在这种情况下，GDD的补偿≈-12，800 fs2;因此 L = 1.26 m。- 使用布鲁斯特切割棱镜。
- 确保泵梁的极化位于棱镜的三角形平面内（顶部/底部未抛光面）。
- 确保泵束的 入射角 θ 与布鲁斯特角匹配。
- 确保棱镜A的出口面与棱镜B的入口面平行。
- 为了估计要补偿的宽带脉冲的GDD，在单个波长λ1处测量SRS信号，记录泵浦斯托克斯之间的时间延迟τ1 ，在该时间延迟获得最大SRS（λ1）。对第二个波长λ2重复此过程，再次记录SRS（λ2 ）最大值的时间延迟τ2。
注意：由于GDD被定义为相对于角频率的群延迟的导数，因此上述测量值允许估计宽带波束的GDD（方程[1]）。
（1）
- 使用布鲁斯特切割棱镜。
- 使用λ/2波片，将泵束的极化设置为45°。将极化泵引导至长度为 13.3 mm 的 YVO4 板上，将该双折射晶体的快速轴垂直设置。
注意：在通过YVO4 板时，泵脉冲将被分成两个正交极化复制副本，共线传播，但保持延迟Δt≈10 ps之间。这种延迟是双折射晶体的厚度和折射率的函数。此后，具有与斯托克斯脉冲具有相同极化状态的泵复制品将称为“信号”，而具有正交状态的泵复制品将称为“参考”。这种技术的细节，称为在线平衡检测，前面已经描述过30。 - 将泵和斯托克斯光束与二向色镜相结合，并使用一对荧光针孔小心地对齐它们，确保两者共线传播。衰减光束并使用透镜将其聚焦到快速（至少100 MHz带宽）光电二极管上。
- 阻断泵，并使用高带宽数字示波器测量单个斯托克斯脉冲。使用激光器的触发信号作为示波器测量的时钟源。确定光电二极管电压达到其最大值的平均值。
- 阻挡斯托克斯光束并对泵脉冲重复此过程。增加或减少泵（斯托克斯）光束的光路，直到其脉冲与斯托克斯（泵）脉冲大致同时到达。
注意：这应该保证两个臂之间光路差的匹配精度最高为几毫米。 - 取出光电二极管，放置一个具有合适切割角的非线性晶体，以便在泵浦斯托克斯光子之间产生和频（SFG）。
注意：这里使用的非线性晶体被切割用于I型相位匹配，θ = 90°，φ = 9.8°。非线性晶体的光轴应平行于斯托克斯和信号脉冲的偏振。 - 使泵/斯托克斯光束略微非共线性，并移动延迟线直到SFG，由于相位匹配，该信号位于泵的SHG和斯托克斯光束之间。如果未找到信号，请验证晶体上两束的空间重叠。
注意：SFG是蓝移的，肉眼应该很容易看到。 - 如果遇到意外困难，请放置低通滤波器以移除泵和斯托克斯及其各自的SHG，并用光谱仪测量SFG（图7A）。找到SFG达到其最大强度的时间延迟，该值决定了非线性信号生成所需的理想时空重叠，并将延迟线固定在那里（图7B）。
- 使用经过校准的相机测量光束轮廓。或者，使用红外卡并通过眼睛估计直径。使用两个望远镜，一个用于泵，另一个用于斯托克斯光束。使用这些望远镜，尝试将光束直径与激发物镜的后孔径相匹配。
注意：此过程将保证设置的最大空间分辨率。- 获得SRS信号后，使用泵浦光束上的望远镜调整其直径，改变其瑞利范围，从而改变显微镜焦点处的相互作用体积。达到最大 SRS 时停止。
- 使用光电二极管测量泵（斯托克斯）光束的强度，并利用光电二极管的响应度计算撞击探测器有效面积的平均功率
。- 如果使用高带宽光电二极管，请连接电子低通滤波器，仅获得常数或直流分量。要测量δP（f），请将高带宽光电二极管的输出（断开低通滤波器）连接到锁相放大器的输入端。将锁相输出
存储在不同的解调频率下，并使用光电二极管的响应度从V转换为W。
注意：商用锁相放大器具有用于测量δP（f）的内置工具（例如，苏黎世仪器公司与 LabOne 一台 频率扫描器31）合并）。 - 测量光束的RIN后，关闭激光器并测量电子噪声（即，在探测器上没有任何光的情况下计算RIN）。
注意：如果RIN受激光波动而不是散粒噪声的限制，则这种暗测量将有助于诊断用于测量的仪器;如果电子噪声与激光的RIN一样高，则不能用于测量激光器的RIN;可能必须使用超低噪声放大器来降低电子噪声。 - 如果RIN受散粒噪声而不是激光波动的限制，则将更多的光功率照射到探测器上。参见 图8。
- 如果使用高带宽光电二极管，请连接电子低通滤波器，仅获得常数或直流分量。要测量δP（f），请将高带宽光电二极管的输出（断开低通滤波器）连接到锁相放大器的输入端。将锁相输出
（1）
存储在不同的解调频率下，并使用光电二极管的响应度从V转换为W。3. 设置SRS成像的光谱检测
- 将泵和斯托克斯光束引导到显微镜上。
- 放置第1节中讨论的样品，并找到一个没有珠子的区域，以帮助对齐泵梁。使用相机，测量斯托克斯（泵）光束的反射轮廓，同时阻挡泵（斯托克斯）。在显微镜前用镜子调整激光点的位置。
注意：要获得最高的 SRS 生成，它们应完全重叠。 图9 显示（A）泵，（B）斯托克斯，和（C）两束在显微镜焦平面上完全重叠。 - 使激发和收集物镜共聚焦。
注意：使用无限远校正物镜意味着将泵聚焦在样品平面上将导致收集物镜后孔处的准直光束。- 放置一个短通滤波器以去除调制的斯托克斯，并将泵束引导到光栅上。在光栅之后放置一个透镜，将分散的光束聚焦到探测器上。
注意：光栅方程将有助于确定线性色散（即，在给定焦距 f32的透镜下，探测器平面上每毫米多少nm）。光栅方程涉及光栅的槽周期度 d ，入射角α，衍射角β，衍射波长λ和衍射阶 m （Eq [2]）。
（二）
- 放置一个短通滤波器以去除调制的斯托克斯，并将泵束引导到光栅上。在光栅之后放置一个透镜，将分散的光束聚焦到探测器上。
- 对于平衡检测，测量参考的频谱和沿泵束传播的信号副本。
注：光栅后泵梁的空间轮廓是一条线，由宽带泵沿其长度的不同光谱分量组成。泵浦管线的每个光谱分量将通过球面透镜聚焦在 距离f 处（参见步骤3.1-3.2）。- 为避免夹住分散的泵，请将球面透镜尽可能靠近光栅。将PBS放在球面透镜之后，以分离泵复制品。
注意：这里使用了偏振立方体分束器，因为这种偏振片不会扰乱泵束的偏振。它还可以有效地分离不同的泵副本，并且可以足够大以避免夹断宽带泵。PBS将反射信号复制件（s极化）并传输参考复制件（p极化）。 - 使用一对转向镜，引导信号并参考其各自的探测器（图1）。
注：在理想的平衡配置中，信号和参考副本应具有相同的光功率。 - 为了消除泵浦光束中的噪声，请将测量信号的光电二极管阵列的通道与参考检波器中的对应通道相关联。因此，确保信号的第n个 光电二极管和参考光电二极管阵列测量信号和参考副本的相同光谱分量的光功率。
注： 图8 显示了示例性的RIN光谱。
- 为避免夹住分散的泵，请将球面透镜尽可能靠近光栅。将PBS放在球面透镜之后，以分离泵复制品。
- 为保证两个光电二极管阵列之间的光谱匹配，请在光栅和PBS之间放置一个小狭缝或光圈，以对分散的泵进行空间滤波。夹紧泵复制副本除一个光谱分量之外的所有光谱分量，以将传输的光线集中在参考和信号光电二极管阵列的第n个 检测器上。使用上述转向镜调整不同检测通道的相关性。
- 此时，启动SRS显微镜检查。为此，请调制斯托克斯，对样本进行光栅扫描，并获取泵浦频谱（ΔI）上的调制传递及其相应的直流频谱（I），以从每个像素获得归一化SRS（ΔI/I）频谱。生成三维矩阵，其行 （x） 和列 （y） 包含样品的扫描位置。在与 x-y 平面正交的每个向量 （z） 上，存储一个 SRS 谱。
注： 图12 显示了SRS高光谱数据的结构。- 将斯托克斯波束的功率设置为65 mW，将宽带泵束的功率设置为20 mW。为实验设置理想的积分时间。
注意：此处的积分时间为44 μs;然而，由于压电扫描仪速度较慢，像素停留时间为1 ms。
- 将斯托克斯波束的功率设置为65 mW，将宽带泵束的功率设置为20 mW。为实验设置理想的积分时间。
（二）4. 高光谱SRS数据的化学计量学
- 使用多变量曲线分辨率分析来解开样品的不同化学成分。从 Tauler、de Juan 和 Jaumot33 中的链接下载 GUI。
注意：在这里，Tauler和同事开发的多元曲线分辨率 - 交替最小二乘（MCR-ALS）MATLAB程序被使用了34，35。关于MCR-ALS对SRS数据的应用，参见 36，37;有关算法的详细讨论，请参阅 38。 - 在 MATLAB 中，将 SRS 高光谱数据立方体重塑为矩阵 D ，其行包含 SRS 光谱。假设未折叠的SRL超立方体 D 是浓度 C 和样品化学成分的光谱图 S 的线性组合（即 D = CS T + E，其中 E 是包含实验误差的矩阵，上标 T 表示矩阵转置）。
- 获取数据的主要成分，以分离 C 和 S。众所周知，第1节中讨论的样本包含四个物种，即DMSO，橄榄油，PMMA和PS，因此将程序配置为搜索四个物种和另一个物种以解释背景噪音。如果存在具有较高或较低物种数的不同样品，请相应地配置程序。
注意：该程序对光谱数据进行奇异值分解，使用它们作为纯光谱 S的初始猜测。- 或者，用包含已知光谱迹线（例如，物质的自发拉曼光谱）的基质馈送程序。
注意：使用纯光谱的初始估计，程序将计算 C = DS（STS）−1 和 ST = （CTC）−1CTD。 C 和 S 的新值使用交替最小二乘算法进行优化。
- 或者，用包含已知光谱迹线（例如，物质的自发拉曼光谱）的基质馈送程序。
- 由于 SRS 是非负信号，因此请约束交替最小二乘算法以提供正值。
注意：优化的 C 和 S 将允许构造一个新的矩阵 D*= CST，这是一个程序将与原始数据 D 进行比较的数据集。程序会自动迭代这些步骤，直到 D* 和 D 之间的差值小于可以定义的任意阈值。 - 图 C 和 S 以获取化学图像和样品化学成分的特征光谱。
Representative Results
图3 显示了使用PS，PMMA和橄榄油的该协议获得的示例性结果。LBO1 的这种旋转将改变SHG场所经历的折射率，直接改变其相位速度。当SHG场的相位速度与LBO1中诱导的非线性极化速度相匹配时，非线性产生的场和非线性极化将同相，导致强烈的SHG辐射。换句话说，调整LBO1 的φ角将允许用户达到SHG的理想相位匹配条件。由于这里使用I型相位匹配晶体，SHG光束的偏振将与基波束的偏振正交（图5B）。
图8 显示了该协议中使用的光源的RIN和散粒噪声极限，这是电子和光子的量子性质的结果，为激光噪声设定了基本极限。散粒噪声极限RIN的 
计算公式为Eq（3）。
（3）
其中 h 是普朗克常数， ν 是光学频率。因此，散粒噪声为电子设计提供了有用的指导。
图11A和图11C显示了平衡和不平衡光谱的示例性数据。当然，平衡检测的效果会影响实验的最终结果，即化学图谱。图11B和图11D分别显示了不平衡和平衡条件下的复合图像。成功实施所描述的方案将有助于识别和定位异质样品的不同化学成分，并提取其特征SRS光谱。对图12的高光谱数据进行化学计量分析，得到图13。图13A显示了样品中不同化学成分的浓度图的复合图，而图13B显示了它们的特征SRS光谱。请注意，图13A所示的数据不仅允许用户轻松识别样品的不同成分，还可以进行更定量的分析。例如，通过使用浓度图，我们可以计算每种化学物质的分数浓度的平均值：38%DMSO，25%PMMA，14%PS和22%橄榄油。
图1：该协议中采用的宽带SRS显微镜示意图。 缩写：PBSx =偏振分光镜;SHG = 二次谐波产生模块;OPO = 光学参数振荡器;AOM = 声光调制器;SPF = 短通滤波器;M-LIA：多声道锁相放大器;DM = 二向色镜。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：可调谐宽带泵（蓝色）和窄带（红色）斯托克斯光束的光谱。请单击此处查看此图的大图。
图3：化学非均质样品的明场图像。 请注意，传统的显微镜不允许区分不同的成分。比例尺 = 100 μm。缩写： PS = 聚苯乙烯;PMMA = 聚甲基丙烯酸甲酯;DMSO = 二甲基亚砜。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：窄带斯托克斯脉冲的调制。（A） 透明蓝色迹线显示 0th 衍射光束，而黑色轨迹显示相应的 1阶。（B）光学设置，用于优化一阶衍射光束的调制效率，并在到达激发目标之前对斯托克斯光束的光斑尺寸进行微调。缩写：AOM = 声光调制器;fx = 镜头 X 的焦距，请点击此处查看此图的大图。
图 5：驱动 OPO 所需的非线性光学过程。 （A） SHG 相互作用的几何形状。ω1 的两个基本光子将材料系统带到高能虚能级，材料系统从那里跳到基态，在ωSHG处发射光子。（二）SHG实验方案。（C） SHG 和 OPO 设置的示意图。（D） DFG相互作用的几何形状。ωSHG 光子被分成信号（ω信号）和惰轮（ω惰轮）光子。信号束的增益是通过反馈信号光子并使其在腔体中共振来实现的。（E） DFG实验方案。缩写：SMx = 球面镜 （R = 75 mm）;OPO = 光学参数振荡器;SHG = 二次谐波产生模块;DFG = 差频产生;LBO = 摩擦酸锂;OC = 油冷凝器;DM = 二向色镜;fx = 镜头 X 的焦距 ，请点击此处查看此图的大图。
图 6：棱镜压缩机的几何形状。请单击此处查看此图的大图。
图 7：用于优化时空重叠的求和频率生成。 （A） 泵和斯托克斯之间的 SFG 以及它们各自的 SHG 撞击屏幕。在这里，透镜将泵浦和斯托克斯光束聚焦到晶体上，而低通滤光片则将它们移除。（B）泵和斯托克斯之间的SFG强度作为时间延迟的函数。将 SRS 设置的时间零设置设置在最大化 SFG 的位置。 B 中互相关的不对称性是由于斯托克斯梁上的etalon引起的时间分布。缩写：SFG = 总和频率生成;SHG = 二次谐波产生模块;SRS = 受激拉曼散射光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：RIN 光谱。 以绿色突出显示的波段显示了SRS实验的最佳光谱区域。在此频段内的任何频率调制斯托克斯光束，可以保证激光噪声对SRS信号的影响尽可能小。缩写：RIN = 相对强度噪声;SRS = 受激拉曼散射光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图 9：梁轮廓。 （A） 泵，（B） 斯托克斯，（C） 泵和斯托克斯。 请点击此处查看此图的大图。
图 10：色散光栅和光电二极管阵列探测器的假设几何形状。请单击此处查看此图的大图。
图 11.平衡检测的效果。 对光谱（A，C）和化学图像（B，D）的影响。图（B）和（D）中显示的复合材料是实验的最终结果（即，在对高光谱数据进行化学计量分析之后）。有关详细信息，请参阅协议第 4 节）。比例尺 = 10 μm。简称：SRS =受激拉曼散射光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图12：使用宽带SRS显微镜获得的代表性SRS超立方体。 x-y 平面存储扫描位置的坐标，而沿 z 的每个矢量都注册一个 SRS 频谱。简称：SRS =受激拉曼散射光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图13：高光谱SRS数据的化学计量分析。 （A）样品不同成分的浓度图的复合。（B） 化学物质的特征光谱。在两个面板中，黄色：橄榄油，蓝色：DMSO，青色：PS，橙色：PMMA。比例尺 = 20 μm （A）。缩写：SRS =受激拉曼散射光谱;PS = 聚苯乙烯;PMMA = 聚甲基丙烯酸甲酯。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
宽带SRS显微镜是一种强大的成像技术，可提供真实的化学对比，以识别和解缠非均相样品的化学成分。这种分析工具的潜力可能对从材料科学到组织病理学等多个研究领域有益。宽带SRS显微镜的缺点是它在技术上要求很高。实验者不仅需要宽带激光源的专业知识，还需要操纵激光脉冲以有效地产生SRS，而SRS反过来又需要用复杂的检测方案来测量SRS。本文提出了一种方案，该协议描述了使用多重宽带SRS显微镜生成混合化合物化学图谱的工作流程。尽管所描述的工作对于一些激光物理学家和非线性显微镜学家来说可能是微不足道的，但对于对宽带SRS显微镜的好处感兴趣的读者来说，情况可能并非如此，因为宽带SRS显微镜的科学知识位于这些领域之外。因此，我们旨在详细介绍每一步，以指导对宽带SRS显微镜感兴趣的广大受众。
手头的实验方案首先展示了如何制备一种简单但光谱丰富的样品，该样品由几种强而知名的拉曼散射体组成。我们讨论了如何获得设置SRS显微镜所需的宽带泵浦和窄带斯托克斯光束。 图5C 显示了SHG和OPO设置的方案。请注意，透镜f1 将基波束聚焦到LBO1 上以产生SHG，而二向色镜反射SHG辐射并传输残余基波束。第二个透镜f2 准直SHG光束。当f2 >f1时，SHG光束膨胀一个系数等于f2 /f1。第三个透镜f3 将膨胀的SHG光束聚焦到第二个I型LBO晶体（LBO2）上，该晶体切割在θ = 90°和φ = 29.0°。通过泵浦具有上述SGH（520 nm）的LBO2 ，LBO2 通过差频生成（DFG）将产生680-910 nm范围内的辐射，产生两束：信号和惰轮27（图5D，E）。后者被丢弃，而前者在OPO腔中放大以提供SRS实验中使用的泵脉冲。520nm处的OPO泵，即SHG束，不应与SRS实验的泵（即OPO的信号束）混淆。
SRS显微镜中的对比度源于显微镜焦点处产生的非线性信号，该信号需要在给定时间将大量光子限制在样品平面中。这种光子约束是通过高数值孔径（NA）显微镜物镜实现的，该物镜阵列也设置了系统的空间分辨率：NA越高，空间分辨率越高。然而，高NA物镜被玻璃密集地填充，这为脉冲辐射引入了正GDD，这种频率啁啾声最终拓宽了脉冲39的时间分布。因此，显微镜物镜引入的GDD可能会增加宽带泵浦脉冲的持续时间，使其甚至比斯托克斯时间包络更长，并降低拉曼信号的有效、可访问的带宽。此外，这种扩大还可能使所测得的SRS光谱的光谱分布失真。
在CARS中，光谱相关信号出现在与激发场不同的波长处。一个简单的光电倍增管或电荷耦合器件（CCD）相机可用于及时集成CARS信号，汇总数千个脉冲以平均激光噪声。相反，SRS信号表现为嵌入在强烈且波动的激光背景中的微弱调制传输。由于这种调制很弱，激光噪声很容易压倒它，从而降低SRS显微镜的成像速度和灵敏度。因此，在成像之前，必须测量相对强度噪声（RIN），以确定激光器是否适合高速SRS成像，并选择噪声最低的调制频率。RIN定义为激光器的噪声功率谱密度[δP（f），W2/Hz单位]由平均光功率（
）40，41归一化。换句话说，RIN描述了不同频率下的归一化激光波动（方程[4]）。
（4）
因此，RIN是SRS系统的一个参数，用于确定实验的理想调制频率范围。例如， 图8 中的橄榄条显示了SRS成像的理想调制频率范围。在窄带SRS的情况下，用户应测量泵和斯托克斯的RIN，以选择需要调制的光束以实现最佳性能。例如， 请注意，图8中的斯托克斯光束具有略高于泵的RIN，这意味着SRG测量值将比SRL测量值更嘈杂。在宽带SRS的情况下，应该调制的波束是窄带波束。
光栅的角色散 D 表示衍射角为波长的函数，并定义为光栅方程的导数。对于 Littrow 构型，角色散由方程 （5） 给出。
（5）
为了得到方程（5），我们假设 α = β，求解了m / d的方程式（2），并将结果插入到dβ / dλ β中。在小角度近似中，沿光谱的位置变化为fdβ ≈dl（图10）。因此，通过将dβ插入等式（5）中，我们可以计算线性色散，即使用等式（6）以nm mm-1为单位的量：
（6）
对于在 Littrow 配置中运行的衍射光栅，槽数为 1，851.85/mm，d = 540 nm。如果我们使用~789 nm处的光的一阶衍射，D = 0.0027 rad nm-1。使用f = 750 mm镜头，我们得到≈0.5 nm mm-1的线性色散，转化为≈7.8 cm-1 mm-1。因此，透镜的焦距决定了探测器平面上每毫米nm的“密度”：焦距越长，获得的nm/mm就越少，从而增加了宽带泵的光谱线之间的空间。相反，焦距较短，探测器平面上每毫米的nm会更多，从而减少了分散泵占用的空间。
平衡检测可提高噪声设置的图像质量和灵敏度。 例如，根据图8所示的RIN光谱，并考虑幅度为1 x 10-5的典型SRS，不平衡信噪比（SNR）为≈60。使用平衡检测（即接近散粒噪声），可以获得≈145的SNR。图11显示了平衡和不平衡条件下的光谱和复合图像。当然，平衡检测的效果会影响实验的最终结果，即化学图谱。在这些结果的支持下，我们强调平衡检测是一种强大的技术，可以抵消激光波动对图像质量的不利影响。 值得一提的是，平衡检测最适合于光纤振荡器等噪声激光器。使用安静光学光源（例如固态激光器）工作的SRS显微镜可能不需要平衡检测。
该协议还解释了一种基于非线性光学的方法，以找到这些光束脉冲之间的时空重叠。我们描述了使用1st 而不是AOM的0th 衍射阶作为调制斯托克斯光束的优点。此外，还描述了色散对SRS产生效率的不利影响，并提出了通过棱镜式压缩机减轻这些影响的方法。此外，该协议还解释了如何对齐棱镜，并强调了要考虑的三个关键方面，以实现最佳性能。我们不仅讨论了RIN与SRS显微镜的相关性，还展示了如何使用锁相放大器对其进行测量，并使用RIN频谱定义最佳调制频率。本文通过一个具体的例子解释了光栅方程如何帮助设计检测链。最后，该协议使用真实的SRS数据说明了SRS超立方体的结构以及如何使用常规使用的科学编程语言对其进行分析。
此协议有三个小限制。首先，本贡献中采用的检测方案包括由Sciotino等人内部设计和建造的非常规，多通道锁定式探测器.26如前面的25所示，该探测器可以被现成的平衡光电二极管取代。虽然这种修改只涉及探测器，并且协议几乎没有变化，但对于单个光电二极管，需要扫描探测器上的每个光谱分量，而不是一次测量它们。其次，该协议采用在线平衡检测，这需要将多个光学元件插入光束路径。这些光学元件增加了系统的复杂性，并导致光功率损失和脉冲展宽。
在线平衡检测还要求两个泵复制品通过样品，这种情况可能不适合光敏样品，如活细胞，或者对于强双折射样品，其中两个泵浦复制品可能经历不同的光学性质，从而取消平衡检测。第三，该协议依赖于自制的OPO，这是一种可能不容易获得的设备。然而，OPO提供的宽带光谱的替代品是来自非线性光纤或块状晶体的超连续体。后者只能用于低重复率激光器（高达5 MHz）。因此，与每个实验设计一样，手头的协议也有一些局限性。但是，它们是最小的，并且不会影响此方法的成功。
尽管本文描述了参考样品，但该方案可以成功地解开细胞和动植物组织内的化学物质，例如纤维素，脂质物种或蛋白质，从而在不同的生化任务中寻找实际应用或作为组织病理学中的诊断工具。同样，该协议可以成为材料科学中有价值的工具。例如，按照该协议，可以询问聚合物物种42的分子组成和浓度。此外，该方法与其他非线性显微镜技术兼容，例如基于泵浦探针43和外差CARS44的宽带显微镜，四波混合过程，与SRS一样，还需要两个激发光束和调制 - 转移测量。最后，本文中包含的一些信息可以应用于不依赖于调制传输技术，但需要对准两个或多个脉冲激光束的非线性成像技术，例如传统的CARS45和SFG显微镜46。
总之，该协议描述了一种基于宽带SRS显微镜的强大方法，用于从化学非均相混合物中提取化学图谱及其特征SRS光谱，从而提供允许直接定量数据分析的数据集。该方法的多功能性和简单性也使感兴趣的读者有可能将其适应不同的非线性技术。
Disclosures
G. C.宣布与剑桥拉曼成像公司（Cambridge Raman Imaging）合作，该公司旨在将宽带SRS显微镜技术商业化。其他作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
D. P.承认根据第101016923号赠款协议的欧盟项目CRIMSON和根据第101016923号赠款协议编号的Lombardia地区项目NEWMED的资助。POR FESR 2014-2020。G. C.承认欧盟项目GRAPHENE Core3根据赠款协议编号881603提供资金。G. C.还感谢阿卜杜拉国王科技大学的资助，拨款编号：OSR-2016-CRG5-3017-01。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection objective | Nikon | CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon | Oil immersion objective |
| Coverslips | Thermo Fisher | 043211-KJ | Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm |
| Delay line | Physik Instrumente (PI) | M-406.6PD | Precision microtranslation stage, 150 mm travel range |
| DMSO | Merck | D8418-500ML | Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide |
| Etalon | SLS Optics Ltd | Custom made | Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring |
| Excitation objective | Nikon | CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon | Water immersion objective |
| Grating | LightSmyth | T-1850-800s Series | High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series |
| Laser | Coherent | Custom made | Fidelity, HP |
| λ/2 | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | Mounted superachromatic half-wave plate |
| PBS | Thorlabs | CM5-PBS203/M | 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube, |
| PMMA beads | Merck | MFCD00198073 | Micro particles based on polymethacrylate |
| Prisms | Crisel | 320-8218 | LASER DISPERSING PRISMS in SF11 |
| PS beads | Merck | 72986-10ML-F | Micro particles based on polystyrene |
| YVO4 crystal | Dr. Sztatecsny GmbH | Custom made | thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 - 1,100 nm |
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