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Engineering

ब्रॉडबैंड उत्तेजित रमन बिखरने माइक्रोस्कोपी पर आधारित मल्टीप्लेक्स रासायनिक इमेजिंग

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/63709
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1,2
1Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano, 2Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

हम ब्रॉडबैंड उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी के साथ रासायनिक छवियों को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक एसआरएस माइक्रोस्कोप के आधार पर जो अंतर मल्टीचैनल-लॉक-इन डिटेक्शन के साथ संचालित होता है, प्रोटोकॉल नमूना तैयारी, एसआरएस तंत्र के समायोजन और रासायनिक रूप से विषम नमूनों के विभिन्न घटकों को विसर्जित करने के लिए केमोमेट्रिक्स का वर्णन करता है।

Abstract

उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी लेबल मुक्त रासायनिक इमेजिंग के लिए एक गैर-रेखीय ऑप्टिकल तकनीक है। यह विश्लेषणात्मक उपकरण सीधे उनके आणविक कंपन से पूछताछ करके पतली नमूनों की उच्च गति, और उच्च स्थानिक संकल्प पर रासायनिक मानचित्र प्रदान करता है। इसके मानक कार्यान्वयन में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी संकीर्ण बैंड है और एक समय में केवल एक ही कंपन आवृत्ति के साथ छवियों का निर्माण करता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण न केवल एसआरएस की रासायनिक विशिष्टता में बाधा डालता है बल्कि कंपन स्पेक्ट्रा के भीतर एन्कोडेड जानकारी के धन की भी उपेक्षा करता है।

इन सीमाओं को ब्रॉडबैंड एसआरएस द्वारा दूर किया जा सकता है, एक कार्यान्वयन जो समानांतर में छवि के प्रति पिक्सेल कंपन स्पेक्ट्रम निकालने में सक्षम है। यह हाइपरस्पेक्ट्रल डेटा प्रदान करता है, जब केमोमेट्रिक विश्लेषण के साथ युग्मित होता है, तो नमूने से पुनर्प्राप्त जानकारी की मात्रा को अधिकतम करता है। इस प्रकार, ब्रॉडबैंड एसआरएस सिस्टम की रासायनिक विशिष्टता में सुधार करता है, जिससे नमूने के विभिन्न घटकों की एकाग्रता के मात्रात्मक निर्धारण की अनुमति मिलती है। यहां, हम ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी के साथ रासायनिक इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं, जो एक कस्टम अंतर मल्टीचैनल-लॉक-इन एम्पलीफायर डिटेक्शन के साथ संचालित एक घर-निर्मित एसआरएस माइक्रोस्कोप पर आधारित है। यह नमूना तैयारी, एसआरएस तंत्र के संरेखण और केमोमेट्रिक विश्लेषण पर चर्चा करता है। कंपन रमन स्पेक्ट्रा प्राप्त करके, प्रोटोकॉल दिखाता है कि मिश्रण के भीतर विभिन्न रासायनिक प्रजातियों की पहचान कैसे करें, उनके सापेक्ष सांद्रता का निर्धारण करें।

Introduction

रमन माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक है जो रमन प्रकीर्णन1 को मापकर समृद्ध रासायनिक मानचित्र प्रदान करती है, एक अप्रत्यास्थ विकिरण प्रक्रिया जो घटना प्रकाश 2,3 के जवाब में कंपन करने वाले अणुओं से उत्पन्न होती है। रमन मानचित्र के प्रत्येक पिक्सेल में एक स्पेक्ट्रम होता है जो नमूने की रासायनिक संरचना और संरचना पर सीधी जानकारी रखता है, जिसके परिणामस्वरूप आंतरिक कंपन विपरीत के साथ छवियां होती हैं। आज तक, रमन माइक्रोस्कोपी आणविक कंपन के माइक्रोस्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन के लिए संदर्भ दृष्टिकोण है क्योंकि कोई अन्य इमेजिंग तकनीक उच्च रासायनिक विशिष्टता और उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन4 दोनों के साथ छवियों का उत्पादन नहीं कर सकती है। इसकी उत्कृष्ट रासायनिक विशिष्टता के बावजूद, रमन प्रकीर्णन की पीढ़ी दक्षता कम है, या तो विस्तारित पिक्सेल निवास समय या उच्च शक्ति उत्तेजना के लिए बुला रही है, क्रमशः, कम अधिग्रहण दरों और संवेदनशील नमूनों के साथ असंगति के लिए अग्रणी।

रमन माइक्रोस्कोपी की इस एकल कमी ने शोधकर्ताओं को माइक्रोस्कोपी के लिए विपरीत स्रोत के रूप में सुसंगत रमन प्रकीर्णन 5,6,7,8,9 लागू करने के लिए प्रेरित किया। यह एक गैर-रेखीय ऑप्टिकल प्रक्रिया है जो परिमाण के कई (सात तक) आदेशों द्वारा कंपन प्रतिक्रिया को बढ़ाती है, इस प्रकार उच्च गति रासायनिक इमेजिंग10,11,12,13 की अनुमति देती है। विशेष रूप से, दो सबसे अधिक नियोजित सुसंगत रमन प्रकीर्णन तकनीक सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन प्रकीर्णन (सीएआरएस) 14 और उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) 15 हैं। कारों के विपरीत, एसआरएस गुंजयमान अणुओं की एकाग्रता पर एक रैखिक निर्भरता दिखाता है। यह गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि के लिए प्रतिरक्षा है, किसी भी कंपन संक्रमण से असंबंधित एक गैर-रेखीय प्रभाव लेकिन आणविक कंपन16,17 के रमन स्पेक्ट्रा की लोरेंत्ज़ियन आकृतियों की विशेषता के लिए विकृत है। इस प्रकार, एसआरएस माइक्रोस्कोपी प्रामाणिक रमन जानकारी उत्पन्न करती है जो प्रत्यक्ष मात्रात्मक छवि विश्लेषण की अनुमति देती है।

एसआरएस एक तीसरा क्रम, गैर-रेखीय, ऑप्टिकल प्रक्रिया है जो एक नमूने के रासायनिक बांड पर सीधी जानकारी प्रदान करती है। यह आम तौर पर निकट-अवरक्त वर्णक्रमीय क्षेत्र में दो ऑप्टिकल क्षेत्रों के स्पैटिओटेम्पोरल सुपरपोजिशन से उत्पन्न होता है, अर्थात् पंप और स्टोक्स क्रमशः10,11,18 आवृत्ति पर 10,11,18 आवृत्तिπ पु और ωएस पर। यह सुपरपोजिशन पंप-स्टोक्स आवृत्ति डिट्यूनिंग पर एक धड़कन उत्पन्न करता है Ω =ω पु-ω एस। जब Ωआर Ω एक आणविक कंपन से मेल खाता है, तो अणु प्रतिध्वनित होता है, जिससे प्रकाश क्षेत्रों और अणु के बीच एक सुसंगत ऊर्जा हस्तांतरण होता है। नतीजतन, अणु कंपन रूप से उत्तेजित स्थिति तक पहुंच जाता है। इस प्रक्रिया को या तो पंप फोटॉनों के विनाश (उत्तेजित रमन हानि [एसआरएल]) या स्टोक्स फोटॉनों के सहवर्ती प्रवर्धन (एक प्रक्रिया जिसे उत्तेजित रमन लाभ [एसआरजी] के रूप में जाना जाता है) के विनाश को मापकर निगरानी की जा सकती है। एसआरजी और एसआरएल छोटे संकेत (ΠI) हैं जो एक तीव्र और उतार-चढ़ाव वाली पृष्ठभूमि (आई) के शीर्ष पर बैठते हैं। चूंकि एसआरएस सिग्नल (ΠI / I) के विशिष्ट मान 10-6-10-4 रेंज में हैं, इसलिए लेजर शोर आसानी से इसे अस्पष्ट कर सकता है। सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) पर लेजर शोर के हानिकारक प्रभावों को कम करने के लिए और इसके परिणामस्वरूप इमेजिंग गति पर, एसआरएस का पता लगाने के लिए मॉडुलन हस्तांतरण तकनीकों (जैसे, लॉक-इन एम्पलीफायरों, गुंजयमान सर्किट, या बॉक्स-कार औसत) पर निर्भर करता है उच्च मॉडुलन आवृत्तियों (>1 मेगाहर्ट्ज), जहां लेजर शोर अपने न्यूनतम मूल्यों 15,19,20 तक पहुंचता है।

पारंपरिक एसआरएस माइक्रोस्कोपी एक एकल कंपन आवृत्ति पर रासायनिक छवियों का उत्पादन करने के लिए नैरोबैंड (≈10 सेमी -1) पंप और स्टोक्स दालों को नियोजित करती है, जिससे पिक्सेल निवास समय के साथ वीडियो-दर इमेजिंग ≈100 एनएस21,22 जितना कम हो जाता है। हालांकि, क्योंकि नैरोबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी केवल कुछ कंपन आवृत्तियों पर नमूने को क्रमिक रूप से स्कैन करके रासायनिक मानचित्र बनाती है, इसकी जानकारीसीमित है 23. एक या दो कंपन विरोधाभासों के साथ एसआरएस छवियां विशेष रूप से विषम प्रणालियों के भीतर ओवरलैपिंग रमन बैंड के साथ रासायनिक प्रजातियों को अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकती हैं। इसलिए, प्रतिमान संकीर्ण बैंड एसआरएस माइक्रोस्कोप एसआरएस की पूरी क्षमता का फायदा नहीं उठाता है, क्योंकि कुछ हद तक कंपन आवृत्तियों की जांच करने से इसकी रासायनिक विशिष्टता में बाधा आती है और कंपन स्पेक्ट्रा के भीतर एन्कोड की गई जानकारी के धन की उपेक्षा होती है। इसके अलावा, विभिन्न आवृत्तियों पर नमूने की अनुक्रमिक स्कैनिंग के परिणामस्वरूप विस्तारित पिक्सेल निवास समय होता है जो फोटोडैमेज को ट्रिगर कर सकता है और लगातार छवियों के बीच कठोर स्थानिक सह-पंजीकरण को रोक सकता है, जिससे गति कलाकृतियों की ओर अग्रसर होता है।

अपने संकीर्ण बैंड समकक्ष के विपरीत, ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी प्रत्येक नमूना स्कैन 10,12,24 पर पिक्सेल प्रति एक कंपन स्पेक्ट्रम को पुनः प्राप्त करता है। इस प्रकार, ब्रॉडबैंड एसआरएस विभिन्न कंपन विरोधाभासों के सख्त स्थानिक सह-पंजीकरण के साथ हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रदान करता है, जिससे कठोर डेटा विश्लेषण की अनुमति मिलती है। यह न केवल रमन स्पेक्ट्रा के माध्यम से नमूने के रासायनिक घटकों को प्रकट करता है, बल्कि उनके सापेक्ष सांद्रता को निर्धारित करने में भी मदद करता है। स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण कैसे किया जाता है, इसके आधार पर, ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी को या तो हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस या मल्टीप्लेक्स एसआरएस के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस में, नमूने के स्कैन किए गए बिंदु प्रति एसआरएस स्पेक्ट्रम को क्रमिक रूप से अधिग्रहित किया जाता है (यानी, इसे आवृत्ति डिट्यूनिंग Ω को व्यापक करके पुनर्प्राप्त किया जाता है), लगातार रमन शिफ्ट में एसआरएस संकेतों को एक साथ ढेर करके एसआरएस स्पेक्ट्रम का निर्माण किया जाता है। रमन स्पेक्ट्रम मल्टीप्लेक्स एसआरएस में कई कंपन मोड पर एक साथ मापा जाता है। इस प्रकार, मल्टीप्लेक्स एसआरएस दृष्टिकोण विभिन्न आवृत्तियों पर एसआरएस सिग्नल को चलाने के लिए ब्रॉडबैंड पल्स के साथ एक मॉड्यूलेटेड नैरोबैंड पल्स को जोड़ता है, और एसआरएस स्पेक्ट्रा का पता लगाने के लिए नैरोबैंड एसआरएस की तुलना में संवेदनशीलता के साथ एक मल्टीचैनल डिटेक्टर का उपयोग करता है।

यह पेपर मल्टीप्लेक्स एसआरएस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विषम नमूनों के रासायनिक मानचित्रों का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में नियोजित एसआरएस माइक्रोस्कोप की एक योजना को चित्रा 1 में दर्शाया गया है और कहीं और25,26,27 के विस्तार से वर्णित किया गया है। संक्षेप में, एक वाणिज्यिक मोड-लॉक वाईबी फाइबर लेजर, 1040 एनएम पर केंद्रित 140 एफएस दालों का उत्पादन करता है, जिसमें 10 डब्ल्यू औसत शक्ति और 80 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर होती है, ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोप को चलाती है। एक ध्रुवीकरण बीम स्प्लिटर (पीबीएस) मौलिक बीम को दो शाखाओं में अलग करता है। संकीर्णबैंड स्टोक्स दालों का उत्पादन करने के लिए, मौलिक बीम के 4 डब्ल्यू के साथ एक शाखा को एक एटलॉन में भेजा जाता है जो एक संकीर्ण बैंड (≈15 सेमी -1) बीम उत्पन्न करता है, जिसे तब एक ध्वनिक ऑप्टिक मॉड्यूलर (एओएम) के साथ 1.6 मेगाहर्ट्ज पर संशोधित किया जाता है। मौलिक बीम के 6 डब्ल्यू के साथ शेष अंश 2.8 मिमी मोटी लिथियम ट्राइबोरेट (एलबीओ) क्रिस्टल के साथ आवृत्ति-दोगुना हो जाता है, टाइप-आई चरण मिलान के लिए काटा जाता है (θ = 90 °, φ = 13.8 °)। 520 एनएम पर परिणामी दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (ओपीओ) को पंप करने के लिए एक्स-फोल्ड गुहा की यात्रा करती है, एक उपकरण जो 3.0 मिमी मोटी एलबीओ क्रिस्टल (प्रकार मैं चरण मिलान, π = 90 डिग्री, φ = 9.8 डिग्री) का उपयोग करता है, 680-910 एनएम वर्णक्रमीय क्षेत्र (चित्रा 2) के भीतर ब्रॉडबैंड ऑप्टिकल विकिरण ट्यून करने योग्य ब्रॉडबैंड ऑप्टिकल विकिरण देने के लिए सक्रिय माध्यम के रूप में। ये ब्रॉडबैंड दालें एसआरएस प्रयोगों में पंप के रूप में काम करती हैं और माइक्रोस्कोप उद्देश्य द्वारा प्रेरित फैलाव प्रभावों को पूर्ववत करने के लिए एक प्रिज्म कंप्रेसर का प्रचार करती हैं।

संपीड़न चरण के बाद, एक वाईवीओ4 बाइरेफ्रिंजेंट प्लेट के साथ संयुक्त एक π/2 वेवप्लेट, दो ऑर्थोगोनल रूप से ध्रुवीकृत प्रतिकृतियों का उत्पादन करता है जिनके पहचान विमान पर इलेक्ट्रॉनिक घटाव ब्रॉडबैंड पंप के शोर को रद्द कर देता है। एक डाइक्रोइक दर्पण पंप और स्टोक्स बीम को जोड़ता है और उन्हें एक ईमानदार माइक्रोस्कोप में भेजता है। 1.27 के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ एक जल-विसर्जन उद्देश्य नमूने पर प्रकाश पर केंद्रित है, जबकि 1.4 के एनए के साथ एक तेल-विसर्जन उद्देश्य इसे एकत्र करता है। पता लगाने के चरण से पहले, एक शॉर्ट-पास फ़िल्टर (एसपीएफ़) मॉडुलित स्टोक्स को हटा देता है, जबकि लिट्रो कॉन्फ़िगरेशन में एक विवर्तन झंझरी ऑपरेटिंग प्रेषित ब्रॉडबैंड पंप को फैलाता है। एक दूसरा पीबीएस2 पंप प्रतिकृतियों को अलग करता है, और एक लेंस उन्हें दो फोटोडायोड सरणियों पर केंद्रित करता है। इन फोटोडायोड सरणियों से संकेतों को इलेक्ट्रॉनिक रूप से घटाया जाता है और घर-निर्मित मल्टीचैनल-लॉक-इन एम्पलीफायर (एम-एलआईए) को भेजा जाता है। डिमोड्यूलेटेड सिग्नल को तब फोटोडायोड सरणियों में से एक के प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) रीडिंग द्वारा सामान्यीकृत किया जाता है, इस प्रकार एसआरएल स्पेक्ट्रम का उत्पादन होता है।

एक अनुकरणीय प्रयोग के रूप में, हम कई प्रसिद्ध रमन प्रकीर्णकों के मिश्रण की छवि बनाते हैं, प्रत्येक एक अद्वितीय रमन स्पेक्ट्रम के साथ। इस प्रकार, प्रोटोकॉल संदर्भ नमूने तैयार करने के तरीके का वर्णन करके शुरू होता है। जैसा कि हम एसआरएल का पता लगाते हैं, हम यह समझाते हैं कि संकीर्ण बैंड स्टोक्स दालों को कैसे प्राप्त किया जाए और ऑप्टिकल स्रोत स्थापित किया जाए जो ब्रॉडबैंड (≈250 सेमी -1) पंप दालों को वितरित करता है, अर्थात्, होमबिल्ट ओपीओ। प्रोटोकॉल ऑप्टिकल बीम के संरेखण और अनुकूलन को दर्शाता है, जो संकीर्ण बैंड स्टोक्स और ब्रॉडबैंड पंप की शक्ति और स्पेक्ट्रा जैसे महत्वपूर्ण मापदंडों का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल ब्रॉडबैंड पंप के ऑप्टिकल पथ का विस्तार से वर्णन करता है क्योंकि इसके लिए विशेष ऑप्टिकल तत्वों की आवश्यकता होती है। यह यह भी बताता है कि पंप-स्टोक्स दालों के बीच स्पैटिओटेम्पोरल ओवरलैप को कैसे खोजना है और सापेक्ष तीव्रता शोर (आरआईएन) निर्धारित करने का एक व्यावहारिक तरीका दिखाता है, जो बदले में एसआरएस प्रयोगों के लिए सर्वोत्तम मॉडुलन आवृत्ति को परिभाषित करने में मदद करता है। फिर, हम पता लगाने की श्रृंखला के कार्य सिद्धांत और अंशांकन की व्याख्या करते हैं। अंत में, प्रोटोकॉल डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया, केमोमेट्रिक्स और छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन को दर्शाता है।

Protocol

1. नमूना तैयार करना

नोट: यह प्रोटोकॉल एकाग्रता मानचित्रों की पुनर्प्राप्ति और रासायनिक रूप से विषम मिश्रण की विशेषता एसआरएस स्पेक्ट्रा का वर्णन करता है।

  1. नमूना तैयार करने के लिए, पॉलीमिथाइल मेथाक्रिलेट (पीएमएमए) माइक्रोबीड्स ( सामग्री की तालिका देखें) के जलीय निलंबन से 2 μL निकालें और माइक्रोस्कोप कवरस्लिप पर 2 μL अंश डालें।
    1. एक साफ विंदुक टिप के साथ, पॉलीस्टीरिन (पीएस) माइक्रोबीड्स के जलीय निलंबन से 2 μL निकालें और इसे कवरस्लिप पर पीएमएमए निलंबन के साथ संयोजित करें। एक विंदुक टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे निलंबन को मिलाएं और इसे 24 घंटे के लिए सूखने दें।
      नोट: नमूना सतह पर माइक्रोबीड्स की असमान मात्रा से बचने के लिए माइक्रोबीड निलंबन की एकाग्रता से सावधानीपूर्वक मिलान करना महत्वपूर्ण है। पीएस और पीएमएमए मोतियों का व्यास क्रमशः 10 और 6 μm है। ये आयाम एसआरएस की पीढ़ी दक्षता से समझौता किए बिना माइक्रोस्कोप के उच्च स्थानिक संकल्प का प्रदर्शन करने की अनुमति देते हैं।
  2. मोती की सपाट, सफेद परत के शीर्ष पर जो पानी के सूखने पर दिखाई देगी, 20 μL डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) और फिर शुद्ध जैतून का तेल के 20 μL जोड़ें।
  3. एक दूसरे माइक्रोस्कोप कवरस्लिप के किनारों पर नेल पॉलिश लागू करें। मिश्रण पर कवरस्लिप रखें, नेल पॉलिश के साथ नीचे की ओर सामना करना पड़ रहा है, इसे सील करने के लिए पर्याप्त दबाव लागू करना। इसे सूखने दें।
    नोट: चित्रा 3 इन चरणों के साथ प्राप्त अनुकरणीय परिणाम दिखाता है। यदि ठीक से सील किया जाता है, तो यह नमूना तीन महीने तक चलना चाहिए।

2. पंप और स्टोक्स बीम का अनुकूलन

  1. लेजर पर स्विच करें, और इसे थर्मल संतुलन तक पहुंचने दें। जीडीडी = -6,000 एफएस2 के मौलिक बीम के लिए एक नकारात्मक समूह देरी फैलाव (जीडीडी) लागू करें।
    नोट: यह GDD मान सफलतापूर्वक ओपीओ ड्राइविंग के लिए महत्वपूर्ण है और इस सेटअप के लिए इष्टतम है लेकिन संभवतः विभिन्न प्रणालियों में भिन्न होगा। नकारात्मक जीडीडी को झंझरी जोड़े, प्रिज्म कंप्रेसर, या स्थानिक प्रकाश मॉड्यूलर28 के आधार पर पल्स शेपर्स के माध्यम से पेश किया जा सकता है।
  2. एक ध्रुवीकरण बीमप्लिटर (पीबीएस1) के साथ मौलिक लेजर को दो शाखाओं में विभाजित करें। संकीर्णबैंड स्टोक्स दालों को प्राप्त करने के लिए, एक ईटालोन के लिए 4 डब्ल्यू के साथ एक शाखा का मार्गदर्शन करें। थोड़ा एक संकीर्ण वर्णक्रमीय रेखा प्राप्त की है और पल्स स्पेक्ट्रम के शिखर पर केंद्रित है जब तक एटलॉन बारी बारी से ( चित्रा 2 में लाल वक्र देखें)।
    नोट: इस एटलॉन में 29 की प्रभावी चालाकी और 1,040 एनएम पर 29.8 एनएम की एक मुक्त-वर्णक्रमीय सीमा है।
  3. मॉडुलित स्टोक्स दालों को प्राप्त करने के लिए, संकीर्णबैंड बीम को एक एकोस्टो-ऑप्टिकल मॉड्यूलर में भेजें।
    नोट: जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, पहले क्रम के विवर्तित बीम 100% मॉडुलन का अनुभव करते हैं, जबकि शून्य-क्रम केवल 50% है। इसलिए, एक मजबूत अपरिवर्तित बीम के साथ नमूने को रोशन करने से बचने के लिए पहले क्रम को नियोजित करना बेहतर है जो किसी भी एसआरएस सिग्नल उत्पन्न किए बिना नमूना फोटोडैमेज को प्रेरित कर सकता है।
    1. मॉडुलन दक्षता को अनुकूलित करने के लिए, लेंस एफ1 और एफ 2 (चित्रा 4 बी)के बीच की दूरी को बदलें। एक फोटोडायोड के साथ मॉडुलित बीम को मापें और एक ऑसिलोस्कोप के साथ इसकी प्रोफ़ाइल रिकॉर्ड करें।
    2. एफ1 और एफ2 के बीच की दूरी को बदलें जब तक कि आयाम और ऑसिलोस्कोप रीडिंग की आधार रेखा के बीच अधिकतम विपरीत प्राप्त नहीं किया जाता है।
      नोट: लेंस की यह जोड़ी एक कोलिमेटर के रूप में काम नहीं करती है, बल्कि यह एओएम के क्रिस्टल पर एक प्रभावी फोकल स्पॉट बनाती है।
    3. स्टोक्स बीम की कमर को ठीक करने के लिए एक तीसरा लेंस एफ3 रखें, जिससे माइक्रोस्कोप के फोकल प्लेन पर इंटरैक्शन वॉल्यूम को बदल दिया जा सके और इसके परिणामस्वरूप, एसआरएस सिग्नल को अनुकूलित किया जा सके।
      नोट: स्टोक्स बीम इस प्रोटोकॉल में 1.6 मेगाहर्ट्ज पर संग्राहक किया गया था।
  4. लिथियम ट्राइबोरेट (एलबीओ) क्रिस्टल (एलबीओ1, θ = 90 डिग्री, φ = 13.8 डिग्री) पर मौलिक बीम की ऑप्टिकल शक्ति के शेष 6 डब्ल्यू पर ध्यान केंद्रित करें ताकि दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) (चित्रा 5 ए) के माध्यम से मौलिक बीम को आवृत्ति-दोगुना किया जा सके।
    1. एसएचजी दक्षता को अधिकतम करने के लिए, क्रिस्टल को थोड़ा घुमाएं, φ कोण (चित्रा 5 बी) को अलग-अलग करें। एसएचजी के कम से कम 2.5 डब्ल्यू प्राप्त करने के लिए एलबीओ1 का अनुकूलन करें।
  5. सिग्नल बीम की पीढ़ी दक्षता को अधिकतम करने के लिए एलबीओ2 के φ कोण को समायोजित करें।
    नोट: लेंस एफ1, एफ2, और एफ3 की फोकल लंबाई को ओपीओ गुहा के साथ एसएचजी बीम को मोड-मैच करने के लिए सावधानीपूर्वक चुना गया था। इस प्रकार, इन लेंसों की फोकल लंबाई अलग-अलग सेटअप में भिन्न होगी। ओपीओ गुहा में अवशिष्ट फैलाव के कारण, गुहा की लंबाई में मामूली बदलाव सिग्नल बीम के स्पेक्ट्रम की शिफ्ट को प्रेरित करता है।
    1. एक पंप स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए गुहा की लंबाई को समायोजित करें, जो 1,040 एनएम पर संकीर्णबैंड स्टोक्स के साथ मिलकर, 1,373-5,090 सेमी -1 के भीतर आवृत्ति डिट्यूनिंग का उत्पादन कर सकता है। इस सीमा में सीएच स्ट्रेचिंग स्पेक्ट्रल क्षेत्र (2,800-3,050 सेमी -1) में कंपन शामिल हैं। चित्रा 2 में नीले स्पेक्ट्रा देखें।
  6. उत्तेजना माइक्रोस्कोप उद्देश्य द्वारा प्रेरित फैलाव प्रभाव ों की भरपाई करने के लिए, ब्रॉडबैंड पंप को प्रिज्म कंप्रेसर में भेजें। अपने शीर्ष के माध्यम से प्रिज्म ए में पंप दर्ज करें और प्रिज्म बी के शीर्ष की ओर बिखरे हुए पंप का मार्गदर्शन करें आवश्यक नकारात्मक फैलाव की मात्रा को परिभाषित करें, और फिर तदनुसार प्रिज्म के एपिस एल के बीच की दूरी निर्धारित करें।
    नोट: चित्रा 6 प्रिज्म29 की व्यवस्था को दर्शाता है। इस मामले में, मुआवजा जीडीडी ≈ -12,800 एफएस2 के लिए निर्धारित किया गया था; इसलिए L = 1.26 मीटर।
    1. ब्रूस्टर-कट प्रिज्म का उपयोग करें।
      1. सुनिश्चित करें कि पंप बीम का ध्रुवीकरण प्रिज्म के त्रिकोणीय विमानों (ऊपर /
      2. सुनिश्चित करें कि पंपबीम में घटना कोण θ ब्रूस्टर-कोण से मेल खाता है।
      3. सुनिश्चित करें कि प्रिज्म ए का निकास चेहरा प्रिज्म बी के प्रवेश चेहरे के समानांतर है।
    2. क्षतिपूर्ति के लिए ब्रॉडबैंड पल्स के जीडीडी का अनुमान लगाने के लिए, एसआरएस सिग्नल को एक तरंग दैर्ध्यλ 1 पर मापें, पंप-स्टोक्स के बीच समय की देरीπ 1 को रिकॉर्ड करें, जिस पर अधिकतम एसआरएस (π1) प्राप्त किया जाता है। एक दूसरे तरंग दैर्ध्य λ2 के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं, फिर से समय देरीπ 2 को पंजीकृत करें जिस पर एसआरएस (π2) अधिकतम था।
      नोट: क्योंकि जीडीडी को कोणीय आवृत्ति के संबंध में समूह देरी के व्युत्पन्न के रूप में परिभाषित किया गया है, उपर्युक्त माप ब्रॉडबैंड बीम (ईक्यू [1]) के जीडीडी के अनुमान की अनुमति देते हैं।
      Equation 1(1)
  7. 2 तरंगप्लेट का उपयोग करके, पंप बीम के ध्रुवीकरण को 45 डिग्री पर सेट करें। ध्रुवीकृत पंप को 13.3 मिमी की लंबाई के साथ वाईवीओ4 प्लेट में गाइड करें, इस बायरेफ्रिंजेंट क्रिस्टल ऊर्ध्वाधर की तेज धुरी स्थापित करें।
    नोट: वाईवीओ4 प्लेट के माध्यम से यात्रा करने पर, पंप दालों को दो ऑर्थोगोनल रूप से ध्रुवीकृत प्रतिकृतियों में विभाजित किया जाएगा जो कोलिलेट्स का प्रचार करते हैं, लेकिन उनके बीच 10 पीएस ≈ देरी रखते हैं। यह देरी मोटाई और बायरेफ्रिंजेंट क्रिस्टल के अपवर्तक सूचकांक का एक कार्य है। इसके बाद, स्टोक्स दालों के एक ही ध्रुवीकरण राज्य के साथ पंप प्रतिकृतियों को "सिग्नल" कहा जाएगा, जबकि "संदर्भ" के रूप में ऑर्थोगोनल राज्य वाले लोग। इस तकनीक का विवरण, जिसे इनलाइन संतुलित पहचान कहा जाता है, को पहले30 से वर्णित किया गया है।
  8. पंप और स्टोक्स बीम को एक डिक्रोइक दर्पण के साथ मिलाएं और फ्लोरोसेंट पिनहोल की एक जोड़ी का उपयोग करके उन्हें सावधानीपूर्वक संरेखित करें, यह सुनिश्चित करें कि दोनों कोलीलेंस का प्रचार करते हैं। बीम को क्षीण करें और उन्हें तेज (कम से कम 100 मेगाहर्ट्ज बैंडविड्थ) फोटोडायोड पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक लेंस का उपयोग करें।
    1. पंप को ब्लॉक करें और उच्च बैंडविड्थ डिजिटल ऑसिलोस्कोप के साथ एकल स्टोक्स दालों को मापें। आस्टसीलस्कप के माप के लिए घड़ी स्रोत के रूप में लेजर के ट्रिगर सिग्नल का उपयोग करें। माध्य मान ज्ञात कीजिये जिस पर फोटोडायोड वोल्टेज अपने अधिकतम तक पहुँचता है।
    2. स्टोक्स बीम को ब्लॉक करें और पंप दालों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। पंप (स्टोक्स) बीम के ऑप्टिकल पथ को बढ़ाएं या कम करें जब तक कि इसकी दालें स्टोक्स (पंप) दालों के समान समय में लगभग न पहुंच जाएं।
      नोट: यह दो हथियारों के बीच ऑप्टिकल पथ अंतर के मिलान में अधिकतम पर कुछ मिलीमीटर की सटीकता की गारंटी देनी चाहिए।
    3. फोटोडायोड को हटा दें और पंप-स्टोक्स फोटॉनों के बीच योग-आवृत्ति पीढ़ी (एसएफजी) के लिए एक उपयुक्त कट कोण के साथ एक गैर-रेखीय क्रिस्टल रखें।
      नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले नॉनलाइनर क्रिस्टल को टाइप आई चरण मिलान के लिए काटा गया था, θ = 90 °, φ = 9.8 °। नॉनलाइनर क्रिस्टल का ऑप्टिकल अक्ष स्टोक्स और सिग्नल दालों के ध्रुवीकरण के समानांतर होना चाहिए।
    4. स्टोक्स बीम को थोड़ा गैर-संरेखित बनाएं और एसएफजी तक देरी लाइन को स्थानांतरित करें, एक संकेत जो चरण मिलान के कारण, पंप और स्टोक्स बीम के एसएचजी के बीच है। यदि सिग्नल नहीं मिलता है, तो क्रिस्टल पर दो बीम के स्थानिक ओवरलैप को सत्यापित करें।
      नोट: एसएफजी नीले-स्थानांतरित हो गया है और नग्न आंखों को आसानी से दिखाई देना चाहिए।
    5. अप्रत्याशित कठिनाइयों के मामले में, पंप और स्टोक्स और उनके संबंधित एसएचजी को हटाने और स्पेक्ट्रोमीटर (चित्रा 7 ए) के साथ एसएफजी को मापने के लिए एक कम पास फ़िल्टर रखें। उस समय की देरी का पता लगाएं जिस पर एसएफजी अपनी अधिकतम तीव्रता तक पहुंचता है, एक मूल्य जो गैर-रेखीय सिग्नल पीढ़ी के लिए आवश्यक आदर्श स्पैटिओटेम्पोरल ओवरलैप निर्धारित करता है, और वहां देरी रेखा को ठीक करता है (चित्रा 7 बी)।
  9. एक कैलिब्रेटेड कैमरे के साथ बीम प्रोफाइल को मापें। वैकल्पिक रूप से, एक अवरक्त कार्ड का उपयोग करें और आंख से व्यास का अनुमान लगाएं। दो दूरबीनों का उपयोग करें, एक पंप के लिए और दूसरा स्टोक्स बीम के लिए। इन दूरबीनों के साथ, उत्तेजना उद्देश्य के पीछे एपर्चर के लिए बीम व्यास से मेल खाने का प्रयास करें।
    नोट: यह प्रक्रिया सेटअप के अधिकतम स्थानिक रिज़ॉल्यूशन की गारंटी देगी।
    1. एक बार एसआरएस सिग्नल प्राप्त होने के बाद, पंप बीम पर दूरबीन का उपयोग इसके व्यास को ट्विक करने के लिए करें, इसकी रेले रेंज को अलग-अलग करें और इसके परिणामस्वरूप, माइक्रोस्कोप के फोकस पर इंटरैक्शन वॉल्यूम। अधिकतम SRS प्राप्त किया जाता है, जब बंद करो।
  10. पंप (स्टोक्स) बीम की तीव्रता को मापने के लिए एक फोटोडायोड का उपयोग करें और, फोटोडायोड की जिम्मेदारी के साथ, डिटेक्टर के सक्रिय क्षेत्र पर औसत शक्ति Equation 2 की गणना करें।
    1. यदि उच्च बैंडविड्थ फोटोडायोड का उपयोग कर रहे हैं, तो केवल निरंतर या डीसी घटक प्राप्त करने के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक कम-पास फ़िल्टर कनेक्ट करें। πP (f) को मापने के लिए, लॉक-इन एम्पलीफायर के इनपुट के लिए एक उच्च बैंडविड्थ फोटोडायोड (कम पास फ़िल्टर डिस्कनेक्ट करें) के आउटपुट को कनेक्ट करें। लॉक-इन आउटपुट को विभिन्न डिमोडुलेशन आवृत्तियों पर स्टोर करें, और वी से डब्ल्यू में Equation 3 परिवर्तित करने के लिए फोटोडायोड की जवाबदेही का उपयोग करें।
      नोट: वाणिज्यिक लॉक-इन एम्पलीफायरों में δP (f) को मापने के लिए अंतर्निहित उपकरण होते हैं (उदाहरण के लिए, ज़्यूरिख इंस्ट्रूमेंट्स को लैबवन ए फ्रीक्वेंसी स्वीपर31 में शामिल किया गया है)।
    2. बीम के आरआईएन को मापने के बाद, लेजर को बंद करें और इलेक्ट्रॉनिक शोर को मापें (यानी, आरआईएन डिटेक्टरों पर किसी भी प्रकाश के बिना गणना की गई)।
      नोट: बशर्ते कि आरआईएन लेजर उतार-चढ़ाव से सीमित है और शॉट-शोर से नहीं, यह अंधेरा माप माप के लिए नियोजित इंस्ट्रूमेंटेशन का निदान करने में मदद करेगा; यदि इलेक्ट्रॉनिक शोर लेजर के आरआईएन जितना अधिक है, तो इसका उपयोग लेजर के आरआईएन को मापने के लिए नहीं किया जा सकता है; इलेक्ट्रॉनिक शोर को कम करने के लिए अल्ट्रालो-शोर-एम्पलीफायरों का उपयोग करना पड़ सकता है।
    3. यदि आरआईएन शॉट-शोर द्वारा सीमित है और लेजर उतार-चढ़ाव से नहीं, तो डिटेक्टर पर अधिक ऑप्टिकल शक्ति चमकें। चित्र 8 देखें।

3. एसआरएस इमेजिंग के लिए वर्णक्रमीय पहचान की स्थापना

  1. माइक्रोस्कोप के लिए पंप और स्टोक्स बीम गाइड।
  2. अनुभाग 1 में चर्चा किए गए नमूने को रखें, और पंप बीम को संरेखित करने में मदद करने के लिए मोतियों के बिना एक क्षेत्र ढूंढें। एक कैमरे का उपयोग करके, पंप (स्टोक्स) को अवरुद्ध करते समय स्टोक्स (पंप) बीम के प्रतिबिंबित प्रोफ़ाइल को मापें। माइक्रोस्कोप से ठीक पहले दर्पण के साथ लेजर स्पॉट की स्थिति को समायोजित करें।
    नोट: उच्चतम एसआरएस पीढ़ी प्राप्त करने के लिए, उन्हें पूरी तरह से ओवरलैप करना चाहिए। चित्रा 9 (ए) पंप, (बी) स्टोक्स, और (सी) दोनों बीम पूरी तरह से माइक्रोस्कोप के फोकल विमान पर ओवरलैप दिखाता है।
  3. उत्तेजना और संग्रह उद्देश्यों को कॉन्फोकल बनाएं।
    नोट: अनंत-सही उद्देश्यों के उपयोग का मतलब है कि नमूना विमान पर पंप पर ध्यान केंद्रित करने के परिणामस्वरूप संग्रह उद्देश्य के पीछे एपर्चर पर एक कोलिमेटेड बीम होगा।
    1. मॉडुलित स्टोक्स को हटाने के लिए एक शॉर्ट-पास फ़िल्टर डालें और पंप बीम को झंझरी में मार्गदर्शन करें। डिटेक्टरों पर छितरी हुई बीम पर ध्यान केंद्रित करने के लिए झंझरी के बाद एक लेंस रखें।
      नोट: झंझरी समीकरण रैखिक फैलाव को निर्धारित करने में मदद करेगा (यानी, किसी दिए गए फोकल लंबाई एफ32 के लेंस के साथ डिटेक्टर विमान पर प्रति मिमी कितने एनएम)। झंझरी समीकरण झंझरी की नाली आवधिकता डी , α घटना का कोण, β विवर्तन कोण, विवर्तित तरंगदैर्ध्य λ, और विवर्तन क्रम एम (समीकरण [2]) से संबंधित है।
      Equation 4 (2)
  4. संतुलित पहचान के लिए, संदर्भ के स्पेक्ट्रम और पंप बीम के साथ प्रचारित सिग्नल प्रतिकृतियों को मापें।
    नोट: झंझरी के बाद पंप बीम की स्थानिक प्रोफ़ाइल एक लाइन है जिसमें इसकी लंबाई के साथ ब्रॉडबैंड पंप के विभिन्न वर्णक्रमीय घटक शामिल हैं। पंप लाइन के प्रत्येक वर्णक्रमीय घटक को एक गोलाकार लेंस द्वारा दूरी एफ पर केंद्रित किया जाएगा (चरण 3.1-3.2 देखें)।
    1. छितरी हुई पंप को काटने से बचने के लिए, गोलाकार लेंस को झंझरी के जितना संभव हो उतना करीब रखें। पंप प्रतिकृतियों को अलग करने के लिए गोलाकार लेंस के ठीक बाद एक पीबीएस रखो।
      नोट: यहां, एक ध्रुवीकरण घन बीम स्प्लिटर का उपयोग किया गया था क्योंकि इस तरह का ध्रुवीकरण पंप बीम के ध्रुवीकरण को स्क्रैम्बल नहीं करता है। यह प्रभावी रूप से विभिन्न पंप प्रतिकृतियों को भी अलग करता है और ब्रॉडबैंड पंप को क्लिप करने से बचने के लिए काफी बड़ा हो सकता है। पीबीएस सिग्नल प्रतिकृति (एस-ध्रुवीकृत) को प्रतिबिंबित करेगा और संदर्भ प्रतिकृति (पी-ध्रुवीकृत) को प्रसारित करेगा।
    2. स्टीयरिंग दर्पण की एक जोड़ी के साथ, सिग्नल और उनके संबंधित डिटेक्टरों (चित्रा 1) के संदर्भ का मार्गदर्शन करें।
      नोट: आदर्श संतुलित कॉन्फ़िगरेशन में, सिग्नल और संदर्भ प्रतिकृतियों में एक ही ऑप्टिकल शक्ति होनी चाहिए।
    3. पंप बीम में शोर को हटाने के लिए, संदर्भ डिटेक्टर में अपने समकक्षों के साथ सिग्नल को मापने वाले फोटोडायोड सरणी के चैनलों को सहसंबंधित करें। इसलिए, सुनिश्चित करें कि सिग्नल और संदर्भ फोटोडायोड सरणियों के एनवें फोटोडायोड सिग्नल और संदर्भ प्रतिकृतियों के एक ही वर्णक्रमीय घटक की ऑप्टिकल शक्ति को मापते हैं।
      नोट: चित्रा 8 अनुकरणीय आरआईएन स्पेक्ट्रा से पता चलता है।
  5. दो फोटोडायोड सरणियों के बीच वर्णक्रमीय मिलान की गारंटी देने के लिए, छितरी हुई पंप को स्थानिक रूप से फ़िल्टर करने के लिए झंझरी और पीबीएस के बीच एक छोटा सा भट्ठा या एक आईरिस रखें। संदर्भ और सिग्नल फोटोडायोड सरणियों के एन वें डिटेक्टर पर संचरित किरणों को केंद्र में रखने के लिए पंप प्रतिकृतियों के सभी लेकिन एकवर्णक्रमीय घटक को क्लिप करें। विभिन्न पहचान चैनलों के सहसंबंध को समायोजित करने के लिए उल्लिखित स्टीयरिंग दर्पण का उपयोग करें।
  6. इस बिंदु पर, एसआरएस माइक्रोस्कोपी शुरू करें। ऐसा करने के लिए, स्टोक्स को संशोधित करें, रास्टर-नमूने को स्कैन करें, और प्रत्येक पिक्सेल से सामान्यीकृत एसआरएस (ΠI / I) स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए अपने संबंधित डीसी स्पेक्ट्रम (आई) के साथ पंप स्पेक्ट्रम (ΠI) पर मॉडुलन हस्तांतरण प्राप्त करें। तीन आयामी मैट्रिक्स का उत्पादन करें जिनकी पंक्तियों (एक्स) और कॉलम (वाई) में नमूने की स्कैन की गई स्थिति होती है। एक्स-वाई विमान के लिए प्रत्येक वेक्टर (जेड) ओर्थोगोनल पर, एक एसआरएस स्पेक्ट्रम स्टोर करें।
    नोट: चित्रा 12 एसआरएस हाइपरस्पेक्ट्रल डेटा की संरचना को दर्शाता है।
    1. स्टोक्स बीम की शक्ति को 65 मेगावाट और ब्रॉडबैंड पंप बीम की शक्ति को 20 मेगावाट तक सेट करें। प्रयोगों के लिए एक आदर्श एकीकरण समय निर्धारित करें।
      नोट: यहाँ, एकीकरण समय 44 μs था; हालांकि, धीमी गति से पीजो स्कैनर के कारण पिक्सेल निवास समय 1 एमएस था।

4. हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस डेटा के केमोमेट्रिक्स

  1. नमूने के विभिन्न रासायनिक घटकों को विसर्जित करने के लिए बहुभिन्नरूपी वक्र संकल्प विश्लेषण का उपयोग करें। टॉलर, डी जुआन और जौमोट33 में लिंक से जीयूआई डाउनलोड करें।
    नोट: यहां, बहुभिन्नरूपी वक्र रिज़ॉल्यूशन-वैकल्पिक कम से कम वर्ग (एमसीआर-एएलएस) टॉलर और सहकर्मियों द्वारा विकसित मैटलैब कार्यक्रमका उपयोग 34,35 किया गया था। एसआरएस डेटा के लिए एमसीआर-एएलएस के अनुप्रयोगों के लिए, 36,37 देखें; एल्गोरिथ्म पर विस्तृत चर्चा के लिए, 38 देखें।
  2. मैटलैब में, एसआरएस हाइपरस्पेक्ट्रल डेटा क्यूब को एसआरएस स्पेक्ट्रा युक्त अपनी पंक्तियों के साथ मैट्रिक्स डी में फिर से आकार दें। मान लें कि सामने आया एसआरएल हाइपरक्यूब डी नमूना के रासायनिक घटकों की एकाग्रता सी और वर्णक्रमीय प्रोफाइल एस का एक रैखिक संयोजन है (यानी, डी = सीएस टी + ई, जहां ई एक मैट्रिक्स है जिसमें प्रयोगात्मक त्रुटि होती है, और सुपरस्क्रिप्ट टी मैट्रिक्स ट्रांसपोज़ को इंगित करता है)।
  3. सी और एस को अलग करने के लिए डेटा के मुख्य घटकों को प्राप्त करें। जैसा कि यह एक प्राथमिकता के रूप में जाना जाता है कि धारा 1 में चर्चा किए गए नमूने में चार प्रजातियां शामिल हैं, अर्थात् डीएमएसओ, जैतून का तेल, पीएमएमए और पीएस, कार्यक्रम को चार प्रजातियों की खोज करने के लिए कॉन्फ़िगर करें और पृष्ठभूमि शोर के लिए खाते में एक और। यदि प्रजातियों की उच्च या निम्न संख्या के साथ एक अलग नमूना है, तो तदनुसार कार्यक्रम को कॉन्फ़िगर करें।
    नोट: कार्यक्रम वर्णक्रमीय डेटा का एक विलक्षण-मूल्य अपघटन बनाता है, उन्हें शुद्ध स्पेक्ट्रा एस के प्रारंभिक अनुमानों के रूप में उपयोग करता है।
    1. वैकल्पिक रूप से, ज्ञात वर्णक्रमीय निशान (उदाहरण के लिए, पदार्थों के सहज रमन स्पेक्ट्रा) युक्त मैट्रिक्स के साथ कार्यक्रम को खिलाएं।
      नोट: शुद्ध स्पेक्ट्रा के प्रारंभिक अनुमानों का उपयोग करते हुए, कार्यक्रम सी = डीएस (एसटीएस) -1 और एसटी = (सीटीसी) -1सीटीडी की गणना करेगा। सी और एस के नए मूल्यों को एक वैकल्पिक कम से कम वर्गों एल्गोरिथ्म के साथ अनुकूलित किया जाता है।
  4. चूंकि एसआरएस एक गैर-नकारात्मक संकेत है, इसलिए केवल सकारात्मक मूल्यों को वितरित करने के लिए वैकल्पिक कम से कम वर्ग एल्गोरिदम को बाधित करें।
    नोट: अनुकूलित सी और एस एक नया मैट्रिक्स डी * = सीएसटी, एक डेटा सेट बनाने की अनुमति देगा जो प्रोग्राम मूल डेटा डी के खिलाफ तुलना करेगा। कार्यक्रम स्वचालित रूप से इन चरणों को तब तक पुनरावृत्त करता है जब तक कि डी * और डी के बीच का अंतर एक मनमाना थ्रेशोल्ड मान से कम न हो जिसे परिभाषित किया जा सकता है।
  5. प्लॉट सी और एस रासायनिक छवियों और नमूने के रासायनिक घटकों की विशेषता स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए।

Representative Results

चित्रा 3 पीएस, पीएमएमए और जैतून का तेल के साथ इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त अनुकरणीय परिणाम दिखाता है। एलबीओ1 का यह रोटेशन एसएचजी क्षेत्र द्वारा अनुभव किए गए अपवर्तक सूचकांक को बदल देगा, सीधे इसके चरण वेग को संशोधित करेगा। जब एसएचजी क्षेत्र का चरण वेग एलबीओ 1 में प्रेरित गैर-रेखीय ध्रुवीकरण से मेलखाता है, तो गैर-रेखीय रूप से उत्पन्न क्षेत्र और गैर-रेखीय ध्रुवीकरण चरण में होगा, जिससे तीव्र एसएचजी विकिरण होगा। दूसरे शब्दों में, एलबीओ1 के φ कोण को ट्विक करने से उपयोगकर्ता को एसएचजी के लिए आदर्श चरण मिलान की स्थिति प्राप्त करने की अनुमति मिलेगी। जैसा कि यहां एक प्रकार मैं चरण मिलान क्रिस्टल का उपयोग किया जाता है, एसएचजी बीम का ध्रुवीकरण मौलिक बीम (चित्रा 5 बी) के लिए ओर्थोगोनल होगा।

चित्रा 8 इस प्रोटोकॉल और शॉट-शोर सीमा में उपयोग किए जाने वाले ऑप्टिकल स्रोतों के आरआईएन को दर्शाता है, जो इलेक्ट्रॉनों और फोटॉनों की क्वांटम प्रकृति का परिणाम है जो लेजर शोर के लिए एक मौलिक सीमा निर्धारित करता है। शॉट-शोर सीमित आरआईएन की गणना ईक्यू (3) द्वारा दिखाए गए अनुसार की जाती Equation 5 है।

Equation 6 (3)

जहां एच प्लैंक का स्थिरांक है, और ν ऑप्टिकल आवृत्ति है। इस प्रकार, शॉट शोर इलेक्ट्रॉनिक्स डिजाइन के लिए उपयोगी दिशानिर्देश प्रदान करता है।

चित्रा 11 ए और चित्रा 11 सी संतुलित और असंतुलित स्पेक्ट्रा के अनुकरणीय डेटा दिखाते हैं। स्वाभाविक रूप से, संतुलित पहचान के प्रभाव प्रयोगों के अंतिम परिणामों को प्रभावित करते हैं, अर्थात्, रासायनिक मानचित्र। चित्रा 11 बी और चित्रा 11 डी क्रमशः असंतुलित और संतुलित स्थितियों में समग्र छवियों को दिखाते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक लागू करने से एक विषम नमूने के विभिन्न रासायनिक घटकों की पहचान करने और स्थानीयकरण करने और उनकी विशेषता एसआरएस स्पेक्ट्रा निकालने में मदद मिलेगी। केमोमेट्रिक विश्लेषण के लिए चित्रा 12 के हाइपरस्पेक्ट्रल डेटा के अधीन चित्रा 13 देता है। चित्रा 13 ए नमूने के विभिन्न रासायनिक घटकों के एकाग्रता मानचित्रों का एक समग्र दिखाता है, जबकि चित्रा 13 बी उनकी विशेषता एसआरएस स्पेक्ट्रा दिखाता है। ध्यान दें कि चित्रा 13 ए में दिखाए गए डेटा न केवल उपयोगकर्ता को नमूने के विभिन्न घटकों की आसानी से पहचान करने की अनुमति देते हैं बल्कि अधिक मात्रात्मक विश्लेषण करने की भी अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, एकाग्रता मानचित्रों का उपयोग करके, हम प्रत्येक रासायनिक प्रजातियों की आंशिक एकाग्रता के माध्य की गणना कर सकते हैं: 38% डीएमएसओ, 25% पीएमएमए, 14% पीएस, और 22% जैतून का तेल।

Figure 1
चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल में नियोजित ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोप के योजनाबद्ध। संक्षेप: पीबीएसएक्स = ध्रुवीकरण बीमप्लिटर; एसएचजी = दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी मॉड्यूल; ओपीओ = ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला; एओएम = एकोस्टो ऑप्टिक मॉड्यूलेटर; एसपीएफ़ = शॉर्ट-पास फ़िल्टर; एम-एलआईए: मल्टीचैनल लॉक-इन एम्पलीफायर; डीएम = डाइक्रोइक दर्पण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ट्यून करने योग्य ब्रॉडबैंड पंप (नीला) और नैरोबैंड (लाल) स्टोक्स बीम का स्पेक्ट्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: रासायनिक विषम नमूने की ब्राइटफील्ड छवि। ध्यान दें कि पारंपरिक माइक्रोस्कोपी विभिन्न घटकों को प्रतिष्ठित होने की अनुमति नहीं देती है। स्केल बार = 100 μm। संक्षेप: पीएस = पॉलीस्टीरिन; पीएमएमए = पॉलीमिथाइल मेथाक्रिलेट; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: संकीर्ण बैंड स्टोक्स दालों का मॉडुलन(ए) पारदर्शी नीला ट्रेस 0वें विवर्तित बीम को दर्शाता है, जबकि काला एक संबंधित 1सेंट क्रम दिखाता है। (बी) उत्तेजना उद्देश्य पर पहुंचने से पहले 1वें ऑर्डर डिफ्रेक्टेड बीम की मॉडुलन दक्षता और स्टोक्स बीम के स्पॉट आकार के फाइनट्यूनिंग के अनुकूलन के लिए ऑप्टिकल सेटअप। संक्षेप: एओएम = एकोस्टो ऑप्टिक मॉड्यूलेटर; एफएक्स = लेंस एक्स की फोकल लंबाई कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ओपीओ को चलाने के लिए आवश्यक गैर-रेखीय ऑप्टिकल प्रक्रियाएं (ए) एसएचजी इंटरैक्शन की ज्यामिति। 1 पर दो मौलिक फोटॉन सामग्री प्रणाली को एक उच्च ऊर्जा आभासी स्तर पर लाते हैं, जहां से सामग्री प्रणाली जमीन की स्थिति में छलांग लगाती है,π एसएचजी पर एक फोटॉन उत्सर्जित करती है। (ख) एसएचजी प्रयोग की योजना। (सी) एसएचजी और ओपीओ सेटअप का एक योजनाबद्ध। (डी) डीएफजी इंटरैक्शन की ज्यामिति। एकω एसएचजी फोटॉन को सिग्नल (ωसिग्नल) और आइडलर (ω आइडलर) फोटॉनों में विभाजित किया जाता है। सिग्नल बीम का लाभ सिग्नल फोटॉनों को वापस खिलाकर और उन्हें गुहा में प्रतिध्वनित करके प्राप्त किया जाता है। (ई) डीएफजी प्रयोग की योजना। संक्षेप: एसएमएक्स = गोलाकार दर्पण (आर = 75 मिमी); ओपीओ = ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला; एसएचजी = दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी मॉड्यूल; डीएफजी = अंतर-आवृत्ति पीढ़ी; एलबीओ = लिथियम ट्राइबोरेट; ओसी = तेल कंडेनसर; डीएम = डाइक्रोइक दर्पण; एफएक्स = लेंस एक्स की फोकल लंबाई कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: प्रिज्म कंप्रेसर की ज्यामिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: स्पैटिओटेम्पोरल ओवरलैप को अनुकूलित करने के लिए योग-आवृत्ति पीढ़ी (ए) पंप और स्टोक्स के बीच एसएफजी और उनके संबंधित एसएचजी एक स्क्रीन पर घुसपैठ करते हैं। यहां, एक लेंस ने पंप और स्टोक्स बीम को क्रिस्टल पर केंद्रित किया, जबकि एक कम-पास फ़िल्टर ने उन्हें हटा दिया। (बी) समय की देरी के एक समारोह के रूप में पंप और स्टोक्स के बीच एसएफजी की तीव्रता। एसएफजी को अधिकतम करने वाली स्थिति में एसआरएस सेटअप का समय शून्य सेट करें। बी में क्रॉस-सहसंबंध की विषमता स्टोक्स बीम पर एटलॉन के कारण अस्थायी प्रोफ़ाइल के कारण होती है। संक्षेप: एसएफजी = योग-आवृत्ति पीढ़ी; एसएचजी = दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी मॉड्यूल; एसआरएस = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन स्पेक्ट्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: आरआईएन स्पेक्ट्रा। हरे रंग में हाइलाइट किया गया बैंड एसआरएस प्रयोगों के लिए सबसे अच्छा वर्णक्रमीय क्षेत्र दिखाता है। इस बैंड के भीतर किसी भी आवृत्ति पर स्टोक्स बीम को संशोधित करना गारंटी देता है कि एसआरएस सिग्नल पर लेजर शोर के प्रभाव सबसे कम संभव होंगे। संक्षेप: आरआईएन = सापेक्ष तीव्रता शोर; एसआरएस = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन स्पेक्ट्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: बीम प्रोफाइल (ए) पंप, (बी) स्टोक्स, और (सी) पंप और स्टोक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्र 10: एक फैलाव झंझरी और एक फोटोडायोड सरणी डिटेक्टर के लिए ज्यामिति ग्रहण की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 11
चित्रा 11. संतुलित पहचान के प्रभाव। स्पेक्ट्रा (ए, सी) और रासायनिक छवियों (बी, डी) पर प्रभाव। पैनलों (बी) और (डी) में दिखाए गए कंपोजिट प्रयोगों के अंतिम परिणाम हैं (यानी, हाइपरस्पेक्ट्रल डेटा के कीमोमेट्रिक विश्लेषण के बाद)। विवरण के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग 4 देखें)। स्केल बार = 10 μm। संक्षिप्त नाम: एसआरएस = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन स्पेक्ट्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 12
चित्रा 12: ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी के साथ अधिग्रहित एक प्रतिनिधि एसआरएस हाइपरक्यूब। एक्स-वाई विमान स्कैन किए गए पदों के निर्देशांक को संग्रहीत करता है, जबकि जेड के साथ प्रत्येक वेक्टर एक एसआरएस स्पेक्ट्रम पंजीकृत करता है। संक्षिप्त नाम: एसआरएस = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन स्पेक्ट्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 13
चित्रा 13: हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस डेटा का केमोमेट्रिक विश्लेषण (ए) नमूने के विभिन्न घटकों के एकाग्रता मानचित्रों का समग्र। (बी) रासायनिक प्रजातियों की विशेषता स्पेक्ट्रा। दोनों पैनलों में, पीला: जैतून का तेल, नीला: डीएमएसओ, सियान: पीएस, और नारंगी: पीएमएमए। स्केल बार = 20 μm (A)। संक्षेप: एसआरएस = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन स्पेक्ट्रोस्कोपी; पीएस = पॉलीस्टीरिन; पीएमएमए = पॉलीमिथाइल मेथाक्रिलेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक है जो एक विषम नमूने के रासायनिक घटकों की पहचान करने और विसर्जित करने के लिए प्रामाणिक रासायनिक विपरीत प्रदान करती है। इस विश्लेषणात्मक उपकरण की क्षमता कई शोध क्षेत्रों के लिए फायदेमंद हो सकती है, जिसमें सामग्री विज्ञान से लेकर हिस्टोपैथोलॉजी तक शामिल हैं। ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी का नकारात्मक पक्ष यह तथ्य है कि यह तकनीकी रूप से मांग कर रहा है; प्रयोगकर्ता को न केवल ब्रॉडबैंड लेजर स्रोतों पर पता होना चाहिए, बल्कि एसआरएस को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए लेजर दालों में हेरफेर करने की भी आवश्यकता है, एक संकेत जो बदले में, परिष्कृत पहचान योजनाओं के साथ मापा जाना चाहिए। यह पेपर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो मल्टीप्लेक्स ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मिश्रित रासायनिक यौगिकों के रासायनिक मानचित्रों का उत्पादन करने के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। यद्यपि वर्णित कार्य कुछ लेजर भौतिकविदों और गैर-रेखीय माइक्रोस्कोपिस्टों के लिए तुच्छ हो सकता है, लेकिन ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी के लाभों में रुचि रखने वाले पाठकों के लिए यह मामला नहीं हो सकता है, जिनका वैज्ञानिक ज्ञान इन डोमेन के बाहर रहता है। इसलिए, हमने ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी में रुचि रखने वाले व्यापक दर्शकों का मार्गदर्शन करने के लिए हर कदम का विस्तार करने का लक्ष्य रखा।

हाथ में प्रोटोकॉल कई मजबूत और प्रसिद्ध रमन प्रकीर्णकों से बना एक सरल अभी तक स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से समृद्ध नमूना तैयार करने के तरीके को दिखाकर शुरू हुआ। हमने चर्चा की कि एसआरएस माइक्रोस्कोप स्थापित करने के लिए आवश्यक ब्रॉडबैंड पंप और नैरोबैंड स्टोक्स बीम कैसे प्राप्त करें। चित्रा 5 सी एसएचजी और ओपीओ सेटअप की एक योजना दिखाता है। ध्यान दें कि लेंस एफ1 एसएचजी उत्पन्न करने के लिए एलबीओ1 पर मौलिक बीम पर केंद्रित है, जबकि एक डिक्रोइक दर्पण एसएचजी विकिरण को दर्शाता है और अवशिष्ट मौलिक बीम को प्रसारित करता है। एक दूसरा लेंस एफ2 एसएचजी बीम को जोड़ता है। जैसा कि एफ2 एफ1 > है, एसएचजी बीम को एफ2/एफ1 के बराबर कारक द्वारा विस्तारित किया जाता है। एक तीसरा लेंस एफ3 विस्तारित एसएचजी बीम को दूसरे प्रकार I एलबीओ क्रिस्टल (एलबीओ2) पर केंद्रित करता है जो π = 90 ° और φ = 29.0 ° पर काटा जाता है। उपर्युक्त एसजीएच (520 एनएम) के साथ एलबीओ 2 पंप करके, 680-910 एनएम रेंज के भीतर विकिरण एलबीओ2 से अंतर-आवृत्ति पीढ़ी (डीएफजी) के माध्यम से उभरेगा, दो बीम का उत्पादन करेगा: सिग्नल और आइडलर27 (चित्रा 5 डी, ई)। उत्तरार्द्ध को त्याग दिया जाता है जबकि पूर्व को एसआरएस प्रयोगों में नियोजित पंप दालों को वितरित करने के लिए ओपीओ गुहा में प्रवर्धित किया जाता है। 520 एनएम पर ओपीओ का पंप, अर्थात्, एसएचजी बीम, एसआरएस प्रयोगों (यानी, ओपीओ के सिग्नल बीम) के पंप के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए।

एसआरएस माइक्रोस्कोपी में इसके विपरीत माइक्रोस्कोप के फोकल स्पॉट पर उत्पन्न एक गैर-रेखीय संकेत से उत्पन्न होता है, एक संकेत जो किसी दिए गए समय पर नमूना विमान में बड़ी संख्या में फोटॉनों को सीमित करने की मांग करता है। यह फोटॉन कारावास एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) माइक्रोस्कोप उद्देश्य के साथ प्राप्त किया जाता है, लेंस की एक सरणी जो सिस्टम के स्थानिक संकल्प को भी सेट करती है: एनए जितना अधिक होगा, स्थानिक संकल्प उतना ही अधिक होगा। हालांकि, उच्च एनए उद्देश्यों को कांच के साथ घनी पैक किया जाता है, जो स्पंदित विकिरण के लिए सकारात्मक जीडीडी का परिचय देता है, एक आवृत्ति चहचहाना जो अंततः दालों39 के अस्थायी प्रोफ़ाइल को व्यापक बनाता है। इस प्रकार, माइक्रोस्कोप उद्देश्य द्वारा पेश किए गए जीडीडी ब्रॉडबैंड पंप दालों की अवधि को बढ़ा सकते हैं, जिससे यह स्टोक्स अस्थायी लिफाफे से भी अधिक लंबा हो सकता है और रमन सिग्नल के प्रभावी, सुलभ बैंडविड्थ को कम कर सकता है। इसके अलावा, यह विस्तार मापा एसआरएस स्पेक्ट्रम के वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल के विरूपण को भी पेश कर सकता है।

कार्स में, स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से प्रासंगिक संकेत तरंग दैर्ध्य पर उभरता है जो उत्तेजना क्षेत्रों से भिन्न होता है। एक साधारण फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब या चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे का उपयोग समय में सीएआरएस सिग्नल को एकीकृत करने के लिए किया जा सकता है, लेजर शोर को औसत करने के लिए हजारों दालों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है। इसके बजाय, एसआरएस सिग्नल एक मजबूत और उतार-चढ़ाव लेजर पृष्ठभूमि के भीतर एम्बेडेड एक बेहोश मॉडुलन हस्तांतरण के रूप में दिखाई देता है। क्योंकि यह मॉडुलन कमजोर है, लेजर शोर आसानी से इसे अभिभूत कर सकता है, इमेजिंग गति और एसआरएस माइक्रोस्कोप की संवेदनशीलता दोनों को कम कर सकता है। इसलिए, इमेजिंग से पहले, यह निर्धारित करने के लिए सापेक्ष तीव्रता शोर (आरआईएन) को मापना अनिवार्य है कि क्या लेजर उच्च गति वाले एसआरएस इमेजिंग के लिए उपयुक्त है और सबसे कम शोर के साथ मॉडुलन आवृत्ति का चयन करने के लिए। आरआईएन को माध्य ऑप्टिकल पावर () 40,41 द्वारा सामान्यीकृत लेजर के शोर शक्ति वर्णक्रमीय घनत्व [Equation 2डब्ल्यू2/हर्ट्ज इकाइयों के साथ] के रूप में परिभाषित किया गया है। दूसरे शब्दों में, आरआईएन विभिन्न आवृत्तियों (ईक्यू [4]) पर सामान्यीकृत लेजर उतार-चढ़ाव का वर्णन करता है।

Equation 7 (4)

इस प्रकार, आरआईएन एसआरएस प्रणाली का एक पैरामीटर है जो प्रयोगों के लिए आदर्श मॉडुलन आवृत्ति सीमा निर्धारित करता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 8 में जैतून का बार एसआरएस इमेजिंग के लिए आदर्श मॉडुलन आवृत्ति रेंज से पता चलता है। नैरोबैंड एसआरएस के मामले में, उपयोगकर्ता को पंप और स्टोक्स दोनों के आरआईएन को मापना चाहिए ताकि यह चुना जा सके कि इष्टतम प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए किस बीम को संग्राहक करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 8 से ध्यान दें, कि स्टोक्स बीम में पंप की तुलना में थोड़ा अधिक आरआईएन है, जिसका अर्थ है कि एसआरजी माप उनके एसआरएल समकक्षों की तुलना में शोर हो जाएगा। ब्रॉडबैंड एसआरएस के मामले में, बीम जिसे मॉडुलित किया जाना चाहिए वह संकीर्ण बैंड बीम है।

झंझरी का कोणीय फैलाव डी विवर्तन कोण को तरंग दैर्ध्य के एक समारोह के रूप में व्यक्त करता है, और इसे झंझरी समीकरण के व्युत्पन्न के रूप में परिभाषित किया गया है। लिट्रो विन्यास के लिए, कोणीय फैलाव समीकरण (5) द्वारा दिया गया है।

Equation 8 (5)

समीकरण (5) प्राप्त करने के लिए, हमने मान लिया α = β, एम /डी के लिए समीकरण (2) को हल किया और परिणाम को डीβ / डीλ में डाला। ध्यान दें कि लिट्रो कॉन्फ़िगरेशन में, β = सिन -1 (एमλ/2डी)। छोटे कोण सन्निकटन के भीतर, स्पेक्ट्रम के साथ स्थिति में परिवर्तन एफडीβ ≈ डीएल (चित्रा 10) है। इस प्रकार, समीकरण (5) में डीβ डालने से, हम रैखिक फैलाव की गणना कर सकते हैं, समीकरण (6) का उपयोग करके एनएम मिमी -1 की इकाइयों के साथ एक मात्रा:

Equation 9 (6)

1,851.85 खांचे / मिमी के साथ लिट्रो कॉन्फ़िगरेशन में संचालित विवर्तन झंझरी के लिए, डी = 540 एनएम। यदि हम ~ 789 एनएम पर प्रकाश के पहले क्रम के विवर्तन का उपयोग करते हैं, तो डी = 0.0027 रेड एनएम -1। एफ = 750 मिमी लेंस के साथ, हमें 0.5 एनएम मिमी -1 ≈ का रैखिक फैलाव मिलता है, जो 7.8 सेमी -1मिमी -1 ≈ में अनुवाद करता है। इस प्रकार, लेंस की फोकल लंबाई डिटेक्टर विमान पर एनएम प्रति मिमी के "घनत्व" को निर्धारित करती है: फोकल लंबाई जितनी लंबी होगी, प्रति मिमी कम एनएम प्राप्त होगा, ब्रॉडबैंड पंप की वर्णक्रमीय लाइनों के बीच की जगह बढ़ जाएगी। इसके विपरीत, छोटी फोकल लंबाई के साथ, डिटेक्टर विमान पर प्रति मिमी अधिक एनएम होगा, जिससे बिखरे हुए पंप द्वारा कब्जा किए गए स्थान को कम किया जा सकेगा।

संतुलित पहचान छवि की गुणवत्ता और शोर सेटअप की संवेदनशीलता में सुधार करती है। उदाहरण के लिए, चित्रा 8 में दिखाए गए आरआईएन स्पेक्ट्रा के अनुसार और 1 एक्स 10-5 के आयाम के साथ विशिष्ट एसआरएस पर विचार करते हुए, असंतुलित सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) ≈60 है। संतुलित पहचान (यानी, शॉट-शोर के करीब) का उपयोग करके, ≈145 के एसएनआर को प्राप्त करना संभव है। चित्रा 11 संतुलित और असंतुलित परिस्थितियों के तहत स्पेक्ट्रा और समग्र छवियों को दर्शाता है। स्वाभाविक रूप से, संतुलित पहचान के प्रभाव प्रयोगों के अंतिम परिणामों को प्रभावित करते हैं, अर्थात्, रासायनिक मानचित्र। इन परिणामों द्वारा समर्थित, हम इस बात पर जोर देते हैं कि संतुलित पहचान छवि की गुणवत्ता पर लेजर उतार-चढ़ाव के हानिकारक प्रभावों का मुकाबला करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यह उल्लेखनीय है कि संतुलित पहचान शोर लेजर के लिए सबसे उपयुक्त है, जैसे कि फाइबर ऑसिलेटर। शांत ऑप्टिकल प्रकाश स्रोतों (जैसे, ठोस-राज्य लेजर) के साथ काम करने वाले एसआरएस माइक्रोस्कोप को संतुलित पहचान की आवश्यकता नहीं हो सकती है।

प्रोटोकॉल इन बीम के दालों के बीच स्पैटिओटेम्पोरल ओवरलैप को खोजने के लिए नॉनलाइनर ऑप्टिक्स के आधार पर एक दृष्टिकोण भी बताता है। हमने मॉडुलित स्टोक्स बीम के रूप में एओएम के 0वें विवर्तन-क्रम के बजाय 1सेंट का उपयोग करने के फायदों का वर्णन किया। इसके अलावा, एसआरएस पीढ़ी दक्षता पर फैलाव के हानिकारक प्रभावों को प्रिज्म कंप्रेसर के माध्यम से उन्हें कम करने के तरीकों के सुझावों के साथ वर्णित किया गया था। इसके अलावा, प्रोटोकॉल बताता है कि प्रिज्म को कैसे संरेखित किया जाए और इष्टतम प्रदर्शन के लिए विचार करने के लिए तीन महत्वपूर्ण पहलुओं पर प्रकाश डाला जाए। हम न केवल एसआरएस माइक्रोस्कोपी के लिए आरआईएन की प्रासंगिकता पर चर्चा करते हैं, बल्कि यह भी दिखाते हैं कि इसे लॉक-इन एम्पलीफायर के साथ कैसे मापा जाए और आरआईएन स्पेक्ट्रम के साथ, सर्वोत्तम मॉडुलन आवृत्ति को परिभाषित करें। एक ठोस उदाहरण के साथ, यह पेपर बताता है कि झंझरी समीकरण कैसे पहचान श्रृंखला को डिजाइन करने में मदद करता है। अंत में, प्रोटोकॉल वास्तविक एसआरएस डेटा के साथ, एसआरएस हाइपरक्यूब की संरचना और पारंपरिक रूप से उपयोग की जाने वाली वैज्ञानिक प्रोग्रामिंग भाषा के साथ इसका विश्लेषण कैसे करें।

इस प्रोटोकॉल की तीन मामूली सीमाएं हैं। सबसे पहले, इस योगदान में नियोजित पहचान योजना में एक गैर-पारंपरिक, मल्टीचैनल लॉक-इन डिटेक्टर होता है जिसे स्किओर्टिनो एट अल द्वारा डिजाइन और निर्मित किया जाता है 26 जैसा कि पहले25 का प्रदर्शन किया गया था, इस डिटेक्टर को ऑफ-द-शेल्फ संतुलित फोटोडायोड द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। यद्यपि यह संशोधन केवल डिटेक्टर से संबंधित है और प्रोटोकॉल को लगभग अपरिवर्तित छोड़ देता है, एक एकल-फोटोडायोड के साथ, किसी को उन सभी को एक बार में मापने के बजाय डिटेक्टर पर प्रत्येक वर्णक्रमीय घटक को स्कैन करने की आवश्यकता होती है। दूसरा, यह प्रोटोकॉल इनलाइन संतुलित पहचान को नियोजित करता है, जिसके लिए बीम पथ में कई ऑप्टिकल तत्वों को सम्मिलित करने की आवश्यकता होती है। ये ऑप्टिकल तत्व सिस्टम जटिलता को बढ़ाते हैं और ऑप्टिकल पावर और पल्स विस्तार के नुकसान का कारण बनते हैं।

इनलाइन संतुलित पहचान यह भी मांग करती है कि दो पंप प्रतिकृतियां नमूने से गुजरती हैं, एक ऐसी स्थिति जो प्रकाश-संवेदनशील नमूनों के लिए आदर्श नहीं हो सकती है, जैसे कि जीवित कोशिकाएं, या दृढ़ता से द्विध्रुवी लोगों के लिए जिसमें दो पंप प्रतिकृतियां विभिन्न ऑप्टिकल गुणों का अनुभव कर सकती हैं, इस प्रकार संतुलित पहचान को रद्द करना। तीसरा, प्रोटोकॉल एक होम-बिल्ट ओपीओ पर निर्भर करता है, एक ऐसा उपकरण जो आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है। हालांकि, ओपीओ द्वारा वितरित ब्रॉडबैंड स्पेक्ट्रा के विकल्प गैर-रेखीय ऑप्टिकल फाइबर या थोक क्रिस्टल से सुपरकॉन्टिनुआ हैं। उत्तरार्द्ध को केवल कम पुनरावृत्ति दर लेजर (5 मेगाहर्ट्ज तक) के साथ नियोजित किया जा सकता है। इस प्रकार, हर प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ के रूप में, हाथ में प्रोटोकॉल कुछ सीमाएं हैं। हालांकि, वे न्यूनतम हैं और इस दृष्टिकोण की सफलता से समझौता नहीं करते हैं।

यद्यपि यहां एक संदर्भ नमूना वर्णित है, यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं और पशु और पौधों के ऊतकों, जैसे कि सेल्यूलोज, लिपिडिक प्रजातियों, या प्रोटीन के भीतर रासायनिक प्रजातियों को सफलतापूर्वक विसर्जित कर सकता है, विभिन्न जैव रासायनिक खोजों में या हिस्टोपैथोलॉजी में निदान उपकरण के रूप में व्यावहारिक अनुप्रयोगों को ढूंढ सकता है। इसी तरह, यह प्रोटोकॉल भौतिक विज्ञान में एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, कोई भी आणविक संरचना और बहुलक प्रजातियों42 की एकाग्रता से पूछताछ कर सकता है। इसके अलावा, यह पद्धति अन्य गैर-रेखीय माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ संगत है, जैसे कि पंप-जांच43 और हेटरोडाइन कार्स44 के आधार पर ब्रॉडबैंड माइक्रोस्कोपी, चार-तरंग मिश्रण प्रक्रियाएं, जो एसआरएस के साथ, दो उत्तेजना प्रकाश बीम और मॉडुलन-हस्तांतरण माप की भी आवश्यकता होती है। अंत में, इस पत्र में निहित कुछ जानकारी को गैर-रेखीय इमेजिंग तकनीकों पर लागू किया जा सकता है जो मॉडुलन हस्तांतरण तकनीकों पर भरोसा नहीं करते हैं, लेकिन दो या दो से अधिक स्पंदित लेजर बीम को संरेखित करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि पारंपरिक कार्स45 और एसएफजी माइक्रोस्कोपी46।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल रासायनिक मानचित्रों और रासायनिक रूप से विषम मिश्रण से उनकी विशेषता एसआरएस स्पेक्ट्रा निकालने के लिए ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी के आधार पर एक शक्तिशाली पद्धति का वर्णन करता है, जो डेटासेट प्रदान करता है जो सीधे मात्रात्मक डेटा विश्लेषण की अनुमति देता है। विधि की बहुमुखी प्रतिभा और सादगी भी इच्छुक पाठक को इसे विभिन्न गैर-रेखीय तकनीकों के अनुकूल बनाने की संभावना देती है।

Disclosures

जीसी कंपनी, कैम्ब्रिज रमन इमेजिंग के साथ भागीदारी की घोषणा करता है, जिसका उद्देश्य ब्रॉडबैंड एसआरएस माइक्रोस्कोपी तकनीक का व्यावसायीकरण करना है। अन्य लेखकों ने ब्याज के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

डीपी अनुदान समझौते संख्या 101016923 के तहत यूरोपीय संघ परियोजना क्रिमसन और ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 101016923 के तहत रीजन लोम्बार्डिया प्रोजेक्ट न्यूमेड से वित्त पोषण स्वीकार करता है। पीओआर एफईएसआर 2014-2020। जीसी अनुदान समझौते संख्या 881603 के तहत यूरोपीय संघ परियोजना ग्राफीन कोर 3 से वित्त पोषण स्वीकार करता है। जीसी किंग अब्दुल्ला यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी, ग्रांट अवार्ड नंबर: ओएसआर -2016-सीआरजी 5-3017-01 से वित्त पोषण भी स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection objective Nikon CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon Oil immersion objective
Coverslips Thermo Fisher 043211-KJ Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line Physik Instrumente (PI) M-406.6PD Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO Merck D8418-500ML Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon SLS Optics Ltd Custom made Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective Nikon CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon Water immersion objective
Grating LightSmyth T-1850-800s Series High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser Coherent Custom made Fidelity, HP
λ/2 Thorlabs SAHWP05M-1700 Mounted superachromatic half-wave plate
PBS Thorlabs CM5-PBS203/M 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads Merck MFCD00198073 Micro particles based on polymethacrylate
Prisms Crisel 320-8218 LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads Merck 72986-10ML-F Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal Dr. Sztatecsny GmbH Custom made  thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 - 1,100 nm

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De la Cadena, A., Vernuccio, F.,… More

De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).

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