从人脐带组织中生成间充质干细胞及其分化为骨骼肌谱系
Summary
我们描述了一种从人脐带组织中分离间充质干细胞并将其分化为骨骼肌谱系的方案。
Abstract
探索间充质干细胞的治疗潜力取决于分离的难易程度，分化的效力以及来源的可靠性和稳健性。我们在这里描述了一种逐步方案，用于从人脐带组织（uMSCs）中分离间充质干细胞，其免疫表型以及这种培养物在几段传代中的繁殖。在这个过程中，uMSCs的存活率很高，因为没有酶消化。此外，去除血管，包括脐带动脉和静脉，确保内皮来源的细胞没有污染。使用流式细胞术，分离时的 uMSC 为 CD45−CD34−，表明造血谱系中没有细胞。重要的是，它们表达了关键的表面标记，CD105，CD90和CD73。在建立培养物后，本文描述了一种诱导这些uMSC分化成骨骼肌谱系的有效方法。对分化 uMSC 中肌源性进展的详细分析显示，uMSCs 表达 Pax7（分化初始阶段肌源祖细胞的标志物），其次是 MyoD 和 Myf5 的表达，最后是终末分化标志物肌球蛋白重链 （MyHC）。
Introduction
人类脐带被认为具有强大的间充质干细胞库，由于其强大的增殖和分化速率，免疫调节特性以及从所有三个胚层生成细胞的能力，目前正在探索再生疗法1。脐带组织由多个区室组成，如脐带血、脐静脉内皮下和沃顿果冻（WJ），其本身包括三个模糊区域 – 血管周围区，血管间区和羊膜下或脐带衬里（CL）2。虽然uMSC可以从所有这些不同的区域中分离出来，并广泛地表达关键的MSC标记物，但这些区室是否包含相同的uMSC群体或显示其分化效力的差异尚不清楚3。因此，uMSC的隔离方案需要在其隔离模式和区域中具有更高的精度，对分化电位进行可靠的表征，最后需要对脐带的不同隔室进行比较分析。
在这种情况下，很少有研究表明，脐带不同部位之间的uMSC增殖和鉴别电位存在差异。其中，从CL和WJ区域分离的uMSC之间的比较分析显示，CL衍生的uMSCs3，4具有更大的增殖潜力。在另一项研究中，与血管周围细胞（HUCPV）相比，WJ衍生的uMSCs在增殖测定中表现更好5。在检查脐带血来源的uMSCs和没有血管污染的脐带组织来源的umMSC之间的差异时，报告了两个区室之间关键MSC标志物的差异表达，以及脐带组织来源的umSCCs6的增殖速率增加。
在几项研究 uMSC 主要在中胚层谱系组织（如成骨性、脂肪原性和软骨成因谱系）中的分化潜力的研究中，很少有研究提供肌源分化和后续表征的详细方案，以及各种脐带区室之间的比较分析。在这种情况下，我们开发了一种强大的肌肉分化方案，并观察到与脐带血6相比，脐带组织衍生的uMSC显示出优越的肌源分化能力。在这里，详细描述了从整个脐带组织中分离uMSCs的逐步方案，这些组织没有与脉管系统相关的细胞，它们的表征以及它们分化成肌源谱系。
Protocol
Representative Results
Discussion
关键步骤
该方案的一个关键步骤是在无菌条件下收集组织，从递送时间到维持无菌培养物，持续整个繁殖期。在脐带收集过程中，脐带必须不接触任何未灭菌的表面，并在收集到含有补充抗生素的PBS的管中之前用70%乙醇进行外部拭子。重要的是要限制脐带收集和组织处理之间的时间，以进行uMSC分离。如果需要将组织从收集部位运输到实验室，必须注意将组织保持在含抗生素的缓冲…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Ojas Tikoo先生在拍摄和视频制作方面的帮助。我们还感谢GURGRAM Civil Hospital的GARBH-Ini（跨学科高级研究和分娩结果小组-DBT India）工作人员，护士和高级研究官员以及Pallavi Kshetrapal博士在后勤方面的帮助。这项工作得到了印度生物技术部向Suchitra Gopinath提供的赠款的支持（BT/09/IYBA/2015;BT/PR29599/PFN/20/1393/2018）.
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
Referências
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