Génération de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation en lignée musculaire squelettique
Summary
Nous décrivons un protocole pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation dans la lignée musculaire squelettique.
Abstract
L’exploration du potentiel thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses dépend de la facilité d’isolement, de la puissance vers la différenciation, ainsi que de la fiabilité et de la robustesse de la source. Nous décrivons ici un protocole par étapes pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain (cSM), leur immunophénotypage et la propagation de telles cultures sur plusieurs passages. Dans cette procédure, la viabilité des uMSC est élevée car il n’y a pas de digestion enzymatique. De plus, l’ablation des vaisseaux sanguins, y compris les artères du cordon ombilical et la veine, garantit qu’il n’y a pas de contamination des cellules d’origine endothéliale. En utilisant la cytométrie en flux, les cSEm lors de l’isolement sont CD45−CD34−, ce qui indique une absence de cellules de la lignée hématopoïétique. Il est important de noter qu’ils expriment les marqueurs de surface clés, CD105, CD90 et CD73. Lors de l’établissement des cultures, cet article décrit une méthode efficace pour induire la différenciation de ces uMSC dans la lignée musculaire squelettique. Une analyse détaillée de la progression myogénique dans les uMSC différenciés révèle que les uMSC expriment Pax7, un marqueur des progéniteurs myogéniques dans les premiers stades de différenciation, suivis de l’expression de MyoD et Myf5, et, enfin, d’un marqueur de différenciation terminal, la chaîne lourde de myosine (MyHC).
Introduction
Le cordon ombilical humain a été crédité de posséder un réservoir robuste de cellules souches mésenchymateuses, qui sont actuellement explorées pour les thérapies régénératives en raison de leurs taux de prolifération et de différenciation robustes, de leurs propriétés immunomodulatrices et de leur capacité à générer des cellules à partir des trois couches germinales1. Le tissu du cordon ombilical se compose de plusieurs compartiments tels que le sang de cordon ombilical, le sous-endothélium de la veine ombilicale et la gelée de Wharton (WJ), qui englobe en soi trois régions indistinctes: la zone périvasculaire, la zone intervasculaire et le sous-amnion ou la muqueuse du cordon (CL)2. Bien que les uMSC puissent être isolés de toutes ces différentes régions et exprimer largement les marqueurs clés du MSC, il n’est pas clair si ces compartiments contiennent la même population d’uMSC ou présentent des différences dans leurs puissances de différenciation3. Par conséquent, les protocoles d’isolement des uMSC nécessitent une plus grande précision dans leur mode et leur région d’isolement, la caractérisation robuste des potentiels de différenciation et, enfin, une analyse comparative à partir de différents compartiments du cordon.
Dans ce contexte, peu d’études ont démontré des différences dans les potentiels prolifératifs et différentiatifs de l’uMSC entre les différentes parties du cordon. Parmi ceux-ci, des analyses comparatives entre des uMSC isolés des régions CL et WJ ont révélé un plus grand potentiel prolifératif dans les uMSC dérivés de CL 3,4. Dans une étude distincte, les uMSC dérivés du WJ ont obtenu de meilleurs résultats dans les essais de prolifération que les cellules périvasculaires (HUCPV)5. Lors de l’examen des différences entre les cSEm dérivés du sang de cordon et les cSEm dérivés du tissu de cordon ombilical dépourvus de contamination vasculaire, une expression différentielle des marqueurs clés du CSM a été rapportée entre les deux compartiments, ainsi qu’une augmentation des taux de prolifération dans les cSEm dérivés du tissu du cordon6.
Parmi les nombreuses études examinant les potentiels de différenciation des cSEm principalement dans les tissus de la lignée mésodermique tels que les lignées ostéogéniques, adipogéniques et chondrogènes, très peu ont fourni des protocoles détaillés pour la différenciation myogénique et la caractérisation ultérieure, ainsi que des analyses comparatives entre divers compartiments du cordon. Dans ce contexte, nous avons développé un protocole robuste de différenciation musculaire et observé que les uMSC dérivés du tissu du cordon présentaient des capacités de différenciation myogénique supérieures à celles du sang de cordon6. Ici, un protocole par étapes est détaillé pour l’isolement des uMSC de l’ensemble du tissu du cordon dépourvu de cellules associées au système vasculaire, leur caractérisation et leur différenciation dans la lignée myogénique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques
Une étape critique de ce protocole est la collecte de tissus dans des conditions aseptiques, du moment de l’accouchement au maintien des cultures stériles, pendant toute la durée de la propagation. Lors de la collecte du cordon, il est essentiel que le cordon ne touche aucune surface non stérilisée et soit tamponné à l’extérieur avec de l’éthanol à 70% avant d’être collecté dans des tubes contenant du PBS complété par des antibiotiques. Il est important de limit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions M. Ojas Tikoo pour son aide pour le tournage et la production vidéo. Nous reconnaissons également l’aide reçue du personnel du GARBH-Ini (Groupe interdisciplinaire sur la recherche avancée et l’issue de la naissance -DBT India), des infirmières et des agents de recherche principaux de l’hôpital civil gurugram et du Dr Pallavi Kshetrapal pour l’aide à la logistique. Ce travail a été soutenu par des subventions accordées à Suchitra Gopinath par le Département de biotechnologie de l’Inde (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
Referências
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