İnsan Göbek Kordonu Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin Üretimi ve İskelet Kas Soyuna Farklılaşması
Summary
Mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan izolasyonu ve iskelet kası soyuna farklılaşması için bir protokol tanımladık.
Abstract
Mezenkimal kök hücrelerin terapötik potansiyelini araştırmak, izolasyonun kolaylığına, farklılaşmaya yönelik potansiyele ve kaynağın güvenilirliğine ve sağlamlığına bağlıdır. Burada, mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan (uMSC’ler) izolasyonu, immünofenotiplenmesi ve bu kültürlerin birkaç pasaj üzerinde yayılması için kademeli bir protokol tarif ediyoruz. Bu prosedürde, enzimatik sindirim olmadığı için uMSC’lerin yaşayabilirliği yüksektir. Ayrıca, göbek kordonu arterleri ve damar dahil olmak üzere kan damarlarının çıkarılması, endotel kökenli hücrelerin kirlenmemesini sağlar. Akış sitometrisi kullanılarak, izolasyon üzerine uMSC’ler CD45-CD34-‘dür ve hematopoetik soydan hücrelerin yokluğunu gösterir. Önemli olarak, anahtar yüzey işaretleyicilerini, CD105, CD90 ve CD73’ü ifade ederler. Kültürlerin kurulmasından sonra, bu yazıda bu uMSC’lerde iskelet kası soyuna farklılaşmayı indüklemek için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Diferansiye uMSC’lerde miyojenik progresyonun ayrıntılı bir analizi, uMSC’lerin farklılaşmanın ilk aşamalarında miyojenik progenitörler için bir belirteç olan Pax7’yi, ardından MyoD ve Myf5’in ekspresyonunu ve son olarak bir terminal farklılaşma belirteci olan miyozin ağır zincirini (MyHC) ekspresyonunu ifade ettiğini ortaya koymaktadır.
Introduction
İnsan göbek kordonunun, sağlam proliferasyon ve farklılaşma oranları, immünomodülatör özellikleri ve üç germ katmanının hepsinden hücre üretme yetenekleri nedeniyle şu anda rejeneratif tedaviler için araştırılmakta olan sağlam bir mezenkimal kök hücre rezervuarına sahip olduğu düşünülmektedir1. Göbek kordonu dokusu, göbek kordonu kanı, göbek damarı subendoteli ve Wharton’un jölesi (WJ) gibi kendi içinde üç belirsiz bölgeyi kapsayan çoklu bölmelerden oluşur – perivasküler bölge, intervasküler bölge ve alt amniyon veya kordon astarı (CL)2. uMSC’ler tüm bu farklı bölgelerden izole edilebilse ve anahtar MSC belirteçlerini geniş çapta ifade edebilse de, bu bölmelerin aynı uMSC popülasyonunu içerip içermediği veya farklılaşma potansiyellerinde farklılıklar gösterip göstermediği konusunda netlik yoktur3. Bu nedenle, uMSC’lerin izolasyonu için protokoller, izolasyon modlarında ve bölgelerinde daha büyük bir hassasiyet, farklılaşma potansiyellerinin sağlam karakterizasyonu ve son olarak, kablonun farklı bölmelerinden karşılaştırmalı bir analiz gerektirir.
Bu bağlamda, az sayıda çalışma, kordonun farklı kısımları arasındaki uMSC proliferatif ve farklılaştırıcı potansiyellerinde farklılıklar göstermiştir. Bunlardan CL ve WJ bölgelerinden izole edilen uMSC’ler arasındaki karşılaştırmalı analizler, CL kaynaklı uMSC’lerde daha büyük bir proliferatif potansiyel ortaya koymuştur 3,4. Ayrı bir çalışmada, WJ kaynaklı uMSC’ler, proliferasyon tahlillerinde perivasküler hücrelere (HUCPV) kıyasla daha iyi performans göstermiştir5. Kordon kanı kaynaklı uMSC’ler ile vasküler kontaminasyondan yoksun kordon dokusu kaynaklı uMSC’ler arasındaki farkların incelenmesinde, iki bölme arasında anahtar MSC belirteçlerinin diferansiyel ekspresyonunun yanı sıra kordon dokusundan türetilmiş uMSC’lerde proliferasyon oranlarının arttığı bildirilmiştir6.
uMSC’lerin öncelikle osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylar gibi mezoderm soyunun dokularına farklılaşma potansiyellerini inceleyen çeşitli çalışmalardan çok azı, miyojenik farklılaşma ve müteakip karakterizasyon için ayrıntılı protokollerin yanı sıra çeşitli kordon bölmeleri arasındaki karşılaştırmalı analizler sağlamıştır. Bu bağlamda sağlam bir kas farklılaşma protokolü geliştirdik ve kordon dokusu kaynaklı uMSC’lerin kordon kanı6’ya kıyasla daha üstün miyojenik farklılaşma yetenekleri gösterdiğini gözlemledik. Burada, uMSC’lerin vaskülatür ile ilişkili hücrelerden yoksun tüm kordon dokusundan izolasyonu, karakterizasyonu ve miyojenik soya farklılaşması için kademeli bir protokol detaylandırılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritik adımlar
Bu protokoldeki kritik bir adım, tüm yayılma süresi boyunca, doğum anından steril kültürlerin bakımına kadar aseptik koşullar altında dokunun toplanmasıdır. Kordon toplama sırasında, kordonun sterilize edilmemiş herhangi bir yüzeye temas etmemesi ve antibiyotik takviyeli PBS içeren tüplerde toplanmadan önce% 70 etanol ile harici olarak temizlenmesi esastır. uMSC izolasyonu için kordon toplanması ve dokunun işlenmesi arasındaki süreyi sınırlamak önemlidir. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sayın Ojas Tikoo’ya film çekimi ve video prodüksiyonu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Gurugram Sivil Hastanesi’ndeki GARBH-Ini (İleri Araştırma ve Doğum Sonuçları Disiplinlerarası Grup-DBT Hindistan) personelinden, hemşirelerinden ve kıdemli araştırma görevlilerinden ve Dr. Pallavi Kshetrapal’dan lojistik konusunda yardım için alınan yardımı da kabul ediyoruz. Bu çalışma, Hindistan Biyoteknoloji Bölümü’nden Suchitra Gopinath’a verilen hibelerle desteklenmiştir (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
Referências
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton’s jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
