Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie.
Abstract
Die Erforschung des therapeutischen Potenzials mesenchymaler Stammzellen hängt von der Leichtigkeit der Isolierung, der Potenz zur Differenzierung und der Zuverlässigkeit und Robustheit der Quelle ab. Wir beschreiben hier ein schrittweises Protokoll für die Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe (uMSCs), deren Immunphänotypisierung und die Ausbreitung solcher Kulturen über mehrere Passagen. Bei diesem Verfahren ist die Lebensfähigkeit der uMSCs hoch, da keine enzymatische Verdauung stattfindet. Darüber hinaus stellt die Entfernung von Blutgefäßen, einschließlich der Nabelschnurarterien und der Vene, sicher, dass es keine Kontamination von Zellen endothelialen Ursprungs gibt. Unter Verwendung der Durchflusszytometrie sind uMSCs bei der Isolierung CD45−CD34−, was auf eine Abwesenheit von Zellen aus der hämatopoetischen Linie hinweist. Wichtig ist, dass sie die Tastenoberflächenmarkierungen CD105, CD90 und CD73 ausdrücken. Nach der Etablierung von Kulturen beschreibt dieses Papier eine effiziente Methode, um die Differenzierung dieser uMSCs in die Skelettmuskellinie zu induzieren. Eine detaillierte Analyse der myogenen Progression in differenzierten uMSCs zeigt, dass uMSCs Pax7 exprimieren, einen Marker für myogene Vorläufer in den Anfangsstadien der Differenzierung, gefolgt von der Expression von MyoD und Myf5 und schließlich einem terminalen Differenzierungsmarker, Myosin Heavy Chain (MyHC).
Introduction
Der menschlichen Nabelschnur wird ein robustes Reservoir mesenchymaler Stammzellen zugeschrieben, die derzeit aufgrund ihrer robusten Proliferations- und Differenzierungsraten, immunmodulatorischen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit, Zellen aus allen drei Keimschichten 1 zu erzeugen, für regenerative Therapien erforschtwerden. Das Nabelschnurgewebe besteht aus mehreren Kompartimenten wie dem Nabelschnurblut, dem Nabelvenensubendothel und dem Wharton-Gelee (WJ), das an sich drei ununterschiedliche Regionen umfasst – die perivaskuläre Zone, die intervaskuläre Zone und das Subamnion oder die Nabelschnurauskleidung (CL)2. Während uMSCs aus all diesen verschiedenen Regionen isoliert werden können und wichtige MSC-Marker weitgehend ausdrücken, gibt es keine Klarheit darüber, ob diese Kompartimente die gleiche Population von uMSCs enthalten oder Unterschiede in ihren Differenzierungspotenzenaufweisen 3. Daher erfordern Protokolle für die Isolierung von uMSCs eine größere Präzision in ihrem Modus und Bereich der Isolation, die robuste Charakterisierung von Differenzierungspotentialen und schließlich eine vergleichende Analyse aus verschiedenen Kompartimenten der Schnur.
In diesem Zusammenhang haben nur wenige Studien Unterschiede in den proliferativen und differenzativen Potentialen von uMSC zwischen verschiedenen Teilen der Schnur gezeigt. Von diesen ergaben vergleichende Analysen zwischen uMSCs, die aus den CL- und WJ-Regionen isoliert wurden, ein größeres Proliferationspotenzial in CL-abgeleiteten uMSCs 3,4. In einer separaten Studie schnitten WJ-abgeleitete uMSCs in Proliferationsassays im Vergleich zu perivaskulären Zellen (HUCPV) besser ab.5. Bei der Untersuchung von Unterschieden zwischen aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs und aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs, die keine vaskuläre Kontamination aufweisen, wurde eine differentielle Expression der wichtigsten MSC-Marker zwischen den beiden Kompartimenten sowie erhöhte Proliferationsraten in Nabelschnurgewebe-abgeleiteten uMSCsberichtet 6.
Von den verschiedenen Studien, die die Differenzierungspotenziale von uMSCs hauptsächlich in Gewebe der Mesoderm-Linie wie osteogene, adipogene und chondrogene Linien untersuchen, haben nur sehr wenige detaillierte Protokolle für die myogene Differenzierung und anschließende Charakterisierung sowie vergleichende Analysen zwischen verschiedenen Nabelschnurkompartimenten geliefert. In diesem Zusammenhang haben wir ein robustes Muskeldifferenzierungsprotokoll entwickelt und beobachtet, dass aus Nabelschnurgewebe gewonnene uMSCs im Vergleich zu Nabelschnurblut überlegene myogene Differenzierungsfähigkeitenaufweisen 6. Hier wird ein schrittweises Protokoll für die Isolierung von uMSCs aus dem gesamten Nabelschnurgewebe ohne Zellen, die mit dem Gefäßsystem assoziiert sind, ihre Charakterisierung und ihre Differenzierung in die myogene Linie detailliert beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Sammlung von Gewebe unter aseptischen Bedingungen, vom Zeitpunkt der Lieferung bis zur Aufrechterhaltung steriler Kulturen, für die gesamte Dauer der Vermehrung. Während der Schnursammlung ist es wichtig, dass die Schnur keine nicht sterilisierte Oberfläche berührt und extern mit 70% Ethanol abgewischt wird, bevor sie in mit Antibiotika ergänzten Röhrchen, die PBS enthalten, gesammelt wird. Es ist wichtig, die Zeit zwischen de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Ojas Tikoo für ihre Hilfe bei den Dreharbeiten und der Videoproduktion. Wir danken auch für die Hilfe der Mitarbeiter von GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), Krankenschwestern und leitenden Forschungsbeamten am Gurugram Civil Hospital und Dr. Pallavi Kshetrapal für Hilfe bei der Logistik. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt, die Suchitra Gopinath vom Department of Biotechnology, Indien, gewährt wurden (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
Referências
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