Summary
기저막은 발달 동안 조직 및 장기 형태 형성에 필수적입니다. 이 구조의 적절한 배치로 이어지는 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 제시된 프로토콜은 공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 상피 세포에서 기저막 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 시각화하고 특성화하는 방법을 설명합니다.
Abstract
기저막 (BM) - 상피 세포의 기저 측에 존재하는 세포 외 매트릭스의 특수 시트 - 상피 조직 형태학 및 장기 형태 형성의 확립 및 유지에 중요합니다. 또한, BM은 조직 모델링에 필수적이며, 신호 전달 플랫폼 역할을하며, 조직과 장기를 형성하기위한 외부 힘을 제공합니다. BM이 정상적인 발달 및 병리학적 조건 동안 수행하는 많은 중요한 역할에도 불구하고, BM 함유 소포의 세포내 밀매를 조절하는 생물학적 경로와 기저 분비가 BM 단백질의 양극화 된 침착으로 이어지는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 초파리 난소의 여포 상피는 BM의 모든 주요 성분을 생산하고 분비하기 때문에 BM 막 단백질의 기초 침착을 연구하는 훌륭한 모델 시스템입니다. 공초점 및 초해상도 이미징은 고정 된 조직에서의 이미지 처리와 결합하여 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 침착에 특히 관여하는 세포 요인의 식별 및 특성화를 가능하게합니다. 이 기사는 초파리 난소의 여포 상피에서 내인성 태그가 지정된 단백질을 사용하여 BM 함유 소포 및 침착된 BM을 염색 및 이미징하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 질적 및 양적 질문을 모두 해결하기 위해 적용될 수 있으며 고처리량 스크리닝을 수용하기 위해 개발되어 상피 조직 개발 중에 편광 된 세포 내 밀매 및 소포 분비와 관련된 요인을 신속하고 효율적으로 식별 할 수 있습니다.
Introduction
기저막(BM)은 상피 구조 및 형태형성에 중요한 층상 세포-부착성 세포외 매트릭스(ECM)의 얇은 시트이다1. 그것은 ∼50 개의 단백질을 포함하며 상피 및 내피 세포의 기초가되는 유비쿼터스하게 발견되며, 골격, 평활 및 심장 근육 세포 및 지방 세포 1,2,3을 감싸고 있습니다. 상피 세포의 기저부에서 BM의 세 가지 주요 구성 요소는 콜라겐 IV, 펄레칸 및 라미닌입니다. BM은 상피 세포의 기초가되며 조직 분리 및 장벽, 성장 및 지원, 세포 분극 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12를 포함한 많은 기능을 담당합니다. . 신호 전달 플랫폼으로서의 그의 역할은 발달 동안 상피 세포 및 조직의 형태학 및 분화를 조절한다 3,13,14. 더욱이, BM의 잘못된 조절 및/또는 그 완전성의 위반은 종양 전이 2,15,16을 포함한 많은 병리학적 상태의 주요 원인이다. 조직 및 기관 형태형성 동안 BM에 의해 수행되는 필수적인 기능에도 불구하고, 편광된 세포내 밀매 및 BM 단백질의 분비에 전념하는 생물학적 경로(들)의 성분들은 모호하게 알려져 있다.
BM 함유 소포의 세포 내 밀매와 상피 세포에 의한 BM 단백질의 분비를 연구하기 위해, 초파리 난소의 여포 상피 (FE)는 강력한 모델 시스템입니다 (그림 1). 초파리 난소는 난소라고 불리는 16-20 개의 긴 튜브 형 구조로 구성됩니다 (그림 1A, B) 17,18,19. 각 난소는 난자 조립 라인으로 생각할 수 있으며, 성숙한 난자가 난관을 통해 빠져 나올 때까지 앞쪽 끝에서 시작하여 후방으로 움직이는 계란 챔버 (각각 계란을 발생시킵니다)의 연령 진행과 함께 알 조립 라인으로 생각할 수 있습니다. 각 달걀 챔버는 중앙 생식 세포(GCs)를 둘러싸고 있는 체세포 모낭 세포(FCs)의 단층인 FE에 의해 캡슐화된다. FE는 정점 도메인이 생식계열을 향하는 뚜렷한 정점-기저 극성으로 고도로 편광되고, BM 단백질은 기저18,19로 분비된다. FC는 콜라겐 IV, 펄레칸 및 라미닌20,21을 포함한 BM의 모든 주요 성분을 적극적으로 분비합니다. FCs와 같은 상피 세포에서, BM 성분은 생산되고 그들의 세포외 침착을 위한 특수한 편광 분비 경로를 필요로 한다. 예를 들어, BM의 가장 풍부한 성분인 콜라겐 IV(Coll IV)의 경우, 그의 편광된 세포내 밀매와 분비를 둘러싼 세부사항은 그것의 생산 및 침착이 많은 연구의 초점임에도 불구하고 모호하다. Coll IV는 소포체(ER)로 번역되며, 이는 또한 여기서 각각의 피브릴-세 개의 폴리펩티드(2개의 α1 쇄 및 하나의 α2 쇄)로 구성된-삼중 나선(22)으로 조립된다. 적절한 Coll IV 폴딩 및 기능에는 Plod 및 PH4αEFB 20,22,23,24,25,26과 같은 리실 및 프롤릴-히드록실라제를 포함하는 ER 샤페론 및 효소가 필요합니다. 이러한 번역 후 효소는 Coll IV의 ER 분류를 조절하는데, 각각의 손실로 인해 Coll IV가 기 저 ER20,23,24,25,26에 갇히게 됩니다. 이어서, 새로 합성된 Coll IV는 COPII 코팅된 소포체에서 골지에 대한 ER을 빠져나간다. 화물 수용체 Tango1은 큰 다량체 단백질20,27을 수용 할 수있는 상당한 골지 결합 소포로 콜라겐을 포장하는 데 도움을줍니다. 일단 Coll IV가 세포내 외래 소포로 포장되면, 그것은 상피 세포로부터 기저로 특이적으로 분비된다. BM 침착을 기저측으로 지시하기 위해, 상피 세포는 편광된 BM 분비에 특별히 전념하는 또 다른 인자 세트를 필요로 한다. 초파리 난소의 FE를 사용하여, 뉴클레오티드 교환 인자 (GEFs) Crag 및 Stratum, GTPases Rab8 및 Rab10뿐만 아니라 포스포이노시타이드 PI (4,5) P2, 및 Kinesin 1 및 3 모터 단백질 20,28,29,30,31의 수준을 포함하여이 새로운 세포 과정의 몇 가지 구성 요소가 특성화되었습니다. . 이러한 성분은 BM 단백질의 편광 분포를 보장하는 데 중요합니다.
FE 내의 BM 단백질의 세포내 국소화를 모니터링하기 위해, 내인성 태깅된 기저막 단백질(단백질 트랩), 예컨대 바이킹-GFP(Vkg-GFP 또는 α2 Coll IV-GFP) 및 펄레칸-GFP(Pcan-GFP)32,33이 사용될 수 있다. 이러한 단백질 트랩 라인은 BM 단백질의 내인성 분포를 정확하게 반영하고 수포 밀매28,30의 더 민감한 검출을 허용하는 것으로 나타났다. FE에서 BM의 편광 증착에 관여하는 성분들은 먼저 Vkg-GFP 및 Pcan-GFP 20,28,29,30에 대한 단백질 트랩 라인을 사용하여 특성화되었다. 단백질 트랩은 돌연변이체 및 Gal4 라인(34)을 포함하는 상이한 유전적 배경에서 사용될 수 있다. 더욱이, 단백질 트랩은 형광 염료 및/또는 형광 면역염색과 함께 사용될 수 있어, 야생형 및 돌연변이 조건(35)을 비교할 때 BM 단백질의 국소화의 정밀한 특성화를 가능하게 한다.
BM 단백질 함유 소포의 분포 및 국재화를 정확하고 효율적으로 평가하기 위해, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 및 초분해능 이미징 기술은 다른 이미징 접근법에 상당한 이점을 제시한다. 이러한 접근 방식은 고해상도 이미징과 상대적으로 사용하기 쉬운 방법을 결합합니다. CLSM은 갈바노미터를 사용하여 래스터 스캔 방식으로 레이저로 시편을 스캔하여 광학 분해능을 향상시킬 수 있는 현미경 기술입니다. 핀홀 조리개는 공초점 현미경의 핵심 구성 요소입니다. 초점면의 위 또는 아래에서 오는 초점이 맞지 않는 신호를 차단함으로써, 핀홀 조리개는 z축(36)에서 매우 우수한 분해능을 가져온다. 이것은 또한 일련의 광학 섹션에 해당하는 z-스택이라고 불리는 z-평면에서 일련의 이미지를 얻을 수있게합니다. z-스택은 이후 이미징 소프트웨어의 도움으로 3D 재구성을 통해 시편의 3D 이미지를 생성합니다. 기존의 에피형광(와이드필드) 현미경은 공초점 현미경과 달리 초점이 맞지 않는 빛이 이미지 품질에 기여하여 이미지 해상도와 콘트라스트(36,37)를 감소시킵니다. 이것은 epifluorescence 현미경을 단백질 국소화 또는 공동 국소화를 연구 할 때 덜 매력적인 후보로 만듭니다.
CLSM은 BM 단백질의 세포 내 밀매의 이미징 및 특성화를 포함한 다양한 응용에 적합한 접근법이지만, 아베의 빛의 회절 한계 (200-250 nm) 이하의 샘플을 이미징 할 때 여전히 문제가 있습니다. 이러한 샘플을 이미징 할 때, 공초점 현미경 검사, 특히 오일 목표를 사용할 때 높은 해상도를 초래할 수 있습니다. 그러나 초분해능 기술은 공초점 현미경의 한계를 뛰어 넘습니다. 초분해능 현미경을 달성하기 위한 다양한 접근법이 있으며, 각 현미경에는 특정 분해능 한계가 있으며 각 현미경은 서로 다른 분석에 적합합니다. 이러한 접근법에는 광활성화 국소화 현미경 (PALM) 또는 확률 적 광학 재구성 현미경 (STORM), 자극 방출 고갈 현미경 (STED), 구조화 된 조명 현미경 (SIM) 및 Airyscan (초해상도) 현미경 38,39,40,41,42,43,44,45,46이 포함됩니다. . Airyscan은 PALM / STORM, STED 및 SIM보다 거친 해상도를 가지고 있지만 최대 ~ 120nm (CLSM의 약 두 배)의 해상도를 달성 할 수 있습니다. 또한, 이러한 초분해능 현미경 접근 방식은 낮은 신호 대 잡음비47,48로 두꺼운 샘플 및 샘플을 이미징할 때 SIM 및 기타 초분해능 기술에 비해 이점이 있는 것으로 나타났습니다.
Airyscan은 비교적 새로운 초분해능 공초점 현미경 기술(46)이다. 핀홀 및 단일 포인트 검출기를 사용하여 초점이 맞지 않는 광을 거부하는 기존의 CLSM과는 달리, 이 초분해능 접근법은 모든 스캔 위치(45)에서 모든 광을 수집하는 32채널 갈륨 비소 포스피드(GaAsP) 광승수 튜브 영역 검출기를 사용합니다. 32개의 검출기 각각은 작은 핀홀로 작동하여 핀홀 크기를 기존 1.0 Airy Unit(A.U.)에서 향상된 0.2A.U.로 줄여 1.25A.U. 직경45의 효율을 유지하면서 더 높은 분해능과 신호 대 잡음비를 실현합니다. 또한, Airyscan이 사용하는 선형 디컨볼루션은 해상도(45)에서 최대 2배 증가를 초래한다. 이를 고려하여 CLSM, 특히 초분해능 현미경은 BM 단백질의 기초 침착을 조절하는 BM 단백질 및 단백질을 연구하는 데 매우 적합하며, 이는 국소화 및 공국재화 연구를 위한 매우 고해상도 이미지를 생성할 수 있기 때문에 이러한 과정을 제어하는 공간적, 시간적, 분자적 사건에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
국소화 실험을 수행하는 데 사용할 수 있는 공초점 현미경에 대한 대안적인 접근법은 이미지 디컨볼루션입니다. 광시야 현미경 검사는 초점이 맞지 않는 빛이 검출기에 도달할 수 있게 하기 때문에, 수학적 및 전산 디컨볼루션 알고리즘을 적용하여 광역 현미경에 의해 획득된 이미지로부터 초점이 맞지 않는 광을 제거하거나 재할당할 수 있고, 이로써 이미지(49)의 해상도 및 대비를 향상시킬 수 있다. Deconvolution 알고리즘은 또한 공초점 이미지에 적용되어 해상도와 콘트라스트를 더욱 증가시킬 수 있으며, 초해상도 현미경(50)의 최종 이미지와 거의 유사한 최종 이미지를 생성할 수 있다. Airyscan은 Weiner 필터 기반 디컨볼루션과 셰퍼드의 픽셀 재할당을 사용하여 공간 분해능과 신호 대 잡음비를 크게 향상시킵니다. 공초점 현미경과 비교하여, 이 초분해능 현미경 기술45,51을 사용할 때 세 가지 공간 차원(x 및 y에서 120nm, z에서 350nm) 모두에서 분해능이 2배 증가한 것이 관찰됩니다.
이 원고는 공초점 및 초분해능 현미경과 결합 된 모델 시스템으로 초파리 난소의 FE를 사용하여 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 침착을 염색, 획득 및 시각화하기위한 상세하고 최적화 된 프로토콜을 제공합니다. 내인성으로 태그된 기저막 단백질, 예를 들어, Vkg-GFP 및 Pcan-GFP를 발현하는 초파리 라인은 BM 단백질 밀매 및 분비를 가시화하는 효율적이고 정확한 도구이다. 또한, 이들은 돌연변이 및 Gal4/UAS 라인(34)을 포함하는 상이한 유전적 배경에서 용이하게 사용될 수 있다. 내인성으로 태그된 기저막 단백질이 권장되지만, 특정 BM 단백질에 대한 항체의 사용은 또한 기술된 프로토콜과 양립가능하다. 이러한 프로토콜은 공초점 및 초해상도 이미징을 사용하여 손상되지 않은 상피 조직에서 세포 내 밀매 및 BM 단백질 분비를 연구하는 데 관심이있는 과학자들에게 특히 유용합니다. 또한, 상피 조직 분석을 초파리 유전학의 광범위한 도구와 결합 할 수있는 능력은이 접근법을 특히 강력하게 만듭니다. 마지막으로, 이러한 프로토콜은 수포 밀매 및 관심있는 다른 단백질의 분류를 연구하기 위해 쉽게 적응 될 수 있습니다.
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Protocol
1. 난소 해부를위한 비행 준비
- 원하는 유전자형의 초파리 멜라노가스터 암컷 파리(1-2일령)를 10-15~8 mL의 초파리 플라이 배지가 들어있는 좁은 바이알에 넣고 25°C에서 해부 2-3일 전에 소량의 과립화된 베이커스 효모를 뿌린다. 바이알에 수컷 몇 마리를 추가하면 계란 챔버 수율을 높일 수 있습니다. 그러나 난소 발달에 부정적인 영향을 줄 수 있으므로 파리의 총 수가 20을 초과하지 않도록하십시오.
참고 : Drosophila 남성과 여성에 대한 설명과 이전의 Drosophila 경험이없는 과학자를위한 유용한 팁과 조언은 인용 된 기사34,52에서 찾을 수 있습니다. 효모를 추가하면 계란 생산을 자극하고 다른 단계를 나타내는 난소가 생성됩니다. 또한, 그것은 또한 난소를 살찌게하고 절제하기 쉽게 만듭니다. 젖은 효모는 과립 화 된 효모 대신 사용할 수도 있지만, 약한 주식의 경우 파리가 붙어서 죽을 수 있습니다.
2. 난소 해부 및 고정
참고 : 난소 해부 및 염색에 대한 추가 자료는 인용 된 프로토콜53,54,55로 이동합니다.
- 해부 당일에, PFA 원액을 1x 인산완충식염수(PBS)로 희석하여 최종 농도 4% 파라포름알데히드(PFA)로 신선한 고정용액을 제조하였다.
- CO2를 사용하여 파리를 마취시키고 플라이 패드에 놓습니다. 해부까지 파리를 마취하십시오. 움직임이 멈 추면 파리를 적절하게 마취 한 파리를 고려하십시오.이 파리는 보통 10-20 초가 걸립니다.
참고 :CO2 를 사용하는 것이 더 안전하고 빠른 옵션으로 권장되지만 파리는 얼음을 사용하여 마취 할 수 있습니다. - 유리 오목한 슬라이드 또는 얕은 우울증 우물이있는 염색 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 우물을 1x PBS로 채 웁니다.
- 한 쌍의 포셉을 사용하여 흉부 아래쪽에서 암컷 파리를 잡으십시오. 복부의 후부 끝에 남성 생식기가 없거나 이차 특성52로 앞다리에 섹스 빗이 없기 때문에 파리의 성별을 보장하십시오. 파리를 다른 한 쌍의 포셉 (2.5 단계)을 사용하여 개별적으로 해부하면서 해부 현미경으로 1x PBS로 채워진 웰에 잠기십시오 (20x 배율 권장).
- 해부 현미경을 들여다 보면서 다른 한 쌍의 포셉을 사용하여 비행 복부의 후부 부분을 잡아 당겨 내부 장기 (예 : 난소, 내장)를 볼 수있게하십시오.
- 플라이 복부의 앞쪽 부분 (치약 튜브와 마찬가지로)을 부드럽게 짜서 난소를 복부에서 강제로 밀어냅니다. 이 방법은 난소를 그대로 유지해야합니다. 다른 장기를 분리하고 조심스럽게 제거하고 파편을 날립니다.
- 포셉이나 해부 바늘을 사용하여 난소의 난소를 분리하면서 전체 난소 구조를 그대로 유지하십시오. 이 단계의 목적은 난소를 덮고 있는 근육 외피를 부수고 보다 효율적이고 균질한 염색을 허용하는 것이다.
- 난소를 1x PBS가 들어있는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 신속하게 옮기고 모든 파리가 해부 될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 미세소관 또는 미세필라멘트(또는 이들 세포골격 성분에 의해 밀매된 소포)가 탈중합을 일으킬 수 있으므로 시각화되어야 하는 경우 튜브를 얼음 위에 두지 마십시오.
- 일단 모든 난소가 해부되고 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨지면, 튜브의 바닥으로 가라 앉히고 ~ 50 μL의 PBS를 제외한 모든 것을 제거하십시오. 4% PFA 1mL를 넣고 영양가 플랫폼 로커에 15분 동안 놓습니다. 중요한 것은 난소가 고정 용액에서 앞뒤로 움직이고 있는지 확인하여 불완전한 고정이 염색 및 이미징 문제로 이어질 수 있으므로 적절한 고정을 허용하십시오.
참고 : 너트 레이터의 속도는 중요하지 않습니다. 일부 너트 레이터에는 속도 제어 기능이 있지만 다른 너트 레이터에는 사전 설정된 속도가 제공됩니다. 사전 설정 속도로 충분하며 조정 가능한 경우 40-50rpm으로 설정하십시오. - 고정 용액을 제거하고(단계 2.9에서와 같이), 0.1% Triton-X 100(1x PBST)을 함유하는 1 mL의 1x PBS로 2개의 빠른 세척을 수행한 후, 마이크로퍼지 튜브를 5-6회 부드럽게 반전시킨다. 이어서, 1 mL의 1x PBST (총 40-60 분)로 4 개의 10-15 분 세척 (긴 세척)을 진행하십시오.
참고: 세제의 비율을 높이면 GFP 변성이 발생하여 형광이 감소하고 GFP 태그가 지정된 BM 단백질이 검출될 수 있으므로 세척에 1x PBS + 0.1% Triton-X 100을 사용하는 것이 좋습니다. - 염료 염색, 예를 들어, DNA 및 F-액틴 염색을 위해, 단계 3으로 진행한다. 면역염색을 위해, 단계 4로 진행한다. 난소는 진행하기 전에 최대 24시간 동안 4°C에서 1x PBST에 보관할 수 있습니다.
3. 표준 DNA/F-액틴 염색
- 고정 및 세척 후, PBST를 제거한다. 500 μL의 DNA 및 F-Actin 염색 용액을 첨가하십시오. DNA/F-Actin 용액을 제조하기 위해, Hoechst (DNA 염색; 1 mg/mL 원액의 1:1000 희석)와 형광단 태깅된 팔로이드인 (F-액틴 염색; 알렉사 플루오르 546의 경우 1:500 희석 또는 알렉사 플루오르 647에 대한 1:100 희석액, 각각 66 μM 원액)을 PBST의 500 μL에 혼합한다.
- 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 난소와 염료를 어둠 속에서 유지하여 효율적인 이미징을 위해 형광을 유지하고 15 분 동안 영양가있는 플랫폼 로커에서 배양하십시오.
- 인큐베이션 후, DNA/F-Actin 용액을 제거한다(단계 2.9에서와 같이). 단계 2.10에 설명된 대로 1x PBST에서 두 번의 빠른 세척과 세 번의 긴(10-15분) 세척을 수행합니다. 단계 5에 설명된 대로 장착을 진행합니다.
4. 형광면역염색
참고: 이것은 형광 이미징을 위한 표준 면역염색 프로토콜이며 대부분의 일차 항체와 호환됩니다.
- 차단 및 1차 항체 면역염색 (1일차)
- 고정 및 세척 후, 단계 2.9에 기재된 바와 같이 PBST를 제거한다. 블로킹 용액 1 mL (PBS + 5% BSA)를 첨가하고 최소 1 시간 동안 영양가 플랫폼 로커에서 난소를 차단하십시오.
참고: BSA 이외에, 우태아 혈청(FBS) 또는 정상 염소 혈청(NGS)을 차단 용액에 첨가할 수 있습니다. 대안적으로, 난소는 4°C에서 영양화 플랫폼 로커 상에서 하룻밤 동안 차단될 수 있다. - 단계 2.9에서와 같이 블로킹 용액을 제거하고, 블로킹 용액에 적절한 농도(사용된 항체에 특이적)로 희석된 일차 항체를 함유하는 일차 항체 용액 300 μL를 첨가한다. 4°C에서 영양화 플랫폼 로커 상에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날, 일차 항체 용액을 제거하고 이차 항체 면역염색을 진행한다.
참고: 일부 일차 항체는 저장하고 재사용할 수 있습니다. 일부 예에서, 재사용된 일차 항체는 배경 염색을 감소시킬 수 있고, 더 나은 이미징을 초래할 수 있다. 그러나, 재사용은 효율성을 보장하기 위해 각 항체에 대해 테스트되어야 한다.
- 고정 및 세척 후, 단계 2.9에 기재된 바와 같이 PBST를 제거한다. 블로킹 용액 1 mL (PBS + 5% BSA)를 첨가하고 최소 1 시간 동안 영양가 플랫폼 로커에서 난소를 차단하십시오.
- 2차 항체 면역염색 (2일차)
- 일차 항체 용액을 제거한 후, 단계 2.10에서와 같이 2개의 빠른 세척 및 네 개의 긴 (10-15분) 세척을 수행한다. 신선한 1x PBST를 사용하여 조심스럽게 반복적 인 세척을 수행하면 비 특정 배경이 줄어들고 최적의 이미징으로 이어집니다.
- 단계 2.9에서와 같이 PBST를 제거하고 사용된 일차 항체를 검출할 형광 이차 항체를 함유하는 이차 항체 용액 500 μL를 첨가한다. 이 시점부터 알루미늄 호일로 튜브를 덮어 빛으로부터 보호하여 형광을 최적으로 보존하며, 이는 이미지 획득 및 분석에 매우 중요합니다.
참고: 이차 항체 용액은 내인성으로 태그된 단백질과 겹치지 않는 형광단과 접합된 이차 항체를 함유해야 한다. 예를 들어, GFP 태깅된 단백질을 사용하는 경우, 적색 또는 원적색 파장에서 알렉사 플루오르 이차 항체의 사용이 권장된다 (예를 들어, 546, 568, 또는 647 nm). 형광 염료, 예컨대 Hoechst 및 Alexa Fluor 546 또는 647 컨쥬게이션된 phalloidin이 보조 용액에 첨가될 수 있다. 이들 얼룩은 전체 세포 구조 (즉, 핵 및 F-Actin)를 표시하는데 도움이 될 수 있다. 농도에 대해서는 단계 3.1을 참조한다. - 난소를 2차 항체 용액 중의 영양화 플랫폼 로커 상에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 2.10 단계에서와 같이 1x PBST에서 두 번의 빠른 세척과 네 번의 긴 (10-15 분) 세척을 수행하십시오. 5단계와 같이 장착을 진행합니다.
5. 얼룩진 난소의 장착
참고 :이 방법은 난소가 잘 발달되고 풍부한 경우 매우 잘 작동합니다. 슬라이드에 난소를 조심스럽게 장착하는 것은 최적의 이미징을 위해 매우 중요합니다.
- 마지막 세척 후 p1000 피펫을 사용하여 난소를 튜브에서 위아래로 부드럽게 피펫하여 계란 챔버를 분리하십시오. 튜브를 5-10 분 동안 똑바로 세운 상태로 유지하여 달걀 챔버가 바닥에 가라 앉도록하십시오. 개별 달걀 챔버를 신중하게 분리하는 것은 최적의 이미지 수집을 달성하는 데 중요합니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBST를 제거하고 ~50 μL를 남겨 둡니다. p200 피펫을 사용하여 남은 PBST를 최대한 제거하십시오. 22mm x 22mm 커버슬립에 고르게 펴질 수 있을 정도로 장착 매체 두 방울을 추가합니다. 난소는 장착하기 전에 최대 1개월 동안 4°C의 마이크로원심분리 튜브에 장착 매체에 저장할 수 있습니다.
참고: 여러 가지 장착 매체가 상업적으로 제공됩니다. 최적의 이미징 조건을 달성하기 위해 Aqua-Poly/Mount 또는 ProLong Glass Antifade Mountant와 같은 하드 세팅 마운서트를 사용하는 것이 좋습니다. 장착 매질로서 글리세롤의 사용은 불량한 이미징 조건(예를 들어, 형광단 불안정성)을 초래할 수 있기 때문에 권장되지 않는다. 중합되지 않는 마운팅 미디어의 경우, 커버슬립 실란트/매니큐어를 사용하여 커버슬립을 밀봉하여 제자리에 고정하십시오. - 유리 슬라이드에 라벨을 붙이고 먼지가 없는 부드러운 종이로 닦아내어 먼지와 지문을 제거합니다. p200 피펫 팁의 끝을 차단하여 점성 장착 매체를 마이크로 원심분리 튜브에서 슬라이드로 쉽게 옮길 수 있습니다. 다음으로, 장착 매체의 모든 달걀 챔버를 천천히 유리 슬라이드로 옮겨 거품이 생기지 않도록하십시오.
- 해부 현미경으로 장착 매체를 부드럽게 펼치고 새로운 p200 팁 또는 포셉을 사용하여 분리 된 달걀 챔버를 커버 슬립 크기의 영역을 덮습니다.
- 포셉을 사용하여 커버 슬립 (먼지가없는 종이로 청소)을 조심스럽게 달걀 챔버에 비스듬히 올려 놓고 거품을 피하십시오.
- 슬라이드를 2일 동안 어둠 속의 평평한 표면에 실온에서 보관하여 중합시킨다. 일단 장착 매체가 경화되면, 슬라이드는 이미징을 위해 몇 주 동안 어둠 속에서 4°C에서 저장될 수 있다.
참고: 이미징 전에 하드 세팅 장착 매체가 중합되는 것이 중요합니다. 배지가 아직 중합되지 않은 경우, 난소는 커버 슬립 아래에 떠 다니며 이미지 획득에 영향을 미칩니다. 또한 장착 매체의 최적 반사 지수는 완전히 설정된 후에 만 달성됩니다 (자세한 내용은 제조업체 정보 참조). - 대체 장착 방법: 이 방법은 난소가 풍부하지 않은 경우 조직 손실을 줄이기 위해 권장됩니다. 이 방법(이하 설명)에서, 단계 5.1에 기술된 바와 같이 피펫팅에 의해 마이크로원심분리 튜브에서 이들을 분리하는 대신에 장착하면서 슬라이드 상의 난소와 달걀 챔버를 분리한다.
- 마지막 세척 후, 세척 용액의 ∼100 μL를 제외한 모든 것을 제거하였다. 파스퇴르 피펫 또는 p1000 피펫을 사용하여 PBS의 손상되지 않은 난소를 슬라이드로 옮깁니다. p200 피펫을 사용하여 슬라이드에서 PBST를 최대한 조심스럽게 제거합니다. 필요한 경우 먼지가 없는 용지를 사용하여 PBST를 닦아냅니다. 난소를 만지지 마십시오.
- 장착 미디어 두 방울을 추가합니다. 포셉이나 해부 바늘을 사용하여 난소와 달걀 챔버를 조심스럽게 분리하십시오. 외부 조직을 제거하고 버리고, 장착 매체에 계란 챔버와 난소를 퍼뜨립니다. 5.5-5.6단계로 진행합니다.
6. 공초점 이미지 획득
참고: 이 섹션에서는 공초점 현미경을 사용하여 최적의 이미지 수집을 달성하기 위한 주요 매개 변수를 제공합니다(그림 2).
- 현미경을 설치하고 아래에 설명 된대로 샘플을 찾습니다.
- 이미징하기 전에 형광 현미경의 아이피스를 사용하여 관심 영역(ROI)을 찾는 것이 중요합니다. 낮은 배율 목표(20x) 또는 이미지 획득에 사용할 목표(즉, 40x 또는 63x)를 사용합니다. 이미지를 만들 계란 챔버를 선택합니다.
참고: 이미지 수집의 경우 40x 또는 63x와 같은 고배율 목표를 사용하는 것이 좋습니다(6.2.1 참조). - ROI가 선택되면 이미지 획득으로 진행하십시오. 공초점 이미징의 경우 단계 6.2로, 초해상도 이미징의 경우 단계 7로 진행합니다.
- 이미징하기 전에 형광 현미경의 아이피스를 사용하여 관심 영역(ROI)을 찾는 것이 중요합니다. 낮은 배율 목표(20x) 또는 이미지 획득에 사용할 목표(즉, 40x 또는 63x)를 사용합니다. 이미지를 만들 계란 챔버를 선택합니다.
- 아래에 설명된 바와 같이 최적의 이미지 획득을 위한 키 파라미터들을 선택하십시오(대표적인 이미지들에 대한 주요 파라미터들의 예들은 표 1에 제시되어 있다).
- 목표 선택: FE에서 BM 단백질의 세포내 밀매 및 분비의 공초점 이미지 획득을 위해, 40x 또는 63x 목표를 사용하십시오.
참고: 가능한 한 최상의 해상도를 얻으려면 가장 높은 무색 보정을 제공하는 높은 수치 조리개 (NA)가있는 Plan-Apochromat 목표를 사용하는 것이 좋습니다. - 각 채널/트랙에 대한 레이저 선택: GFP의 경우 레이저 488nm를 사용합니다. DAPI 또는 Hoechst의 경우 레이저 405nm를 사용하십시오. Alexa Fluor 546 또는 568의 경우 레이저 561nm를 사용하십시오. Alexa Fluor 647의 경우 레이저 640nm를 사용하십시오.
참고: 각 레이저 선택은 다른 채널/트랙 형성을 초래합니다. 여기서, 용어 채널은 각 채널의 특정 파장에서 선택된 ROI에 대해 여기된 형광단에 대한 기록된 강도 분포에 의해 형성된 이미지를 의미한다. - 핀홀 설정: 이미지 획득 중에 초점이 맞지 않는 빛을 줄이려면 각 채널의 핀홀을 1 AU로 설정합니다.
- 레이저 강도 및 검출기 게인 설정: 이미지 감도를 미세 조정하려면 검출기 마스터 게인과 레이저 파워를 모두 사용합니다. 이미지 감도를 올바르게 설정하려면 범위 표시기를 사용하는 것이 좋습니다. 마스터 게인과 레이저 파워 둘 다를 적절한 감도를 갖도록 설정하여, 검출기 포화를 피하면서 관심 구조(예를 들어, BM 함유 소포)가 명확하게 보이는 곳에 위치한다.
참고: 광표백을 방지하려면 필요한 최소한의 레이저 파워를 사용하십시오. 가능한 한 가장 낮은 레이저 전력을 사용하면서 검출기 이득을 먼저 증가시키는 것이 좋습니다. 검출기 이득의 증가가 원하는 강도를 달성할 수 없다면, 레이저 파워를 증가시킨다. 0.5 % -1.2 % 사이의 레이저 전력 강도를 권장합니다. - 프레임 크기: 획득 소프트웨어에 의해 결정된 최적의 이미지 크기를 사용하는 것이 좋습니다. 대부분의 응용 프로그램의 경우 최대 해상도 1024 x 1024를 사용합니다. 해상도가 높을수록 획득 시간이 크게 늘어납니다.
- 스캔 속도: 대부분의 샘플에서 안전한 6-9 사이의 스캔 속도를 사용합니다. 샘플이 시끄러운 경우 느린 스캔 속도를 사용하여 신호 대 잡음비를 개선하십시오. 그러나 스캔 속도가 낮으면 광표백 및 수집 시간이 늘어납니다.
- 평균 강도 평균화: 이미지 품질을 향상시키려면 동일한 설정으로 연속 스캔을 통해 평균 강도를 평균화합니다. 대부분의 경우 평균 두 개를 사용하여 샘플을 광표백하지 않고 신호 대 잡음비를 개선하십시오.
- 확대/축소: 확대/축소 기능을 사용하여 스캔 영역을 조정합니다. 가장 효과적인 값으로 40x 및 63x 목표를 모두 가진 2x-4x 사이의 줌을 사용하여 FE에서 BM 함유 소포를 명확하게 시각화하십시오. 최소 ROI를 신중하게 선택하여 획득 시간을 줄입니다.
- 목표 선택: FE에서 BM 단백질의 세포내 밀매 및 분비의 공초점 이미지 획득을 위해, 40x 또는 63x 목표를 사용하십시오.
- Zeiss Zen 소프트웨어를 사용하여 z-스택을 획득하려면 다음 Z-sectioning 매개변수를 사용하여 아래 설명된 대로 설정합니다.
참고: BM 단백질을 포함하는 소포 및 기타 세포 내 구조는 3차원(3D) 구조입니다. FE를 통해 z-스택을 획득하면 이미지 품질과 해상도가 크게 향상됩니다. 일반적으로 조직의 두께 / 깊이에 걸친 범위는 세포 내 국소화를 효율적으로 시각화하기에 충분합니다. 최적의 3D 재구성을 위해서는 소프트웨어에 의해 결정되는 최적의 간격을 사용하는 것이 좋습니다. 40x 및 63x 목표의 경우 최적의 3D 재구성이 가능하도록 각 z-섹션 사이에 0.5μm보다 높은 간격을 피하십시오.- 획득 탭 아래의 메인 영역에서 z-Stack 체크상자를 클릭하십시오. z-스택에 대한 슬라이스당 모든 트랙 스캔 모드를 선택합니다. 이렇게 하면 각 z 위치 슬라이스에 대한 채널 트랙이 변경됩니다.
- 원하는 채널을 선택하여 표본을 관찰하고 라이브를 클릭하여 라이브 스캔을 시작하십시오. GFP 태깅된 BM 단백질을 검출하는데 필요한 채널의 사용이 권장된다.
- 설명된 대로 z-스택의 범위를 설정합니다. 현미경의 미세 조정 노브를 사용하여 시편의 한쪽 끝의 z-위치를 찾고 Set First를 클릭합니다. 마찬가지로 시편의 다른 쪽 끝에 대한 z-위치를 찾고 마지막 설정을 클릭합니다.
- z-스택의 각 위치에 대해 범위 표시기를 선택한 상태에서 각 채널을 개별적으로 클릭하고 6.2.4단계에서 설명한 대로 필요에 따라 레이저 및 마스터 게인의 강도를 조정합니다.
- z-스택의 간격을 설정하여 6.3단계 아래의 참고에서 권장하는 대로 단계 크기를 지정합니다. 실험 시작 을 클릭하여 z-스택 획득을 시작합니다.
7. 초해상도 이미지 획득
- Airyscan 호환 목표를 선택합니다. BM 단백질의 세포내 국소화를 시각화하려면 63x 오일 목표를 사용하는 것이 최적입니다(그림 3). 목표를 63x로 설정하고 렌즈에 침지 오일 한 방울을 부드럽게 놓습니다. 커버슬립이 목표물을 향하도록 슬라이드를 목표물에 올려 시편을 찾습니다.
- 아래에 설명된 대로 형광단에서 이미지에 대한 적절한 설정이 있는 구성을 선택합니다.
- 획득 탭에서 스마트 설정 버튼을 클릭하여 새 실험을 구성합니다. Airyscan (초해상도)을 선택하십시오. 이 옵션을 선택하면 해상도(Airyscan SR), SNR/감도(Airyscan Confocal) 및 속도(멀티플렉스 SR-2Y) 중에서 추가로 선택해야 합니다. 고정 조직의 경우 해상도(Resolution)를 선택하면 최상의 획득이 가능합니다.
- 실험 구성 상자에서 +를 클릭하여 트랙/채널을 추가합니다. 염료 데이터베이스에서 특정 염료에 대한 트랙을 선택합니다. 다중 채널 실험의 경우 적절한 염료를 선택하여 필요에 따라 각 트랙을 추가합니다.
- 모든 트랙이 추가되면 소프트웨어에서 제공하는 실험 제안 중 하나를 선택합니다. 이 실험에서는 가장 스마트한 (라인) 제안에 비해 속도가 약간 느려지지만 각 염료에 대해 최상의 하드웨어 설정을 만들어 최대 신호 이득과 최소한의 방출 누화를 초래하므로 Best Signal을 사용하십시오. 실험이 설정되고 로드되면 획득 탭의 이미징 설정 창에 나타납니다.
- 스마트 설정이 선택되면 검출기 GaAsP-PMT의 파장 범위가 자동으로 선택됩니다. 아래쪽의 스크롤 막대를 이동하여 범위를 조정하여 범위를 늘리거나 줄이거나 필요에 따라 범위를 다른 영역으로 완전히 이동합니다. 누화를 피하기 위해 서로 다른 두 채널의 범위가 겹치지 않도록 하려면 이 옵션을 사용합니다. 나중에 다시 사용할 구성을 저장합니다.
- 구성이 설정되면 6.2.8 단계와 같이 확대/축소 및 스캔 영역을 조정합니다. 스캔 영역을 최적화하여 관심 영역에 초점을 맞추어 스캔 시간과 저장 공간을 줄입니다. 이미지 획득을 진행합니다.
- 각 개별 채널에 대해 채널 에서 트랙을 선택하고 라이브를 클릭합니다. 6.2.4단계에서 설명한 범위 표시기 도구를 사용하여 마스터 게인 및 레이저 전력을 조정하고 포화 픽셀을 피하기 위해 설명된 모든 지침을 따르십시오. 육각형 검출기 뷰가 Airyscan 검출기 보기 버튼을 클릭하여 중앙에 배치되고 정렬되어 있는지 확인합니다. 대부분의 경우, 육각형 검출기 뷰는 자동으로 중앙에 배치되고 정렬됩니다. 추가 채널에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 획득 모드 토글 창의 이미지 크기에서 SR (초해상도 제한 픽셀 수)을 클릭하여 검출기의 기능을 최대화합니다. 그러면 프레임 크기가 자동으로 조정됩니다.
- 일반적으로 필요하지 않으므로 평균을 None 으로 유지하면 스캔 시간이 줄어 듭니다. 일부 경우에, 평균 2x는 신호 대 잡음비를 향상시킬 수 있다.
- 8비트 데이터 심도로 원시 데이터를 수집합니다. 스냅을 클릭하여 이미지를 획득합니다. z-스택을 획득하려면 6.3단계를 따르십시오.
- 아래에 설명된 대로 이미지 처리를 수행합니다. 그러면 16비트 이미지가 생성됩니다.
- 이미지 또는 z-스택을 얻으면 처리 > 방법을 클릭하고 Airyscan 처리를 선택하십시오.
- 자동 필터를 수행하여 SR 값을 변경하여 추가 수동 처리를 수행하여 샘플에 대한 최상의 결과를 얻습니다. 최적의 SR 값이 결정되면 적용 을 클릭하여 처리된 이미지를 생성합니다. z-스택 이미지의 경우 3D 처리 상자를 클릭하여 하나의 z-슬라이스(현재 이미지 [ 2D ]) 또는 전체 z-스택으로 처리합니다.
8. 이미지 처리 및 데이터 분석 (직교 투영, 3D 재구성 및 강도 프로파일)
참고: 이 방법의 경우 직교 투영, 3D 재구성 및 강도 프로파일을 생성하는 데 사용되는 단계는 Zen 소프트웨어에 대해 설명합니다( 재료 표 참조). 유사한 데이터 분석이 또한 ImageJ 소프트웨어(56)와 함께 수행될 수 있다.
- 아래에 설명된 대로 직교 투영을 수행합니다(그림 4).
- 공초점 또는 초분해능 현미경을 사용하여 z-스택을 얻은 후에는 직교 투영을 생성하여 셀의 z축에 있는 소포를 2D 뷰로 볼 수 있습니다(3D 재구성과 비교). 이렇게 하려면 처리 > 방법을 클릭하고 직교 투영을 선택합니다.
- 매개변수에서 필요한 투영 평면을 선택합니다. z축(z-스택)의 투영을 위해 정면(XY) 평면을 선택합니다. 방법에서 최대 값을 선택하여 최고 품질의 투영을 생성합니다.
- 다음으로, 시작 위치(시작 z-슬라이스)를 선택하여 투영의 두께를 결정하고, 투영에서 두께(총 z-슬라이스 수)를 결정합니다. z축에서 한 셀의 두께와 동일한 두께를 선택하는 것이 이상적입니다.
- 매개변수가 설정되면 적용 을 클릭하여 XY 평면 방식으로 z-스택의 투영을 생성합니다.
참고: 관심 있는 특정 객체의 양을 비교하기 위해 여러 z-스택의 직교 투영을 만들 때는 데이터 정확성을 위해 프로젝션의 두께를 동일하게(또는 가능한 한 가까운) 상태로 유지해야 합니다.
- 아래에 설명된 대로 3D 재구성을 수행합니다(그림 5).
- z-스택의 3D 재구성을 만들어 구조의 현지화 및 모양을 관찰합니다. 공초점 및 초해상도 접근법을 사용하여 획득 한 z-스택에 대해이 작업을 수행하십시오. 초분해능 z-스택을 먼저 3D 재구성을 위한 7.8단계에서와 같이 3D 처리를 사용하여 처리합니다.
- 3D 이미지를 생성하려면 미리 보기 창에서 3D 아이콘을 클릭합니다. 클릭하면 3D 탭이 화면 하단의 디스플레이 제어 섹션에 나타납니다. 투명도, 볼륨, 최대, 서피스 및 혼합과 같은 3D 뷰가 표시됩니다. 소포의 구조를 볼 때 서피스 또는 혼합 뷰를 사용합니다(선호).
- 최고 품질의 이미지를 얻으려면 가장 빠른 설정의 정확도 가 떨어지고 3D 렌더링이 불량해지므로 정밀 설정을 선택합니다.
- 이미지가 생성되면 원하는 위치에 초점을 맞추기 위해 회전 및 확대/축소를 통해 이미지를 조작하여 원하는 개체를 볼 수 있습니다. 모양 탭 아래에서 3D 이미지를 조작합니다.
- 만족스러운 뷰가 확보되면 3D 탭에서 표시된 해상도를 선택한 다음 이미지 생성을 클릭하십시오. 이렇게 하면 이미지를 본 것과 동일한 방향으로 이미지의 스냅숏이 만들어지고 다양한 파일 형식으로 저장 및 내보낼 수 있습니다.
- 아래에 설명된 대로 강도 프로파일을 생성합니다(그림 7).
참고: 서로 다른 형광 신호와 연관된 픽셀의 분포 및 강도 프로파일은 오버레이 이미지로 간주되어 공동 지역화를 결정할 수 있습니다.- 공초점 또는 초해상도 이미징을 통해 최적의 이미지를 획득한 후 미리보기 창의 보기 패널에서 프로파일을 클릭합니다. 미리 보기 창에는 강도 프로파일을 거리의 함수로 표시하는 히스토그램과 거리 및 강도 값을 보여 주는 표가 나타납니다.
- 화면 하단의 디스플레이 컨트롤 영역에서 프로파일 정의 탭에서 화살표 도구를 클릭합니다. 다른 픽셀의 강도 프로파일을 평가해야 하는 오브젝트의 길이를 따라 화살표를 그립니다. 화살표를 그리려면 이미지를 확대합니다.
- 강도 프로파일이 이미지 미리 보기의 왼쪽에 나타나며, 화살표 경로를 따라 거리와 해당 피크가 표시됩니다. 이미지 자체에 표시된 히스토그램을 제거하려면 그래픽에서 프로파일 표시 상자의 선택을 취소합니다.
- 디스플레이 제어 영역의 치수 탭에서 강도 프로파일에 포함되지 않을 채널을 선택 해제합니다.
- 그래픽 탭에서 주석/측정 상자 아래에 표시된 프로파일을 두 번 클릭하여 그래픽 요소 서식 팝업 상자를 엽니다. 이 옵션을 사용하여 화살표의 색상과 스타일 및 획 두께를 변경할 수 있습니다. 원하는 설정을 선택한 후 상자를 닫습니다.
- 프로파일 보기 탭을 클릭합니다. 새 이미지 섹션에서 현재 보기를 클릭한 다음 다른 이름으로 저장을 클릭하여 파일을 저장합니다. 데이터 압축 및 손실을 피하기 위해 파일을 .tif 파일로 저장하는 것이 좋습니다.
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Representative Results
본원에 기재된 방법은 초파리 난소의 FE와 같은 편광된 상피 세포에서 BM 단백질의 세포내 밀매 및 분비를 효율적이고 정확하게 이미지화하고 특성화하는데 사용될 수 있다. 다음으로, 우리는 설명 된 방법을 사용하여 얻은 예상 결과뿐만 아니라 유용한 조언 및 잠재적 인 함정을 제공합니다. 그렇게 하기 위해, Vkg-GFP, 내인성 태깅된 Vkg(초파리 콜 IV)이 사용된다. 그러나, 동일한 결과가 Pcan-GFP와 같은 다른 내인성 태깅된 BM 단백질과 함께 달성될 수 있다.
최적의 수집 파라미터 설정(그림 2)
상피 세포에서 Vkg 및 Pcan과 같은 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 정확하게 특성화하기 위해서는 제공된 방법에 설명 된 바와 같이 공초점 현미경의 획득 매개 변수를 적절하게 설정하는 것이 중요합니다.
공초점 현미경을 사용하여, Vkg-GFP의 세포내 국소화는 FE에서 분비되고 기저로 침착되기 전에 검출될 수 있다(도 2A). ER에서 번역 후, Coll IV는 세포 내 외래 소포로 포장되기 전에 골지로 운반되는 것으로 나타났습니다. 이 이미징 접근법을 사용하여, 우리는 Vkg-GFP가 상이한 형상의 세포내 구획에 축적되어 잠재적으로 상이한 소기관, 엔도솜 구획 및 소포 유형을 나타내는 것을 관찰한다(도 2A, 화살표). 외래 소포에서 Coll IV는 이미 두 개의 α1 쇄와 하나의 α2 쇄 ( 초파리의 Vkg)의 세 가지 폴리펩티드로 구성된 피브릴로 조립되어 공초점 이미징을 사용하여 시각화 할 수있는 스트레칭 된 소포의 형성을 유도합니다 (그림 2A, 화살표). 이어서, Coll IV는 BM에 침착되는 상피 세포로부터 기저로 특이적으로 분비된다(도 2, 화살촉).
획득 파라미터가 적절하게 설정되지 않으면, BM 단백질의 세포내 밀매하는 동안 상이한 형태와 위치를 정확하게 관찰할 수 없다(도 2B,C). 예를 들어, 획득 파라미터가 세포내 구조가 아닌 세포외 BM을 시각화하도록 최적화된 경우, BM 단백질-함유 엔도솜 구획 및 소포(여기서 Vkg-GFP로 표시됨)는 희미하게 나타나거나 보이지 않는다(도 2B). 반대로, 검출기가 지나치게 포화된 경우, Vkg-GFP의 세포내 국소화는 최적의 조건에서와 같이 검출될 수 있지만(도 2A 및 도 2C 비교), 배경 형광 잡음의 증가는 BM 단백질 국소화의 해석을 더욱 어렵게 만들고, 특히 공동국재화 실험의 경우 더욱 어렵게 만든다(도 7 참조). ). 전반적으로, 이러한 데이터는 상피에서 BM 단백질의 정확한 국소화를 달성하기 위해 적절한 획득 파라미터의 중요성을 보여준다.
최적의 초분해능 및 디컨볼루션 매개변수 설정(그림 3)
공초점 이미지 획득을 위해 예시된 바와 같이, 저채도 또는 과포화를 피하기 위해 초분해능 현미경을 사용할 때 획득 파라미터를 적절하게 설정하는 것도 중요하다. 이 초해상도 이미징 접근 방식에는 초해상도 이미징을 달성하기 위해 디컨볼루션 파라미터를 신중하게 구성하는 작업도 포함됩니다(그림 3). 디컨볼루션 처리가 최적으로 구성되면, 초분해능 이미징은 BM 단백질을 포함하는 세포 내 구조의 분해능을 상당히 증가시키며(도 3A, 화살표), 예컨대 소포 또는 골지 구조(도 3A 및 도 7C), BM 자체(도 3A, 화살촉), 신호 대 잡음비(45)를 향상시킨다. . 초분해능 현미경 검사는 공초점 현미경에 비해 세 가지 공간 차원 모두에서 해상도가 ~ 2 배 증가합니다. 이러한 해상도의 증가는 표준 CSLM으로 촬영된 것과 비교하여 초해상도 이미징을 사용하여 촬영된 BM 및 BM의 세포내 밀매에 대한 더 잘 정의된 이미지에 의해 명확하게 설명된다(도 2A 및 도 3A 비교).
디컨볼루션 매개변수가 제대로 설정되지 않으면 초분해능이 최적으로 달성되지 않고 분해능 증가가 손실됩니다. 초해상도 이미지의 과소 처리는 흐릿한 이미지로 이어지고, BM 단백질의 세포 내 국소화가 희미하게 나타나고 최적의 조건에서처럼 잘 정의되지 않습니다 ( 그림 3B 와 그림 3A를 비교하십시오). 반대로, 이미지의 과다 처리는 거친 이미지로 이어지며, BM 단백질의 세포 내 국소화는 픽셀화되어 나타납니다 (그림 3C). 이러한 데이터는 BM 단백질의 세포 내 분포를 반영하는 의미 있고 대표적인 이미지를 달성하기 위해 적절한 디컨볼루션 파라미터를 사용하는 것의 중요성을 강조합니다.
전체적으로, 이러한 데이터는 공초점 현미경에 비해 초해상도 이미지 프로세싱을 사용하는 BM 단백질의 세포 내 밀매의 향상된 해상도를 명확하게 보여주고 강조합니다. 구체적으로, 이러한 접근법은 관련된 세포내 구조의 분해능을 강화함으로써 BM 단백질의 세포내 트래피킹의 더 나은 시각화를 허용한다. 이를 통해 구조의 다양한 크기와 모양을 비교하여 FE에서 BM 단백질의 편광 증착에 관련된 새로운 요인을보다 잘 식별하고 특성화 할 수 있습니다.
BM 단백질의 세포내 분포의 시각화를 향상시키기 위해 FE를 통한 광학 z-섹션(z-stack)의 직교 투영 및 3D 재구성(그림 4 및 그림 5)
BM 단백질의 세포내 분포가 3D(x-, y- 및 z축)에서 FE 전체에 걸쳐 존재하기 때문에, 초분해능 또는 공초점 현미경을 사용하여 FE를 통한 광학 z-절편의 직교 투영 및/또는 3D 재구성은 야생형 또는 돌연변이 세포 내에서 BM 단백질의 국소화 및 분포를 평가하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 도 4 및 도 5에서).
직교 투영을 사용하면 획득한 모든 z-단면이 단일 평면에 투영될 수 있습니다. 이 방법은 공초점(도 4A) 또는 초해상도(도 4B) 이미징을 사용하여 단일 이미지에서 BM 단백질을 함유하는 소포 및 구획의 전체 분포를 보여주는데 특히 유용하다. 그러나 공초점 현미경보다 초분해능 현미경을 사용할 때 훨씬 더 나은 해상도와 배경 잡음 결과가 발생합니다 (그림 4B와 그림 4A를 비교하십시오).
BM 함유 구획 및 소포의 전체 분포를 시각화하는 또 다른 접근법은 공초점(도 5A) 또는 초분해능(도 5B) 이미징에 의해 취해진 광학 z-단면의 스택을 조립하여 3D 재구성을 생성하는 것이다. 이 접근법은 또한 특히 초분해능 현미경을 사용하는 경우 세포내 BM 단백질의 국소화 및 분포 및 Vkg-GFP를 함유하는 구획 및 소포의 형태를 평가하는 데 매우 효율적일 수 있다(도 5). 전통적인 공초점 현미경(그림 5A)은 초분해능(그림 5B)과 비교할 때 배경 잡음이 더 높으며, 3D 렌더링에서 설명될 때 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 또한, 공초점의 낮은 해상도는 또한 생성된 이미지들이 초해상도에 의해 생성된 이미지들보다 덜 매끄럽고 정의되는 결과를 가져온다(도 5A와 도 5B를 비교하라).
초분해능 이미징을 이용한 BM 단백질의 편광 분비에 관여하는 성분의 손실과 관련된 표현형의 특성화(도 6)
지금까지(도 2, 도 3, 도 4, 및 도 5)에 나타낸 바와 같이, 초분해능 현미경 및 이미지 처리는 초파리 난소의 야생형 FE에서 BM 단백질의 세포내 국소화 및 분포를 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 이러한 접근법은 또한 돌연변이 또는 녹다운 조건에서 BM 단백질의 국소화를 결정하고 비교하는데 사용될 수 있다. 이에 의해, BM 단백질의 편광된 세포내 밀매, 분비 및 침착에 전념하는 새로 확인된 성분들의 역할(들)을 특성화하는 효율적인 방법이다.
GTPase 교환 인자 (GEF) 크래그는 BM 단백질28의 편광 증착에 전념하는 생물학적 경로에서 핵심 성분인 것으로 나타났다. 크래 그 녹다운 FCs에서, BM 단백질은 정점적으로 그리고 기저로 모두 축적되며, 이는 크래그가 Vkg-GFP와 같은 BM 단백질의 편광된 분비를 조절한다는 것을 나타낸다(도 6). 초분해능 현미경을 사용하면 Crag의 손실로 인한 표현형을 더 잘 특성화 할 수 있습니다. 예를 들어, BM 단백질의 강한 정점 축적뿐만 아니라 자궁외 정점 BM의 조직도 Crag-knockdown FCs에서 관찰됩니다 (그림 6B, 화살촉). 더욱이, 표현형이 덜 비정상적일 때, FCs의 작은 패치에서 정점으로 축적되는 BM 막이 검출된다(도 6B, 화살표). 전체적으로, 이러한 데이터는 초분해능 현미경이 돌연변이 표현형을 특성화하여 BM의 편광 증착에 관여하는 성분의 역할을 더 잘 이해하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다.
공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 이미지화된 항체 및 내인성 태그가 지정된 BM 단백질을 이용한 공동 국소화 실험(그림 7)
마지막으로, 내인성으로 태그된 BM 단백질과 결합된 특정 세포내 마커 또는 새로 확인된 성분에 대한 항체의 사용은 편광된 상피에서 BM 단백질의 세포내 밀매 및 분비를 더 잘 특성화하는데 사용될 수 있다. cis-Golgi 마커 인 GM-130은이 점을 설명하는 데 사용됩니다. 분비 소포에 포장되기 전에, Coll IV는 골지로 운반된다. 공초점 (도 7A,B) 또는 초분해능 (도 7C,D) 이미징을 사용하여 Vkg-GFP의 아세포 분포를 평가할 때, 두 접근법 모두 Vkg-GFP가 GM-130과 부분적으로 공동 국소화된다는 것을 보여주며, Coll IV가 분비되기 전에 골지로 분류된다는 것을 확인한다. 그러나, 초분해능 이미징을 사용할 때 Vkg-GFP와 GM130 사이의 신호 대 잡음비 증가 및 공국재화의 더 나은 분해능이 관찰된다(도 7A와 도 7C를 비교).
더욱이, 녹색(Vkg-GFP) 및 적색(GM-130) 픽셀의 공간 분포 및 레벨이 공초점(도 7B) 및 초해상도(도 7D) 현미경으로 촬영된 FCs를 통해 광학 섹션의 형광 강도를 측정함으로써 정량화될 때, Vkg-GFP와 GM-130의 공국재화가 관찰된다. Vkg-GFP와 GM-130 픽셀의 분포는 히스토그램으로 플롯되며, 여기서 Vkg-GFP와 GM-130 피크의 겹침은 공국재화를 나타냅니다(그림 7B',D'). 따라서, 이 이미지 분석 도구를 사용하여, 특정 세포내 구획에서 Vkg-GFP의 위치가 정밀하게 결정될 수 있다. 그러나 공초점 이미지(그림 7B')와 초해상도(그림 7D') 이미지에서 생성된 히스토그램을 비교하면 초해상도 현미경 검사에서 볼 수 있듯이 더 높은 피크 강도와 더 작은 피크 부족으로 나타나는 배경 잡음 감소로 인해 더 나은 결과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있습니다(그림 7B' 및 그림 7D' 비교 )를 초해상도로 생성된 히스토그램과 연관시킵니다. 전체적으로 이러한 데이터는 공초점 현미경을 사용하여 공동 현지화를 정량화 할 수 있지만 초분해능이보다 강력한 접근 방식이므로 현지화의보다 효율적이고 정확한 정량화로 이어진다는 것을 강조합니다.
도 1: 초파리 난소의 여포 상피 (FE): 기저막 (BM) 단백질의 편광 증착을 연구하는 모델 시스템. (A) 형광 입체현미경으로 촬영한 해부 및 절제 후 온전한 난소의 이미지. 난소는 내인성 GFP-태깅된 BM 단백질(Vkg-GFP)을 발현한다. 스케일 바 = 1mm. (A') 암컷 파리의 두 난소가 난관에 부착됩니다. 각 난소에는 16-20 개의 난소가 들어 있습니다. 단일 난소가 윤곽선으로 표시됩니다 (사각형). 스케일 바 = 1 mm. (B) 종방향 절편, 공초점 현미경으로 촬영하여, Vkg-GFP를 발현하는 난소를 통해 DNA(파란색) 및 F-액틴(적색)에 대해 염색하였다. 난소는 다른 단계의 달걀 챔버로 구성됩니다. 계란 챔버는 생식 세포 (GCs)를 둘러싸고있는 단층 여포 상피 (FE)로 구성됩니다. FE는 BM 단백질 (예를 들어, Pcan 및 Vkg)을 합성하고 염기적으로 분비한다. 스케일 바 = 100 μm. (C) FE의 개략도. FE는 정점 도메인이 생식계열 세포를 향하고 기저 도메인이 BM (녹색)을 향하는 뚜렷한 정점 - 기저 극성을 가진 고전적인 상피입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 공초점 영상을 사용하여 BM 단백질의 세포내 밀매를 영상화한다. (A-C) Vkg-GFP(녹색)를 발현하는 달걀 챔버를 통한 종방향 절편을 DNA (파란색) 및 F-Actin (적색)에 대해 염색하였다. (A'-C') Vkg-GFP(화살표) 및 기저 및 세포외 침착된 BM(화살촉)을 함유하는 세포내 구획 및 소포는 공초점 현미경을 사용하여 나타내었다. (A) Vkg-GFP의 세포 내 밀매가 보이는 최적으로 획득된 이미지. (A') Vkg-GFP는 FCs의 세포질 전체에 걸쳐 상이한 세포 구획 (예를 들어, 골지) 및 소포에 국소화된다. 콜라겐 IV의 피브릴 조직으로 인해, Vkg-GFP 함유 소포는 길쭉하게 나타난다(화살표). (b) BM 단백질의 세포내 분포가 아닌 세포외 BM을 시각화하기 위해 획득 파라미터가 최적화되는 노출 부족 이미지. Vkg-GFP(녹색)는 세포질(B') 전체에 걸쳐 희미하게 나타나며, 그 결과 (A)에 비해 검출할 수 없는 Vkg-GFP 함유 소포가 생긴다. (c) GFP 검출기가 포화되어 배경 형광의 증가를 초래하는 과다 노출 이미지. Vkg-GFP(녹색)의 세포내 분포가 FCs(화살표)의 세포질 전체에 걸쳐 국한적으로 보여질 수 있지만, 과다 노출은 (A-A')에서와 같이 세포내 구조가 그들보다 더 크게 나타나는 이미징 아티팩트를 초래한다. 배율 막대 = 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 초분해능 이미징 및 프로세싱을 이용한 BM 단백질의 세포내 트래피킹을 이미징함. (A-C) 종방향 절편은 Vkg-GFP(녹색)를 발현하는 달걀 챔버를 통해 DNA(파란색) 및 F-Actin(적색)에 대해 염색하였다. (A) Vkg-GFP의 세포 내 밀매가 명확하게 관찰되는 최적으로 처리된 초해상도 이미지. (A') Vkg-GFP는 FCs의 세포질 전체에 걸쳐 상이한 세포 구획 (예를 들어, 골지) 및 소포 (화살표) 및 BM (화살촉)에 국소화된다. (B) (A)에서보다 더 높은 배경 형광을 초래하는 과소 처리 이미지. Vkg-GFP (녹색)의 세포 내 국소화는 희미하고 덜 정의 된 것처럼 보입니다 (B와 A를 비교하십시오). (c) 과도하게 처리된 이미지는 Vkg-GFP의 세포내 국소화가 픽셀화되고 거칠게 나타나는 이미지를 초래한다. 배율 막대 = 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 공초점 및 초분해능 현미경 접근 방식을 사용하여 획득 및 처리된 z-스택의 직교 투영. (A-B) Vkg-GFP(녹색)를 발현하는 달걀 챔버를 통한 광학 z-절편의 직교 투영 및 공초점(A) 또는 초분해능(B) 현미경을 사용하여 DNA(파란색) 및 F-Actin(빨간색)에 대해 염색합니다. (A) 최적의 공초점 파라미터를 사용하여 획득한 z-스택의 투영. Vkg-GFP의 세포내 국소화는 FCs(A', 화살표)에서 z축 전체에 걸쳐 관찰될 수 있다. BM도 볼 수 있으며 매우 밝게 보입니다 (A', 화살촉). (B) 최적의 초분해능 처리를 사용하여 획득한 z-스택의 투영. Vkg-GFP를 함유하는 잘 정의된 세포내 구획 및 소포는 FCs(B', 화살표)에서 z축 전체에 걸쳐 관찰될 수 있다. BM은 또한 매우 잘 정의되어 있습니다 (B', 화살촉). 표준 공초점 이미징과 수퍼 레졸루션 이미징의 차이는 Vkg-GFP와 BM의 세포 내 국소화가 표준 공초점 현미경보다 초해상도를 사용할 때 훨씬 더 정의되기 때문에 분명합니다. 또한, 공초점 현미경으로 촬영 한 이미지는 배경 형광이 더 높습니다. 배율 막대 = 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 공초점 및 초분해능 현미경 접근 방식을 사용하여 획득 및 처리된 z-스택의 3D 재구성. (A-B) Vkg-GFP(녹색)를 발현하는 달걀 챔버의 z-스택(혼합 뷰)의 3D 렌더링 및 DNA(파란색) 및 F-액틴(빨간색)에 대해 염색됨. (A) 공초점 현미경을 통해 획득한 z-스택의 3D 렌더링. Vkg-GFP를 함유하는 구획 및 소포의 위치 및 형태는 세포 전체에 걸쳐 볼 수 있다(A'). (B) 최적의 초해상도 처리를 통해 획득한 z-스택의 3D 렌더링. Vkg-GFP를 함유하는 구획 및 소포의 위치 및 형상을 볼 수 있다(B'). BM과 핵뿐만 아니라 소포의 모양이 부드럽게 정의되고 공초점 현미경 검사 (B'와 A'에 비해)에 비해 해상도가 더 높습니다. Vkg-GFP를 함유하는 구획 및 소포의 모양과 크기는 또한 초분해능 현미경을 사용하여 더 잘 결정될 수 있다(B' 및 A'와 비교). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 크래그 녹다운 FC에서 Vkg-GFP 현지화의 특성화. (A-B) Vkg-GFP(녹색)를 발현하는 달걀 챔버를 통해 종방향 절편을 DNA(파란색) 및 F-Actin(적색)으로 염색하고 최적의 초분해능 처리를 통해 획득했습니다. (a) 적절한 BM 침착에 중요한 단백질인 야생형 Crag를 발현하는 대조군 라인. FE는 전형적인 BM 단백질 국소화를 보여주며, 여기서 Vkg-GFP는 세포내 분포되고 FE(A') 내에 기저로 침착된다. (b) FE에서 Crag에 대한 RNAi를 발현하는 형질전환 초파리 라인은, Crag 녹다운을 초래한다. 크래그의 손실은 FE (B', 화살표 및 화살촉)에서 정점으로 BM 단백질 (예를 들어, Vkg-GFP)의 잘못된 국소화로 이어진다. 초해상도 이미지는 Crag의 손실과 관련된 BM 잘못된 현지화 표현형을 특성화하는 데 사용됩니다. 특히, 일부 Crag RNAi FC는 BM 단백질 (B', 화살촉)의 강력한 정점 오국화를 보여주는 반면, 다른 Crag RNAi FC는 약한 정점 오국소화 (B', 화살표)를 나타냅니다. 초해상도 이미징은 Crag (B', 화살표 대 화살표)의 손실과 관련된 표현형을 명확하게 보여줍니다. 배율 막대 = 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 공초점 및 초분해능 현미경 접근법을 이용한 Vkg-GFP 및 GM-130(골지 마커)의 공국재화. (A-D) Vkg-GFP를 발현하는 난자 챔버를 통한 종방향 절편과 시스-골지 마커(GM-130, 적색)에 대해 면역염색하고, 공초점(A,B) 또는 초분해능(C,D) 현미경을 사용하여 영상화하였다. (A, B) 공초점 영상은 세포내 Vkg-GFP가 시스-골지 마커(A, 화살촉)와 부분적으로 공동국소화된다는 것을 보여준다. (B) (A)의 확대 영역. 흰색 화살표를 따라 녹색(Vkg-GFP) 및 빨간색(GM-130) 픽셀의 분포가 히스토그램(B')으로 표시됩니다. 히스토그램의 x축은 화살표를 따른 거리(μm)를 나타내고 y축은 픽셀 강도를 나타냅니다. 겹치는 녹색과 빨간색 봉우리(*)는 Vkg-GFP와 GM-130이 함께 지역화되는 위치를 보여줍니다. (C,D) 초분해능 영상은 또한 세포내 Vkg-GFP가 시스-골지 마커(C, 화살촉)와 부분적으로 공동국소화한다는 것을 보여준다. (D) (C)의 확대 영역. 흰색 화살표를 따라 녹색(Vkg-GFP) 및 빨간색(GM-130) 픽셀의 분포는 히스토그램(D')으로 플롯됩니다. 히스토그램의 x축은 화살표를 따른 거리(μm)를 나타내고 y축은 픽셀 강도를 나타냅니다. 겹치는 녹색과 빨간색 봉우리(*)는 Vkg-GFP와 GM-130이 함께 지역화되는 위치를 보여줍니다. 이러한 데이터는 초해상도 이미징이 공초점 이미징보다 더 효율적이고 정확한 접근 방식임을 보여 주며 공동 현지화를 특성화하고 정량화합니다. 배율 막대 = 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 대표 이미지에 대한 공초점 및 초분해능 현미경 수집 및 처리 파라미터. 모든 주요 이미징 파라미터는 제공된 대표적인 이미지에 대해 컴파일된다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
BM은 배아 및 장기 형태 형성 및 성인 생리 기능에 중요합니다. 또한, BM은 상피 극성의 확립 및 유지를 위한 신호 전달 플랫폼 역할을 하며 조직에 지지체2를 제공한다. 그러나 BM 단백질의 적절한 배치를 조절하는 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. BM 단백질의 세포 내 밀매 및 양극화 된 분비에 전념하는 생물학적 경로를 더 잘 이해하려면 이러한 경로의 구성 요소와 BM 처리에서의 역할에 대한 신중한 분석이 필요합니다. 이를 달성하는 한 가지 방법은 공초점 및 초해상도 이미징을 사용하는 것입니다. 여기에서, 공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 FE에서 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 효율적으로 이미지화하기 위해 초파리 난소의 준비 및 염색 또는 면역염색을 위한 방법을 설명하였다.
야생형 및 돌연변이 조건에서 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 시각화하는 단백질 트랩 및 내인성 태그된 단백질의 장점
제공된 프로토콜은 단백질 트랩 및 내인성으로 태그된 BM 단백질(예를 들어, Vkg-GFP 및 Pcan-GFP)을 최대한 활용하여 야생형(대조군) 및 돌연변이 조건에서 FE에서 BM 단백질의 국소화 및 분포를 이미지화하고 평가한다. 이들 라인은 BM 단백질에 대한 항체의 사용에 비해 중요한 이점을 갖는다. 첫째, 관심있는 특정 단백질에 대한 항체는 종종 드물고 풍부하지 않습니다. 또한, 종종 관심있는 단백질의 부정확 한 관찰 및 평가를 초래할 수있는 항체와 관련된 조직 침투에 대한 문제가 있습니다. 더욱이, 단백질 트랩 라인은 (i) 유전자 발현을 조작하는 방법 (예를 들어, UAS/Gal4), (ii) 돌연변이체 및 (iii) RNA 간섭 (RNAi) 라인과 같은 BM의 적절한 침착에 필요한 인자의 기능을 결정하기 위해 사용되는 상이한 유전학 배경에 삽입될 수 있다. 마지막으로, 이들 단백질 트랩은 라이브 이미징(57)을 사용하여 BM의 국소화 및 기능을 시각화하는데 사용될 수 있다.
그러나, 관심있는 단백질에 형광 태그의 융합은 그의 국재화 및 기능을 방해할 수 있다. 따라서, 단백질에 대한 태그의 비정상적인 효과를 평가하는 것이 중요합니다. 형광 태그의 첨가가 BM 단백질의 기능 및 국소화를 방해하지 않는지 확인하는 한 가지 방법은 트랜스제닉 초파리 라인이 동형접합성 생존 가능한지를 결정하는 것이다. 본 명세서와 이전에 기술된 상이한 실험에서 사용되는 Vkg-GFP 및 Pcan-GFP 라인은 모두 동형접합성이 실행 가능하며, 이는 GFP 태그의 첨가가 이들 필수 단백질29,30의 기능을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
이미징을 위한 조직 준비, 고정 및 염색의 중요성
FE를 효율적이고 정확하게 이미지화하기 위해서는 이 방법의 지시에 따라 난소 조직을 적절하게 준비, 수정 및 염색하는 것이 중요합니다. 첫째, 해부 후 조심스럽게 다른 모든 장기를 제거하고 고정하기 전에 파편을 날립니다. 조직을 고정하기 위해 파라포름알데히드 (PFA)를 사용하는 것이 좋습니다, 그것은 밝은 GFP 형광을 유도하고 대부분의 항체와 호환되기 때문에. 그러나, PFA는 모든 항체와 양립할 수 없다; 일부는 글루타르알데히드 또는 메탄올 고정이 필요할 수 있습니다. 더욱이, 일차 항체의 비특이적 결합으로 인한 배경 형광을 피하기 위해, 난소 조직은 블로킹 용액에서 적어도 1시간 동안 영양가 플랫폼 로커 상에서 인큐베이션되어야 하고, 프로토콜에 기술된 바와 같이 일차 및 이차 항체 인큐베이션 후에 여러 번 광범위하게 세척되어야 한다. 마지막으로, 난소 조직의 적절한 장착은 최적의 이미징을 달성하는 데 필수적입니다. 이를 위해서는 서로 위에 쌓이는 것을 피하기 위해 개별 달걀 챔버를 조심스럽게 분리해야합니다. 커버슬립 아래 조직이 떠 다니는 것을 피하기 위해 이미징 전에 장착 매체를 완전히 중합시키는 것도 중요합니다. 이를 통해 장착 매체는 최적의 반사 지수에 도달 할 수 있으며 이는 초해상도 이미징에 매우 중요합니다. 그렇게하지 않으면 이미지 품질에 영향을 미칩니다. 또한, 제조된 슬라이드는 형광이 급냉되기 전에 4°C에서 최대 1개월 동안 저장될 수 있다. 제공된 프로토콜 이외에, 난소 해부 및 염색53,54,55에 대해 몇몇 다른 프로토콜이 이용가능하다.
적절한 획득 및 처리 파라미터의 사용은 최적의 이미징과 공초점 및 초분해능 이미징을 사용하여 BM 단백질의 국소화를 평가하는 데 매우 중요합니다.
앞서 설명한 바와 같이, 시편의 최적 이미지를 얻기 위해 공초점 및 초해상도 이미징을 위한 획득 파라미터를 적절히 설정하는 것이 중요합니다. 이미지 수집을 위해서는 줌 기능을 사용하여 ROI를 신중하게 선택한 다음 프레임 크기와 획득 속도를 최적으로 설정해야 합니다. 더욱이, 도 2에 예시된 바와 같이, 검출기를 포화시키지 않고 세포 내 밀매를 시각화하기 위해 레이저 전력 및 검출기 이득을 적절하게 조정하는 것이 중요하다. 이러한 매개 변수는 노출 부족 또는 과다 노출 이미지를 방지하기 위해 매우 신중하게 설정해야 합니다(그림 2). 노출 부족 이미지는 저해상도 이미지를 초래하며, 세포 내 구조는 시각화 및 특성화하기가 어려울 것입니다 (그림 2B). 검출기의 채도로 인한 과다 노출 이미지는 데이터 오해 및 공동 현지화 아티팩트로 이어집니다(그림 2C). 목적이 내인성 태깅된 BM 단백질의 수포성 국소화를 결정하는 것이라면, 기저 BM 내의 GFP 태깅 단백질(예를 들어, Vkg-GFP 및 Pcan-GFP)로부터의 형광은 검출기를 신속하게 포화시킨다. 그러나, GFP 태깅된 BM 단백질을 덜 함유하는 소포는 희미하게 보일 것이다. 따라서, BM 상이 아닌 BM 함유 세포내 구조(예를 들어, 소포)를 사용하여 이미지 감도를 설정하는 것이 중요하다(도 2). 핀홀 크기를 선택하는 것도 매우 중요합니다. 이상적으로는 각 채널에 대해 1 AU의 핀홀 크기를 선택하여 최고 품질의 이미지를 얻을 수 있으며, 특히 z축의 해상도가 중요한 경우 더욱 그렇습니다. 핀홀 크기가 작을수록 더 얇은 광학 섹션에 적합합니다. 그러나 최적의 z축 분해능이 필요하지 않거나 z-스택이 캡처되지 않는 경우 핀홀 크기를 늘려 광표백을 방지할 수 있습니다. 또한, 매우 희미한 신호의 경우, 핀홀 크기를 늘리면 신호 대 잡음비가 높아지고 더 많은 광자를 캡처하여 데이터 해석에 도움이 될 수 있습니다.
초해상도 이미징의 경우 그림 3과 같이 제대로 해결되지 않은 과소 또는 과도하게 처리된 이미지가 생성되지 않도록 디컨볼루션 처리에 특히 주의를 기울여야 합니다. 마지막으로, 최적의 3D 재구성을 달성하려면 소프트웨어에 의해 결정된 최적의 간격을 설정하는 것이 좋습니다. z-섹션 사이의 간격이 너무 크면(즉, 0.5μm보다 높음) 3D 렌더링이 불량해지고 표현형의 후속 분석에 영향을 미칩니다.
BM 세포 내 밀매를 이미징 할 때 전통적인 공초점 현미경 검사보다 초해상도의 이점
결과 섹션에 예시된 바와 같이, BM 단백질의 국소화 및 분포는 공초점 이미징을 사용하여 정확하게 평가될 수 있지만, 설명된 초분해능 접근법은 BM 단백질을 포함하는 세포내 구조의 분해능이 크게 증가하고, 향상된 신호-대-잡음비와 함께 보다 정밀한 이미징 데이터를 생성한다. 또한,이 초해상도 현미경 기술은 비교적 사용하기 쉽습니다. 초분해능 이미징은 공초점 현미경에 비해 해상도를 크게 증가시키기 때문에, x- 및 y축에서는 최대 120nm, z축에서는 350nm까지, 이 접근법은 FC와 같은 상피 세포에서 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 보다 정확하게 특성화함으로써 BM의 편광 증착에 대한 우리의 이해에 큰 영향을 미칠 것이다.
더욱이, 또 다른 초분해능 이미징 접근법(Structured Illumination Microscopy, SIM) 및 포인트-스캐닝 공초점 현미경을 위해 설계된 디컨볼루션 알고리즘(즉, 니콘의 향상된 분해능 소프트웨어 모듈)의 사용은 BM 증착(29)에 관여하는 인자들의 역할을 특성화하기 위해 이전에 사용되어 왔다. 이러한 기술과 관련된 증가 된 해상도는 BM 단백질의 세포 내 밀매와 BM의 조직에 대한 우리의 이해에 대한 핵심 통찰력을 제공했습니다. 그러나 이러한 접근법은 Airyscan 현미경 검사에 비해 몇 가지 제한 사항을 제시합니다. 예를 들어, SIM은 조직 깊숙한 곳에서 광학 z-섹션을 얻을 때 최적의 이미지를 얻는 데 매우 효율적이지 않습니다. 이로 인해 BM 증착과 관련된 새로운 구성 요소를 스크리닝 할 때 SIM을 사용하기가 어렵습니다. 또한, 공초점 이미지에 적용된 디컨볼루션 알고리즘의 사용은 동일한 수준의 초해상도를 달성하지 못한다. 전반적으로, 고정 조직에 대한 Airyscan 초해상도 이미징은 BM 세포 내 밀매 및 침착을 연구하는 강력하고 우수한 접근 방식입니다.
그러나 다른 초해상도 현미경 검사와 마찬가지로 몇 가지 불편 함이이 접근법과 관련이 있으며 이미징하는 동안 고려해야합니다. 첫째, 초분해능 모드는 일반적으로 공초점 모드보다 샘플의 더 긴 수집 시간을 필요로 합니다. 따라서, 획득 파라미터 및 관심 영역은 샘플의 광표백을 최소화하기 위해 신중하게 설정되어야 한다. 또한, 초해상도 현미경에 의해 생성된 이미지 파일은 공초점 현미경에 의해 생성된 파일보다 훨씬 크며, 이미지 처리 및 저장을 위해 특수 컴퓨터나 서버가 필요할 수 있습니다.
마지막으로, 초파리 난생 동안 BM 단백질의 라이브 이미징은 BM 극성57에 관여하는 새로운 인자를 특성화하는데 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 접근법은 특히 BM 단백질 밀매 동안 세포내 구조의 분해능에 한계가 있다. 초분해능 현미경 검사는 BM 단백질의 편광 침착에서 확인된 인자의 역할을 정확하게 결정하기 위해 라이브 이미징과 함께 사용하는 강력한 접근 방식입니다.
이 방법의 다른 응용 프로그램은 내인성 태깅 단백질 및 초분해능 이미징을 사용하여 수포 밀매에 전념하는 세포 내 구성 요소의 국소화를 연구합니다.
발달 중 및 성인 유기체에서 조직과 기관의 확립 및 유지는 부분적으로 세포 간 신호 전달과 세포 긴장 및 부착에 의존합니다. 이러한 과정은 세포내 인신매매, 엔도사이토시스, 엑소사이토시스 및 특정 단백질의 분비에 의존한다. 따라서, 내인성 태깅된 단백질 및 공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 BM의 세포내 트래피킹을 해독하기 위해 본원에 기재된 방법은 각각의 과정을 연구하는데 용이하게 적응될 수 있었다. 또한, 내인성 태깅 단백질을 생성하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집을 쉽게 사용할 수 있기 때문에 이 접근법은 더욱 다재다능하고 강력한58이 된다.
결론적으로, 우리는 공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 초파리 난소의 FE에서 BM 단백질의 제조 및 이미징 방법을 설명했습니다. 이러한 프로토콜은 BM 단백질의 적절한 배치에 전념하는 새로운 성분을 확인하기 위해 고처리량 스크리닝에 적용될 수 있다. 마지막으로,이 방법론의 고용은 상피 세포가 상피 구조의 확립 및 유지의 핵심 과정 인 BM 단백질의 양극화 된 분비를 어떻게 조절하는지에 대한 우리의 이해에 상당한 기여를 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 줄리 머클 (Julie Merkle)이 원고에 대한 도움이되는 의견에 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R15GM137236에 의해 O.D.에 지원되었습니다. 공초점 및 초해상도 이미지는 NSF MRI 보조금 2018748로 구입 한 Airyscan 2와 함께 Zeiss LSM 900을 사용하여 획득했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
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