Summary

بروتوكول فحص حفرة بسيط لتصور وقياس امتصاص الخلايا العظمية في المختبر

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

هنا ، نقدم إجراء فحص بسيط وفعال لاختبارات حفرة الارتشاف باستخدام ألواح زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم.

Abstract

الخلايا العظمية الناضجة هي خلايا متعددة النوى يمكنها تحلل العظام من خلال إفراز الأحماض والإنزيمات. وهي تلعب دورا حاسما في الأمراض المختلفة (مثل هشاشة العظام وسرطان العظام) وبالتالي فهي أشياء مهمة للبحث. في المختبر ، يمكن تحليل نشاطهم عن طريق تشكيل حفر ارتشاف. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة بسيطة لفحص الحفرة باستخدام ألواح زراعة الخلايا المطلية بفوسفات الكالسيوم (CaP) ، والتي يمكن تصورها وتحديدها كميا بسهولة. تم استزراع سلائف Osteoclast المشتقة من خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) على الألواح المطلية في وجود محفزات عظمية المنشأ. بعد 9 أيام من الحضانة ، تم تثبيت الخلايا الآكلة العظمية وتلوينها للتصوير الفلوري بينما تم تلطيخ طلاء CaP بواسطة الكالسيين. لتحديد حجم المنطقة التي تم امتصاصها ، تم تلطيخ طلاء CaP على الألواح بنسبة 5٪ AgNO3 وتم تصوره بواسطة التصوير الساطع. تم قياس مساحة حفرة الارتشاف كميا باستخدام ImageJ.

Introduction

الخلايا العظمية (OCs) هي بلاعم خاصة بالأنسجة مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتلعب دورا محوريا في إعادة تشكيل العظام مع الخلايا العظمية1. ترجع اضطرابات العظام الخبيثة والمناعية والخبيثة التي تدمر العظام بشكل منهجي أو محلي إلى النشاط العظمي الزائد ، بما في ذلك هشاشة العظام المرتبطة بانقطاع الطمث2 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي3 ، وأمراض اللثة4 ، ومرض العظام النقوي5 ، وورم العظام العظمي6. في المقابل ، يمكن أن تسبب العيوب في تكوين OC ووظيفته أيضا هشاشة العظام7. تخضع HSCs للتمايز إلى أسلاف OC تحت تحفيز عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF ، رمز الجين ACP5). في وجود كل من M-CSF ومنشط مستقبلات رباط NF-κB (RANKL ، رمز الجين TNFSF11) ، يفرق أسلاف OC بشكل أكبر في OCs أحادية النواة ثم يندمجون لاحقا ليصبحوا OCs متعددة النوى 8,9,10. كل من السيتوكينات M-CSF و RANKL لا غنى عنهما وكافيان لتحريض علامات العظم مثل مستقبلات الكالسيتونين (CT) ، منشط مستقبلات العامل النووي κ B (RANK) ، مضخة البروتون V-ATPase ، الوحدة الفرعية لقناة الكلوريد 7 ألفا (CIC-7) ، integrin β3 ، فوسفاتيز حمض التطرطرات المقاوم للطرطرات (TRAP ، رمز الجين ACP5) ، كاسيبسين البروتياز البروتيني الليزوسومي K (CTSK) ، ومصفوفة metallopeptidase 9 (MMP9). تشكل OCs المنشطة منطقة مانعة للتسرب على سطح العظام من خلال تكوين حلقة أكتين ذات حدود كشكش11,12. داخل منطقة الختم ، تتوسط OCs في الارتشاف من خلال إفراز البروتونات عبر مضخة البروتون V-ATPase12,13 و MMP9 14 و CTSK15 ، مما يؤدي إلى تكوين الثغرات.

بالنسبة للتجارب المخبرية ، يمكن الحصول على أسلاف OC عن طريق توسيع البلاعم في نخاع العظم من عظم الفخذ والساق 16,17 ، وكذلك عن طريق عزل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) من عينات الدم والمعاطف الباهتة18,19,20 ، أو عن طريق تمايز الخلايا الوحيدة المخلدة في الفئران RAW 264.7 21,22.

في هذا البروتوكول ، نصف اختبار ارتشاف العظام في لوحات زراعة الخلايا المطلية ب CaP باستخدام OCs المشتقة من PBMCs الأولية. تم اعتماد طريقة لوحات زراعة الخلايا المطلية CaP المستخدمة هنا وصقلها من الطريقة التي وصفها سابقا Patntirapong et al.17 و Maria et al.21. للحصول على سلائف OC ، يتم عزل PBMCs بواسطة الطرد المركزي المتدرج للكثافة وتوسيعها كما هو موضح سابقا20.

Protocol

تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (رقم الموافقة 287/2020B02). 1. إعداد لوحات زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم تحضير محلول مخزون الكالسيوم (25 mM CaCl 2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl 2·6H 2 O in Tris buffer) قم بإعداد مخزن م?…

Representative Results

تم تنفيذ طلاء فوسفات الكالسيوم في الجزء السفلي من ألواح زراعة الخلايا في خطوتين للطلاء تتضمنان تكلس مسبق لمدة 3 أيام وخطوة تكلس لمدة 1 يوم. كما هو موضح في الشكل 1 ، تم الحصول على فوسفات الكالسيوم الموزع بشكل موحد في الجزء السفلي من لوحات البئر 96. التزم الطلاء جيدا بالقاع بعد خ…

Discussion

هنا نصف طريقة بسيطة وموثوقة لفحص ارتشاف العظام باستخدام OCs المشتقة والموسعة في المختبر من PBMCs. يمكن تحضير لوحات زراعة الخلايا المغلفة ب CaP المستخدمة بسهولة وتصورها باستخدام المواد المتاحة في المختبر. بالإضافة إلى PBMCs غير المصنفة المعتمدة في هذا البروتوكول ، تم أيضا استزراع OCs المتولدة…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني [CSC No. 201808440394]. تم تمويل W.C. من قبل CSC.

Materials

AgNO3 SERVA Electrophoresis GmbH 35110 Silver nitrate
a-MEM Gibco 32561-029 MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin B Biochrom 03-028-1B Amphotericin B Solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21097-50G Calcium chloride Dihydrate
Calcein Sigma-Aldrich C0875 Calcein
FBS Sigma-Aldrich F7524 fetal bovine serum
Ficoll Cytiva 17144002 Ficoll Paque Plus
Fixation buffer Biolegend 420801 Paraformaldehyde
HCl Merk 1.09057.1000 Hydrochloric acid
Hoechst 33342 Promokine PK-CA707-40046 Hoechst 33342
M-CSF PeproTech 300-25 Recombinant Human M-CSF
MgCl2 Sigma-Aldrich 7791-18-6 Magnesium chloride
Na2HPO4 AppliChem GmbH A2943,0250 di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaCl Merk S7653-250G Sodium chloride
NaHCO3 Merk K15322429 Bicarbonate of Soda
PBS Lonza 17-512F Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-Strep Lonza DE17-602E Penicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546 Invitrogen A22283 Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKL PeproTech 310-01 Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
Tris Sigma-Aldrich 93362 Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE Express Gibco 12605010 Recombinant cell-dissociation enzymes

References

  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
  3. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  4. Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
  5. Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
  6. Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
  7. Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
  8. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
  9. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
  10. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  11. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  12. Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
  13. Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
  14. Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
  15. Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  16. Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
  17. Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
  18. Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
  19. Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
  20. Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
  21. Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
  22. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  23. Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
  24. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  25. Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
  26. Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).
check_url/64016?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Cen, W., Reinert, S., Avci-Adali, M., Alexander, D., Umrath, F. A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro. J. Vis. Exp. (184), e64016, doi:10.3791/64016 (2022).

View Video