هنا ، نقدم إجراء فحص بسيط وفعال لاختبارات حفرة الارتشاف باستخدام ألواح زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم.
الخلايا العظمية الناضجة هي خلايا متعددة النوى يمكنها تحلل العظام من خلال إفراز الأحماض والإنزيمات. وهي تلعب دورا حاسما في الأمراض المختلفة (مثل هشاشة العظام وسرطان العظام) وبالتالي فهي أشياء مهمة للبحث. في المختبر ، يمكن تحليل نشاطهم عن طريق تشكيل حفر ارتشاف. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة بسيطة لفحص الحفرة باستخدام ألواح زراعة الخلايا المطلية بفوسفات الكالسيوم (CaP) ، والتي يمكن تصورها وتحديدها كميا بسهولة. تم استزراع سلائف Osteoclast المشتقة من خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) على الألواح المطلية في وجود محفزات عظمية المنشأ. بعد 9 أيام من الحضانة ، تم تثبيت الخلايا الآكلة العظمية وتلوينها للتصوير الفلوري بينما تم تلطيخ طلاء CaP بواسطة الكالسيين. لتحديد حجم المنطقة التي تم امتصاصها ، تم تلطيخ طلاء CaP على الألواح بنسبة 5٪ AgNO3 وتم تصوره بواسطة التصوير الساطع. تم قياس مساحة حفرة الارتشاف كميا باستخدام ImageJ.
الخلايا العظمية (OCs) هي بلاعم خاصة بالأنسجة مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتلعب دورا محوريا في إعادة تشكيل العظام مع الخلايا العظمية1. ترجع اضطرابات العظام الخبيثة والمناعية والخبيثة التي تدمر العظام بشكل منهجي أو محلي إلى النشاط العظمي الزائد ، بما في ذلك هشاشة العظام المرتبطة بانقطاع الطمث2 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي3 ، وأمراض اللثة4 ، ومرض العظام النقوي5 ، وورم العظام العظمي6. في المقابل ، يمكن أن تسبب العيوب في تكوين OC ووظيفته أيضا هشاشة العظام7. تخضع HSCs للتمايز إلى أسلاف OC تحت تحفيز عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF ، رمز الجين ACP5). في وجود كل من M-CSF ومنشط مستقبلات رباط NF-κB (RANKL ، رمز الجين TNFSF11) ، يفرق أسلاف OC بشكل أكبر في OCs أحادية النواة ثم يندمجون لاحقا ليصبحوا OCs متعددة النوى 8,9,10. كل من السيتوكينات M-CSF و RANKL لا غنى عنهما وكافيان لتحريض علامات العظم مثل مستقبلات الكالسيتونين (CT) ، منشط مستقبلات العامل النووي κ B (RANK) ، مضخة البروتون V-ATPase ، الوحدة الفرعية لقناة الكلوريد 7 ألفا (CIC-7) ، integrin β3 ، فوسفاتيز حمض التطرطرات المقاوم للطرطرات (TRAP ، رمز الجين ACP5) ، كاسيبسين البروتياز البروتيني الليزوسومي K (CTSK) ، ومصفوفة metallopeptidase 9 (MMP9). تشكل OCs المنشطة منطقة مانعة للتسرب على سطح العظام من خلال تكوين حلقة أكتين ذات حدود كشكش11,12. داخل منطقة الختم ، تتوسط OCs في الارتشاف من خلال إفراز البروتونات عبر مضخة البروتون V-ATPase12,13 و MMP9 14 و CTSK15 ، مما يؤدي إلى تكوين الثغرات.
بالنسبة للتجارب المخبرية ، يمكن الحصول على أسلاف OC عن طريق توسيع البلاعم في نخاع العظم من عظم الفخذ والساق 16,17 ، وكذلك عن طريق عزل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) من عينات الدم والمعاطف الباهتة18,19,20 ، أو عن طريق تمايز الخلايا الوحيدة المخلدة في الفئران RAW 264.7 21,22.
في هذا البروتوكول ، نصف اختبار ارتشاف العظام في لوحات زراعة الخلايا المطلية ب CaP باستخدام OCs المشتقة من PBMCs الأولية. تم اعتماد طريقة لوحات زراعة الخلايا المطلية CaP المستخدمة هنا وصقلها من الطريقة التي وصفها سابقا Patntirapong et al.17 و Maria et al.21. للحصول على سلائف OC ، يتم عزل PBMCs بواسطة الطرد المركزي المتدرج للكثافة وتوسيعها كما هو موضح سابقا20.
هنا نصف طريقة بسيطة وموثوقة لفحص ارتشاف العظام باستخدام OCs المشتقة والموسعة في المختبر من PBMCs. يمكن تحضير لوحات زراعة الخلايا المغلفة ب CaP المستخدمة بسهولة وتصورها باستخدام المواد المتاحة في المختبر. بالإضافة إلى PBMCs غير المصنفة المعتمدة في هذا البروتوكول ، تم أيضا استزراع OCs المتولدة…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني [CSC No. 201808440394]. تم تمويل W.C. من قبل CSC.
AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |