Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve testprocedure voor resorptieputtests met behulp van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten.
Volwassen osteoclasten zijn multinucleaire cellen die bot kunnen afbreken door de afscheiding van zuren en enzymen. Ze spelen een cruciale rol bij verschillende ziekten (bijv. Osteoporose en botkanker) en zijn daarom belangrijke onderzoeksobjecten. In vitro kan hun activiteit worden geanalyseerd door de vorming van resorptieputten. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige pit assay methode met behulp van calciumfosfaat (CaP) gecoate celkweekplaten, die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Osteoclastenprecursoren afgeleid van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC’s) werden gekweekt op de gecoate platen in aanwezigheid van osteoclastogene stimuli. Na 9 dagen incubatie werden osteoclasten gefixeerd en gekleurd voor fluorescentiebeeldvorming, terwijl de CaP-coating werd tegengekleurd door calceïne. Om het geresorbeerde gebied te kwantificeren, werd de CaP-coating op platen gekleurd met 5% AgNO3 en gevisualiseerd door brightfield-beeldvorming. Het resorptieputgebied werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ.
Osteoclasten (OC’s) zijn weefselspecifieke macrofagen afgeleid van hematopoëtische stamcellen (HSC’s), die een cruciale rol spelen bij botremodellering samen met osteoblasten1. Door geslachtshormonen geïnduceerde, immunologische en kwaadaardige botaandoeningen die bot systemisch of lokaal vernietigen, zijn te wijten aan overmatige osteoclastische activiteit, waaronder menopauze-gerelateerde osteoporose2, reumatoïde artritis3, parodontitis4, myeloom botziekte5 en osteolytische botmetastase6. Daarentegen kunnen defecten in OC-vorming en -functie ook osteopetrose veroorzaken7. HSC’s ondergaan differentiatie in OC-voorlopercellen onder macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF, gensymbool ACP5) stimulatie. In aanwezigheid van zowel M-CSF als receptoractivator van NF-κB ligand (RANKL, gensymbool TNFSF11) differentiëren OC-voorlopers verder in mononucleaire OC’s en fuseren vervolgens tot multinucleaire OC’s 8,9,10. Zowel cytokines M-CSF als RANKL zijn onmisbaar en voldoende voor inductie van osteoclastische markers zoals calcitoninereceptor (CT), receptoractivator van nucleaire factor κ B (RANK), protonpomp V-ATPase, chloridekanaal 7 alfa-subeenheid (CIC-7), integrine β3, tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP, gensymbool ACP5), lysosomale cysteïneproteasekatheline K (CTSK) en matrixmetaalepteptidase 9 (MMP9). Geactiveerde OC’s vormen een afdichtingszone op het botoppervlak door de vorming van een actinering met een gegolfde rand11,12. Binnen de afdichtingszone bemiddelen OC’s resorptie door protonen af te scheiden via de protonpomp V-ATPase12,13, MMP914 en CTSK15, wat leidt tot de vorming van lacunes.
Voor in vitro experimenten kunnen OC-voorlopercellen worden verkregen door uitbreiding van beenmergmacrofagen uit het dijbeen en scheenbeen van muizen16,17, evenals door isolatie van menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) uit bloedmonsters en buffy coats 18,19,20, of door differentiatie van de vereeuwigde muriene monocytische cellen RAW 264.7 21,22.
In het huidige protocol beschrijven we een osteoclastische resorptietest in CaP-gecoate celkweekplaten met behulp van OC’s afgeleid van primaire PBMC’s. De CaP-gecoate celkweekplatenmethode die hier wordt gebruikt, is overgenomen en verfijnd van de methode die eerder is beschreven door Patntirapong et al.17 en Maria et al.21. Om OC-precursoren te verkrijgen, worden PBMC’s geïsoleerd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie en uitgebreid zoals eerder beschreven20.
Hier beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode voor een osteoclastische resorptietest met behulp van OC’s afgeleid en uitgebreid in vitro van PBMC’s. De gebruikte CaP-gecoate celkweekplaten kunnen eenvoudig worden voorbereid en gevisualiseerd met behulp van in het laboratorium beschikbare materialen. Naast ongesorteerde PBMC’s die in dit protocol zijn aangenomen, zijn OC’s gegenereerd uit muizenmonocytencellen21 en beenmergmacrofaagcellen17 ook gekweekt …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de China Scholarship Council [CSC Nr. 201808440394]. W.C. werd gefinancierd door CSC.
AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |