Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren
Summary
Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve testprocedure voor resorptieputtests met behulp van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten.
Abstract
Volwassen osteoclasten zijn multinucleaire cellen die bot kunnen afbreken door de afscheiding van zuren en enzymen. Ze spelen een cruciale rol bij verschillende ziekten (bijv. Osteoporose en botkanker) en zijn daarom belangrijke onderzoeksobjecten. In vitro kan hun activiteit worden geanalyseerd door de vorming van resorptieputten. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige pit assay methode met behulp van calciumfosfaat (CaP) gecoate celkweekplaten, die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Osteoclastenprecursoren afgeleid van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC’s) werden gekweekt op de gecoate platen in aanwezigheid van osteoclastogene stimuli. Na 9 dagen incubatie werden osteoclasten gefixeerd en gekleurd voor fluorescentiebeeldvorming, terwijl de CaP-coating werd tegengekleurd door calceïne. Om het geresorbeerde gebied te kwantificeren, werd de CaP-coating op platen gekleurd met 5% AgNO3 en gevisualiseerd door brightfield-beeldvorming. Het resorptieputgebied werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ.
Introduction
Osteoclasten (OC’s) zijn weefselspecifieke macrofagen afgeleid van hematopoëtische stamcellen (HSC’s), die een cruciale rol spelen bij botremodellering samen met osteoblasten1. Door geslachtshormonen geïnduceerde, immunologische en kwaadaardige botaandoeningen die bot systemisch of lokaal vernietigen, zijn te wijten aan overmatige osteoclastische activiteit, waaronder menopauze-gerelateerde osteoporose2, reumatoïde artritis3, parodontitis4, myeloom botziekte5 en osteolytische botmetastase6. Daarentegen kunnen defecten in OC-vorming en -functie ook osteopetrose veroorzaken7. HSC’s ondergaan differentiatie in OC-voorlopercellen onder macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF, gensymbool ACP5) stimulatie. In aanwezigheid van zowel M-CSF als receptoractivator van NF-κB ligand (RANKL, gensymbool TNFSF11) differentiëren OC-voorlopers verder in mononucleaire OC’s en fuseren vervolgens tot multinucleaire OC’s 8,9,10. Zowel cytokines M-CSF als RANKL zijn onmisbaar en voldoende voor inductie van osteoclastische markers zoals calcitoninereceptor (CT), receptoractivator van nucleaire factor κ B (RANK), protonpomp V-ATPase, chloridekanaal 7 alfa-subeenheid (CIC-7), integrine β3, tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP, gensymbool ACP5), lysosomale cysteïneproteasekatheline K (CTSK) en matrixmetaalepteptidase 9 (MMP9). Geactiveerde OC’s vormen een afdichtingszone op het botoppervlak door de vorming van een actinering met een gegolfde rand11,12. Binnen de afdichtingszone bemiddelen OC’s resorptie door protonen af te scheiden via de protonpomp V-ATPase12,13, MMP914 en CTSK15, wat leidt tot de vorming van lacunes.
Voor in vitro experimenten kunnen OC-voorlopercellen worden verkregen door uitbreiding van beenmergmacrofagen uit het dijbeen en scheenbeen van muizen16,17, evenals door isolatie van menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) uit bloedmonsters en buffy coats 18,19,20, of door differentiatie van de vereeuwigde muriene monocytische cellen RAW 264.7 21,22.
In het huidige protocol beschrijven we een osteoclastische resorptietest in CaP-gecoate celkweekplaten met behulp van OC’s afgeleid van primaire PBMC’s. De CaP-gecoate celkweekplatenmethode die hier wordt gebruikt, is overgenomen en verfijnd van de methode die eerder is beschreven door Patntirapong et al.17 en Maria et al.21. Om OC-precursoren te verkrijgen, worden PBMC’s geïsoleerd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie en uitgebreid zoals eerder beschreven20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode voor een osteoclastische resorptietest met behulp van OC’s afgeleid en uitgebreid in vitro van PBMC’s. De gebruikte CaP-gecoate celkweekplaten kunnen eenvoudig worden voorbereid en gevisualiseerd met behulp van in het laboratorium beschikbare materialen. Naast ongesorteerde PBMC’s die in dit protocol zijn aangenomen, zijn OC’s gegenereerd uit muizenmonocytencellen21 en beenmergmacrofaagcellen17 ook gekweekt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de China Scholarship Council [CSC Nr. 201808440394]. W.C. werd gefinancierd door CSC.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
References
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
- Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
- Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
- Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
- Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
- Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
- Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
- Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
- Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
- Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
- Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
- Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
- Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
- Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
- Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
- Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
- Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).
