Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro
Summary
Aquí, presentamos un procedimiento de ensayo simple y efectivo para ensayos de fosas de reabsorción utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio.
Abstract
Los osteoclastos maduros son células multinucleadas que pueden degradar el hueso a través de la secreción de ácidos y enzimas. Desempeñan un papel crucial en diversas enfermedades (por ejemplo, osteoporosis y cáncer de hueso) y, por lo tanto, son importantes objetos de investigación. In vitro, su actividad puede ser analizada por la formación de pozos de reabsorción. En este protocolo, describimos un método simple de ensayo de fosa utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio (CaP), que se pueden visualizar y cuantificar fácilmente. Los precursores de osteoclastos derivados de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se cultivaron en las placas recubiertas en presencia de estímulos osteoclastogénicos. Después de 9 días de incubación, los osteoclastos se fijaron y teñeron para obtener imágenes de fluorescencia, mientras que el recubrimiento de CaP se contrateñió con calceína. Para cuantificar el área reabsorbida, el recubrimiento de CaP en las placas se tiñó con 5% de AgNO3 y se visualizó mediante imágenes de campo brillante. El área del pozo de reabsorción se cuantificó utilizando ImageJ.
Introduction
Los osteoclastos (AO) son macrófagos específicos del tejido derivados de células madre hematopoyéticas (HSC), que desempeñan un papel fundamental en la remodelación ósea junto con los osteoblastos1. Los trastornos óseos inducidos por hormonas sexuales, inmunológicos y malignos que destruyen el hueso sistémica o localmente se deben al exceso de actividad osteoclástica, incluida la osteoporosis relacionada con la menopausia2, la artritis reumatoide3, la enfermedad periodontal4, la enfermedad ósea mieloma5 y la metástasis ósea osteolítica6. Por el contrario, los defectos en la formación y función de LA OC también pueden causar osteopetrosis7. Las HSC se diferencian en progenitores de OC bajo la estimulación del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, símbolo genético ACP5). En presencia tanto de M-CSF como del activador del receptor del ligando NF-κB (RANKL, símbolo del gen TNFSF11), los progenitores de OC se diferencian aún más en AO mononucleares y posteriormente se fusionan para convertirse en AO multinucleados 8,9,10. Ambas citoquinas M-CSF y RANKL son indispensables y suficientes para la inducción de marcadores osteoclásticos como el receptor de calcitonina (CT), el activador del receptor del factor nuclear κ B (RANK), la bomba de protones V-ATPasa, la subunidad alfa del canal de cloruro 7 (CIC-7), la integrina β3, la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP, símbolo de gen ACP5), la cisteína lisosomal proteasa catepsina K (CTSK) y la metalopeptidasa de matriz 9 (MMP9). Los AO activados forman una zona de sellado en la superficie ósea a través de la formación de un anillo de actina con un borde erizado11,12. Dentro de la zona de sellado, los AO median la reabsorción a través de la secreción de protones a través de la bomba de protones V-ATPasa 12,13, MMP914 y CTSK15, lo que lleva a la formación de lagunas.
Para experimentos in vitro, los progenitores de OC se pueden obtener mediante la expansión de macrófagos de médula ósea del fémur y la tibia de ratones 16,17, así como mediante el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de muestras de sangre y capas buffy 18,19,20, o por diferenciación de las células monocíticas murinas inmortalizadas RAW 264.7 21,22.
En el presente protocolo, describimos un ensayo de reabsorción osteoclástica en placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizando AO derivados de PBMC primarios. El método de placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizado aquí se adopta y refina a partir del método descrito anteriormente por Patntirapong et al.17 y Maria et al.21. Para obtener precursores de OC, los PBMC se aíslan por centrifugación por gradiente de densidad y se expanden como se describió anteriormente20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un método simple y confiable para un ensayo de reabsorción osteoclástica utilizando AO derivados y expandidos in vitro de PBMC. Las placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizadas se pueden preparar y visualizar fácilmente utilizando materiales disponibles en el laboratorio. Además de los PBMC no clasificados adoptados en este protocolo, los AO generados a partir de células monocíticas murinas21 y células macrófagos de médula ósea17</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue parcialmente financiado por el Consejo de Becas de China [CSC No. 201808440394]. W.C. fue financiado por CSC.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
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