Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro
Summary
Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.
Abstract
Os osteoclasstos maduros são células multinucleadas que podem degradar o osso através da secreção de ácidos e enzimas. Eles desempenham um papel crucial em várias doenças (por exemplo, osteoporose e câncer ósseo) e, portanto, são objetos importantes de pesquisa. In vitro, sua atividade pode ser analisada pela formação de poços de resorção. Neste protocolo, descrevemos um método simples de ensaio de poços usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio (CaP), que podem ser facilmente visualizadas e quantificadas. Precursores osteoclastas derivados de células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) foram cultivados nas placas revestidas na presença de estímulos osteoclastogênicos. Após 9 dias de incubação, os osteoclastas foram fixadas e manchadas para imagens de fluorescência, enquanto o revestimento cap foi contra-manchado por calcein. Para quantificar a área resorbedada, o revestimento cap em placas foi manchado com 5% AgNO3 e visualizado por imagens de campo brilhante. A área do poço de resorção foi quantificada por meio do ImageJ.
Introduction
Os osteoclalts (OCs) são macrófagos específicos do tecido derivados de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), desempenhando um papel fundamental na remodelagem óssea juntamente com os osteoblastos1. Distúrbios ósseos induzidos por hormônios sexuais, imunológicos e malignos que destroem osso sisticamente ou localmente são devido ao excesso de atividade osteoclástica, incluindo osteoporose relacionada à menopausa2, artrite reumatoide3, doença periodontal4, doença óssea de mieloma5 e metástaseóssea osteolítica 6. Em contraste, defeitos na formação e função de OC também podem causar osteopetrose7. Os HSCs sofrem diferenciação em progenitores oC sob fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF, símbolo genético ACP5). Na presença tanto do M-CSF quanto do ativador receptor de ligante NF-κB (RANKL, símbolo genético TNFSF11), os progenitores OC se diferenciam ainda mais em OCs mononucleares e, posteriormente, fundem-se para se tornarem OCs multinucleados 8,9,10. Ambas as citocinas M-CSF e RANKL são indispensáveis e suficientes para a indução de marcadores osteoclásticos como receptor de calcitonina (TC), ativador receptor do fator nuclear κ B (RANK), bomba de prótons V-ATPase, subunidade alfa do canal 7 cloreto (CIC-7), integrin β3, fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP, símbolo genético ACP5), catarsina de cissinosa lysomal protease K (CTSK) e matriz metallopeptidase 9 (MMP9). Os OCs ativados formam uma zona de vedação na superfície óssea através da formação de um anel de actina com uma borda de babados11,12. Dentro da zona de vedação, os OCs mediam a resorção através de prótons secretando através da bomba de prótons V-ATPase12,13, MMP914 e CTSK15, levando à formação de lacunas.
Para experimentos in vitro, progenitores oC podem ser obtidos pela expansão de macrófagos de medula óssea do fêmur e tíbia16,17, bem como pelo isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) a partir de amostras de sangue e casacos buffy 18,19,20, ou pela diferenciação das células monocíticas murinas imortalizadas RAW 264,7 21,22.
No presente protocolo, descrevemos um ensaio de ressorção osteoclástica em placas de cultura celular revestidas de CaP usando OCs derivados de PBMCs primários. O método de placas de cultura celular revestida de CaP utilizado aqui são adotados e refinados a partir do método descrito anteriormente por Patntirapong et al.17 e Maria et al.21. Para obter precursores de OC, os PBMCs são isolados por centrifugação gradiente de densidade e expandidos como descrito anteriormente20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um método simples e confiável para um ensaio de ressorção osteoclástica usando OCs derivados e expandidos in vitro a partir de PBMCs. As placas de cultura celular revestidas de CaP usadas podem ser facilmente preparadas e visualizadas usando materiais disponíveis em laboratório. Além dos PBMCs não variados adotados neste protocolo, os OCs gerados a partir de células monócíticas murinas21 e células macrófagos de medula óssea17 também…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Conselho de Bolsas da China [CSC No. 201808440394]. W.C. foi financiado pelo CSC.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
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