Nous présentons ici une procédure de dosage simple et efficace pour les essais en fosse de résorption utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium.
Les ostéoclastes matures sont des cellules multinucléées qui peuvent dégrader les os par la sécrétion d’acides et d’enzymes. Ils jouent un rôle crucial dans diverses maladies (p. ex. ostéoporose et cancer des os) et sont donc des objets de recherche importants. In vitro, leur activité peut être analysée par la formation de fosses de résorption. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple de dosage en fosse utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium (CaP), qui peuvent être facilement visualisées et quantifiées. Des précurseurs d’ostéoclastes dérivés de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été cultivés sur les plaques revêtues en présence de stimuli ostéoclastogènes. Après 9 jours d’incubation, les ostéoclastes ont été fixés et colorés pour l’imagerie par fluorescence tandis que le revêtement CaP a été contre-coloré par la calcéine. Pour quantifier la zone résorbée, le revêtement CaP sur les plaques a été coloré avec 5% d’AgNO3 et visualisé par imagerie en champ clair. La zone de la fosse de résorption a été quantifiée à l’aide d’ImageJ.
Les ostéoclastes (OC) sont des macrophages spécifiques aux tissus dérivés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), jouant un rôle central dans le remodelage osseux avec les ostéoblastes1. Les troubles osseux induits par les hormones sexuelles, immunologiques et malins qui détruisent les os de manière systémique ou locale sont dus à une activité ostéoclastique excessive, y compris l’ostéoporose liée à la ménopause2, la polyarthrite rhumatoïde3, la maladie parodontale4, la maladie osseuse myélomateuse5 et les métastases osseuses ostéolytiques6. En revanche, des défauts dans la formation et la fonction du CO peuvent également provoquer une ostéopétrose7. Les CSH subissent une différenciation en progéniteurs OC sous stimulation du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF, symbole du gène ACP5). En présence à la fois de M-CSF et d’activateur de récepteur du ligand NF-κB (RANKL, symbole du gène TNFSF11), les progéniteurs OC se différencient davantage en OC mononucléaires et fusionnent ensuite pour devenirdes OC multinucléés 8,9,10. Les cytokines M-CSF et RANKL sont indispensables et suffisantes pour l’induction de marqueurs ostéoclastiques tels que le récepteur de la calcitonine (CT), l’activateur du récepteur du facteur nucléaire κ B (RANK), la pompe à protons V-ATPase, la sous-unité alpha du canal chlorure 7 (CIC-7), l’intégrine β3, la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP, symbole du gène ACP5), la cystéine protéase lysosomale cathepsine K (CTSK) et la métallopeptidase matricielle 9 (MMP9). Les CO activés forment une zone d’étanchéité à la surface osseuse par la formation d’un anneau d’actine avec une bordure ébouriffée11,12. Dans la zone d’étanchéité, les CO médient la résorption par la sécrétisation de protons via la pompe à protons V-ATPase 12,13, MMP914 et CTSK15, conduisant à la formation de lacunes.
Pour les expériences in vitro, les progéniteurs OC peuvent être obtenus par expansion des macrophages de la moelle osseuse à partir du fémur et du tibiade souris 16,17, ainsi que par isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) à partir d’échantillons de sang et de pelages bouffants 18,19,20, ou par différenciation des cellules monocytaires murines immortalisées RAW 264,7 21,22.
Dans le présent protocole, nous décrivons un test de résorption ostéoclastique dans des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP à l’aide d’OC dérivés de PBMC primaires. La méthode des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisée ici est adoptée et affinée à partir de la méthode décrite précédemment par Patntirapong et al.17 et Maria et al.21. Pour obtenir des précurseurs OC, les PBMC sont isolés par centrifugation par gradient de densité et élargis comme décrit précédemment20.
Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour un test de résorption ostéoclastique utilisant des CO dérivés et développés in vitro à partir de PBMC. Les plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisées peuvent être facilement préparées et visualisées à l’aide de matériaux disponibles en laboratoire. En plus des PBMC non triés adoptés dans ce protocole, les OC générés à partir de cellules monocytaires murines21 et de cellules macrophages de moelle oss…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été partiellement financé par le China Scholarship Council [CSC n° 201808440394]. W.C. a été financé par le SCC.
AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |