פרוטוקול בדיקת בור פשוט להדמיה וכימות של ספיגה אוסטאוקלסטית במבחנה
Summary
כאן אנו מציגים הליך בדיקה פשוט ויעיל לבדיקות בור ספיגה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט.
Abstract
אוסטאוקלסטים בוגרים הם תאים רב-גרעיניים שיכולים לפרק את העצם באמצעות הפרשת חומצות ואנזימים. הם ממלאים תפקיד מכריע במחלות שונות (למשל, אוסטאופורוזיס וסרטן העצמות) ולכן הם מושאי מחקר חשובים. במבחנה, ניתן לנתח את פעילותם על ידי היווצרות של בורות ספיגה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת בדיקת בור פשוטה באמצעות לוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט (CaP), שניתן לדמיין ולכמת בקלות. מבשרי אוסטאוקלסט שמקורם בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMCs) עברו תרבית על הלוחות המצופים בנוכחות גירויים אוסטאוקלסטוגניים. לאחר 9 ימי דגירה, אוסטאוקלסטים תוקנו והוכתמו לצורך הדמיה פלואורסצנטית בעוד שציפוי CaP הוכתם על ידי קלצין. כדי לכמת את האזור המחודש, ציפוי ה-CaP על הצלחות הוכתם ב-5% AgNO3 והודגם על ידי הדמיית שדה בהיר. אזור בור הספיגה כומת באמצעות ImageJ.
Introduction
אוסטאוקלסטים (OCs) הם מקרופאגים ספציפיים לרקמות שמקורם בתאי גזע המטופויאטיים (HSCs), וממלאים תפקיד מרכזי בשיפוץ העצם יחד עם אוסטאובלסטים1. הפרעות עצם הנגרמות על ידי הורמוני מין, אימונולוגיות וממאירות שהורסות את העצם באופן מערכתי או מקומי נובעות מפעילות אוסטאוקלסטית עודפת, כולל פעילות אוסטאוקלסטית נוספת הקשורה לגיל המעבר2, דלקת מפרקים שגרונית3, מחלת חניכיים4, מחלת עצם מיאלומה5 וגרורות עצם אוסטאוליטיות6. לעומת זאת, פגמים בהיווצרות OC ובתפקוד יכולים גם הם לגרום לאוסטיאופטרוזיס7. HSCs עוברים התמיינות לאבות OC תחת גירוי גורם מגרה מושבה מקרופאגים (M-CSF, סמל הגן ACP5). בנוכחות הן M-CSF והן מפעיל הקולטנים של ליגנד NF-κB (RANKL, סמל הגן TNFSF11), אבות OC מתמיינים עוד יותר ל-OCs חד-גרעיניים ולאחר מכן מתמזגים והופכים ל-OCs מרוביגרעינים 8,9,10. שני הציטוקינים M-CSF ו- RANKL הם הכרחיים ומספיקים להשראת סמנים אוסטאוקלסטיים כגון קולטן קלציטונין (CT), מפעיל קולטן של גורם גרעיני κ B (RANK), משאבת פרוטון V-ATPase, כלוריד ערוץ 7 תת-יחידה אלפא (CIC-7), אינטגרין β3, חומצה פוספטאז חומצה עמידה לטרטרט (TRAP, סמל הגן ACP5), ציסטאין ליזוזומי פרוטאז פרוטאז קתפסין K (CTSK), ומטריצה מטאלופטידז 9 (MMP9). OCs מופעלים יוצרים אזור איטום על פני העצם באמצעות היווצרות של טבעת אקטין עם גבולמקופל 11,12. בתוך אזור האיטום, OCs מתווכים ספיגה באמצעות פרוטונים מפרישים באמצעות משאבת הפרוטונים V-ATPase12,13, MMP914 ו- CTSK15, מה שמוביל להיווצרות לקונה.
עבור ניסויים במבחנה, ניתן להשיג אבות OC על ידי הרחבה של מקרופאגים של מח עצם מעצם הירך והטיביה של עכברים16,17, כמו גם על ידי בידוד של תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם אנושי (PBMCs) מדגימות דם ומצופים באפיים 18,19,20, או על ידי התמיינות של התאים המונוציטיים המורין המונצחים RAW 264.7 21,22.
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים בדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית בלוחות תרבית תאים מצופים CaP באמצעות OCs שמקורם ב-PBMCs ראשוניים. שיטת לוחות תרבית התאים המצופה CaP המשמשת כאן מאומצת ומעודנת מהשיטה שתוארה קודם לכן על ידי Patntirapong et al.17 ו- Maria et al.21. כדי להשיג מבשרי OC, PBMCs מבודדים על ידי צנטריפוגת גרדיאנט צפיפות ומורחבים כפי שתואר קודם לכן20.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה לבדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית באמצעות OCs הנגזרים ומורחבים במבחנה מ- PBMCs. ניתן להכין בקלות את לוחות תרביות התאים המשומשים בציפוי CaP ולדמיין אותם באמצעות חומרים זמינים במעבדה. בנוסף ל-PBMCs לא ממוינים שאומצו בפרוטוקול זה, OCs שנוצרו מתאים מונוציטיים של מורין<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מועצת המלגות של סין [CSC No. 201808440394]. W.C. מומן על ידי CSC.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
References
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
- Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
- Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
- Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
- Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
- Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
- Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
- Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
- Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
- Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
- Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
- Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
- Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
- Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
- Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
- Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
- Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
- Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).
